模塊一 微生物檢驗基礎知識
項目一 微生物檢驗技術緒論
項目引導
微生物檢驗技術是以微生物為研究對象，通過分析檢測微生物種類、數量、性質及產生的安全危害程度，進行產品質量檢驗和判斷的過程。微生物檢驗結果準確與否直接關系到產品質量是否合格和出廠，必須根據產品性質及質量要求，依據國家微生物學檢驗標準選擇合適的檢測方法。微生物檢驗技術廣泛應用于食品、農產品、環境處理、生物制品等領域，以研究微生物的性質、生理功能、代謝產物、微生物腐敗、微生物檢測和發酵生產為主要內容。
想一想
微生物在日常生活中如何發現？
一、微生物的定義
微生物檢驗技術屬微生物學的分支學科之一，它是通過研究細菌、放線菌、真菌、病毒、立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體、原生動物及單細胞藻類等微小生物的形態結構、生理生化特征、代謝方式及產物、遺傳變異等生命活動基本規律及差異，并將其應用于食品檢驗、工業分析、醫學衛生、防腐抗菌、環境監測等領域。
我們把自然界里那些肉眼看不見或看不清楚的、必須借助顯微鏡才能觀察到的微小生物，總稱為微生物。即微生物是一類個體微小、結構簡單、肉眼不可見或看不清楚的必須借助顯微鏡才能觀察的微小生物的統稱。每一類微生物都具有各自特有的形態結構，有的是單細胞結構，有的是簡單的多細胞，有的甚至無細胞結構，它們廣泛存在于自然界中，是地球上最古老的“原住民”之一。
微生物雖然個體微小，但在適宜的環境中生長繁殖迅速。它們在自然界中起著巨大的作用，是引起各類物質循環轉化的原因之一，例如土壤中微生物能分解動植物有機質轉化為無機質，維持地球上的物質循環。
微生物種類繁多，通常包括非細胞生物的病毒、亞病毒（類病毒、擬病毒、朊病毒），原核細胞結構的真細菌、古生菌、藍細菌、支原體、衣原體、立克次氏體，以及真核細胞結構的酵母菌、霉菌等真菌、原生動物和單細胞藻類。
一般來說，微生物都是非常簡單的低等生物。細菌、放線菌、酵母菌、原生動物、藻類等都是單細胞結構，部分霉菌為簡單的多細胞結構，病毒則是由蛋白質外殼和遺傳核心構成的非細胞生物，甚至部分亞病毒是只有一種物質成分構成的非細胞生物。微生物形態、大小和細胞類型見表1-1，微生物類型見圖1-1。
表1-1 微生物形態、大小和細胞類型
圖1-1 微生物類型
二、微生物的特點
個體小、結構簡、進化低，是微生物典型的生物學特征。種類多、數量大、代謝旺、繁殖快等特點，是其他生物所沒有的，并且這些特點的本質都與微生物個體微小、比表面積大有著密切關系。
（一）個體微小，比表面積大
微生物在形態上，個體微小，肉眼看不見，需用顯微鏡觀察，通常大小以微米和納米計量。例如一個球菌直徑平均1μm，桿菌的平均長度為2μm，而一個病毒粒子僅有約20nm。由于微生物個體微小，因此它們的結構也非常簡單，大多數為單細胞結構，少數為簡單多細胞結構，病毒、亞病毒屬于分子生物。如果將1500個桿菌首尾相連，其長度大約為一粒芝麻的長度，將10～100億個細菌的重量加起來大約為1mg。然而，微生物的比表面積卻大得驚人，如果說人的皮膚面積與體積比為1，那么一個大腸桿菌的比表面積將是人的30萬倍，這大大有利于微生物和周圍環境進行物質、能量、信息的交換?！皞€體微小，比表面積大”是微生物諸多特性的前提和物質基礎，其他特性都與該特點密切相關。
（二）生長旺盛，繁殖迅速
微生物具有驚人的生長繁殖能力，在實驗室培養條件下細菌幾十分鐘至幾小時可以繁殖一代。以大腸桿菌為例：大腸桿菌一個細胞重約10-12g，平均20min繁殖一代，1h后繁殖8個，2h繁殖64個，3h繁殖512個，4h繁殖4096個，24h后繁殖72代，約4.7×1021個細菌，重量達到4722t，48h后繁殖約2.2×1043個細菌，重量達到2.2×1025t，相當于4000個地球的重量。由此可見，微生物生長繁殖速度驚人。但因種種條件的限制，這種繁殖速度是不能持久的。盡管如此，微生物這種驚人的繁殖能力在工業發酵生產上應用，短時間內也可獲得大量增殖，收獲較多產物。
（三）吸收力強，代謝多樣
因為微生物個體小，比表面積大，有利于物質交換，因此微生物具有驚人的代謝能力。例如，一頭500kg的食用公牛，24h生產0.5kg蛋白質，而同樣重量的酵母菌，以糖液和氨水為原料，24h可以生產近50000kg優質蛋白質；再如，產朊假絲酵母合成蛋白質的能力是大豆的100倍，乳酸菌每小時能產生自重1000～10000倍的乳酸。微生物營養物質吸收能力是微生物生長繁殖和產生代謝產物的基礎。微生物代謝多樣主要包括代謝類型多、代謝途徑多和代謝產物種類多。
（四）適應性強，容易變異
微生物適應能力極強，有動植物生存的地方微生物能夠生存，人類和動植物不能生存的極端環境微生物同樣能夠生存。微生物的適應能力是高等動植物難以相比的，它們往往具有極強的耐（嗜）熱性、耐（嗜）酸性、耐（嗜）堿性、耐（嗜）鹽性、耐（嗜）壓性、抗輻射等能力。為了適應復雜多變的周圍環境，微生物在長期的進化過程中形成了靈活多樣的代謝調控機制以應對各種環境變化。
微生物個體微小，結構簡單，通常為單倍體，加上繁殖速度快，代時短，數量多，代謝旺盛，又與外界環境直接接觸，即使在極低的自發突變概率（10-8～10-9）下，也可以在短時間內產生大量變異后代，如若再輔以人工誘變（誘變率為10-5～10-6），那么產生變異后代的數目將更加龐大?；蛲蛔兪俏⑸镒畛Ｒ姷淖儺愋问?，主要涉及形態結構、生長代謝、生理生化、代謝產量等遺傳變異。人們利用微生物易變異的特點，進行菌種選育，以獲得高產菌株，有利于提高發酵產品產量和質量并降低生產成本。若因保藏方法和條件不當，造成菌種性能退化，同樣會對發酵生產造成極其不利的影響。
（五）種類繁多，分布廣泛
微生物種類繁多主要指微生物數目和種類多。自然界中的微生種類不計其數，并且不斷有新的物種逐漸被發現。據不完全統計，目前已定種的微生物大約10萬多種，僅占自然界中存在的微生物總數的1%，也就是說還有近990萬種微生物未被發現。一般每克土壤中所含微生物數量高達到幾千萬至幾億個，其中細菌最多，放線菌次之。
微生物在自然界分布極為廣泛，江河湖海、山川平原到處都有微生物的身影。例如，在火山口發現了微生物的蹤跡，在南極冰川3500m以下永凍層找到了微生物生命，在遠離地表數十公里的高空也有微生物發現，在人、動物的體內、體表均有微生物存在，可以說，微生物是無處不在、無時不在。微生物的種類多樣和分布廣闊這一特點，為人類對微生物的開發和利用提供了寶貴豐富的資源。
總之，微生物與人類的關系既是朋友又是敵人，它是一把利弊共存的“雙刃劍”，由于微生物除具有一般生物所共有的特性外，又具有其他生物所沒有的特點。因此，正確利用微生物，實質上就是正確地利用微生物特性為人類更好地服務。
三、微生物檢驗技術研究內容
微生物檢驗技術是專門研究微生物與食品、環境、醫藥等相互關系的一門學科。研究內容涉及與相關微生物的生命活動規律、生理生化特性、形態結構鑒別等內容。針對不同行業和產業，研究微生物的檢測方法、微生物利用和控制、食品藥品的腐敗變質原理并制定相關指標等，為判斷產品衛生質量提供科學的參考。
（一）微生物檢驗與食品工業
微生物腐敗變質不僅對食品生產造成巨大的損失和浪費，同時也嚴重影響人們的身體健康。根據世界衛生組織的估計，全球每年發生食源性疾病的人口超過數十億，平均每年有1/3的人群感染食源性疾病，即使在歐美發達國家，食源性疾病發生的概率也極高。因此不僅要預防和控制微生物的污染，更要求加強對食品中的微生物進行嚴格檢驗，讓消費者吃上放心的食品。食品微生物檢驗意義重大。
微生物作為自然界存在的一種特殊生物群體，與人類食物有著密切的關系。微生物在許多食品生產中起著至關重要的作用，但同時也是導致食品腐敗變質的元兇，因此要正確處理微生物與食品間的關系。
1.微生物與食品生產
人類日常食用的很多食品都是由微生物直接作用或參與實現的。如白酒、黃酒、醬油、食醋等是用淀粉質為原料，經微生物制曲、糖化、發酵等階段釀造而成的；酸乳制品是以鮮乳為原料，經過殺菌作用并接種乳酸菌進行發酵，生產出具有特殊風味的食品；啤酒是以大麥芽為主要原料，大米、酒花等為輔料，經過制麥、糖化、啤酒酵母發酵等工序釀制而成的一種含有二氧化碳和多種營養成分、低酒精度的飲料酒。像這類食品還有很多種，可見微生物在食品生產中發揮了非常大的作用。
2.微生物與食品腐敗
食品在加工前、加工過程中以及加工后，都可能受到外源性和內源性微生物的污染。污染食品的微生物主要有細菌、酵母菌和霉菌以及由它們產生的毒素。污染途徑較多，加工前可以通過土壤、加工用水、環境空氣、操作人員、加工器具、包裝運輸設備、貯藏環境，以及昆蟲、動物等，直接或間接污染食品加工的原料、半成品或成品。加工過程中的清洗、消毒和滅菌過程都又可以使食品中微生物種類和數量顯著下降，甚至完全殺菌。但由于食品的成分組成、理化性狀、加工方式等原因，都會影響加工后食品中的微生物殘留。
微生物引起腐敗變質的條件：
①原料本身營養豐富，如蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和無機鹽等含量豐富，易導致微生物污染和腐敗。
②適宜的理化條件，如溫度、水分活度、pH值、有氧環境等加速微生物生長繁殖。高溫、低溫抑制微生物的生長和代謝速率，減緩微生物引起的腐敗變質；水分活度越低越不利于微生物生長繁殖；細菌、放線菌適于弱堿性環境，酵母菌、霉菌適于酸性環境；好氧微生物（生活中所接觸的微生物大多為好氧菌）在無氧條件下（如充氮或抽真空）會被抑制生長。
③其他處理，如鹽漬、糖漬、高壓、微波、輻照、抗微生物制劑使用等處理也能夠殺死或抑制微生物生長繁殖。
（二）微生物檢驗與醫藥衛生
微生物種類多、數量大、代謝能力強等特點廣泛應用于醫藥衛生行業。如抗生素、維生素、酶制劑、氨基酸、有機酸等都可以利用微生物發酵生產。利用微生物工程菌發酵生產制藥具有成本低、產量高、質量穩定等優點。
大多數微生物對人類和動、植物有益或無害，只有少數可引起人類或動、植物的病害，如傷寒、痢疾、脊髓灰質炎、天花、口蹄疫、禽流感、瘋牛病、鼠疫等。具有致病性的微生物稱病原微生物，為醫學衛生微生物研究的主要對象。醫藥衛生檢驗中重要的一部分內容就是微生物檢驗，即通過研究致病微生物的形態結構、營養代謝、生長繁殖、遺傳變異、消毒滅菌、對機體的感染致病和機體的免疫機制尋找出合適的微生物檢驗法與特異性防治措施，其目的是分析、控制、消滅傳染病和與微生物有關的其他疾病，保障人類的健康。
四、微生物檢驗技術研究任務
微生物檢驗是衡量食品、農產品、醫藥等衛生質量的重要指標之一，也是判定被檢樣品能否食用的科學依據之一。微生物檢驗技術研究的主要任務是通過微生物檢驗，可以判斷產品加工環境及衛生環境是否符合相應標準要求，能夠對食品被微生物污染的程度做出正確的評價，為各項衛生管理工作提供科學依據。微生物檢驗要堅持“預防為主”，有效減少或防止食物中毒和人畜共患病的發生，保障人民的身體健康。同時，微生物檢驗對提高產品質量、避免經濟損失、保證產品穩定性等方面具有重要意義。另外，微生物檢驗有利于及時發現并控制微生物污染，完善微生物污染防控機制，避免在生產、保藏、流通中遭受有害微生物的污染，保證產品的安全性。
五、微生物學發展簡史
人類對微生物的認識是一段漫長而又曲折的過程。雖然微生物在進化圖譜中處于較低等的位置，但因其個體微小，肉眼看不見，很難被發現，人們真正認識了解微生物應是從顯微鏡發明以后才開始的?？v觀微生物學發展歷史，根據人們對微生物的由無意識利用到簡單形態觀察，再到了解微生物特性及培養，最后到全面運用分子生物學理論和現代研究方法揭示微生物生命規律，我們將微生物學發展史分為四個階段，即史前時期、啟蒙時期、形成時期、發展成熟時期。
（一）史前時期
人類對微生物的利用可以追溯到史前文明。早在4000多年前的龍山文化時期，我國就有利用微生物進行釀酒的應用，早在殷商時期中國最早的文字甲骨文中就出現了“酒”字。北魏賈思勰的《齊民要術》中，詳細列舉了谷物制曲、釀酒、制醬、釀醋和腌菜等利用微生物的記載。此外，國外也有大量有關利用微生物制作產品的史料記載。早在公元前3000年的古埃及就已詳細描述了利用微生物制作啤酒和葡萄酒的方法。
總之，這些早期的鹽腌、糖漬、煙熏、風干和釀造技術都是人類無意識地利用了微生物學知識的最好實例。
（二）啟蒙時期
1664年，英國人羅伯特·虎克（Robert Hooke）曾用原始的顯微鏡對生長在皮革表面及薔薇枯葉上的霉菌進行觀察。17世紀中葉荷蘭著名顯微鏡學家列文·虎克（Antonivan Leeuwenhoek，1632—1723）（圖1-2）使用自制的顯微鏡觀察并發現了霉菌等多種微生物，實現了人類從宏觀世界到微觀世界的觀察，開創了微生物學啟蒙時期。
圖1-2 列文·虎克（Antonivan Leeuwenhoek，荷蘭，1632—1723）
19世紀上半葉，以歐洲為代表的生物學家對微生物的認識逐步深入。1838年德國動物學家埃倫貝格在著作《纖毛蟲是真正的有機體》中，把纖毛蟲綱分成22科，其中包括3個細菌科（他將細菌看作動物），這是首次創立“細菌”一詞；1854年德國植物學家科恩首次發現桿狀細菌芽孢，并將細菌歸屬于植物界，確定了此后近百年的細菌分類學地位。
（三）形成時期
19世紀下半葉，一大批學者推動了微生物學研究的蓬勃發展，其中貢獻最突出的有巴斯德（發酵學之父）、科赫（細菌學之父）、貝耶林克和維諾格拉德斯基等生物學家。
微生物學研究的一套基本技術在19世紀后期已基本建立和成形，包括顯微術、滅菌方法、加壓滅菌器、純培養技術、革蘭氏染色法、培養皿和瓊脂凝固劑等。
法國科學家路易·巴斯德（Louis Pasteur，1822—1895）（圖1-3）將微生物研究從簡單的形態結構轉移到生理途徑方面，奠定了工業微生物學和醫學微生物學的基礎，開創了微生物生理學。他論證了酒和醋的釀造以及個別物質的腐敗都是因微生物發酵引起的，而不是因發酵或腐敗產生微生物；證實了生命只能來源于生命，創立了著名的“胚種”學說，并通過著名的曲頸瓶實驗強有力地證實了“自然發生”學說的錯誤；他進一步驗證了微生物不同代謝機能也不盡相同，各自需要的生長條件也不同；他提出的防止葡萄酒變質的加熱殺菌方法，即巴斯德消毒法，使用該方法可使新生產的葡萄酒得以長期保存；他還研究了人、畜之間的傳染?。袢?、霍亂等），提出了傳染病因是病原微生物的作用，并創立了疫苗接種預防傳染病的方法。巴斯德在微生物學各方面的科學研究成果，大大促進了醫學、發酵工業和農業的發展。
圖1-3 路易·巴斯德（Louis Pasteur，法國，1822—1895）
德國細菌學家羅伯特·科赫（Robert Koch，1843—1910）（圖1-4）是病原細菌學研究的開拓者。他首先證實了炭疽桿菌是炭疽病的病原菌，肺結核病的病原菌是結核桿菌，并提倡采用消毒和殺菌方法防止類似疾病的傳播；他創立了細菌的染色方法，設計出多種培養基，實現了實驗室微生物的培養；他建立了細菌純培養技術，并規定了鑒定病原細菌的方法和步驟，提出了著名的科赫原則。
圖1-4 羅伯特·科赫（Robert Koch，德國，1843—1910）
荷蘭微生物學家貝耶林克（Martinus Wllem Beijerinck，1851—1931）在研究煙草花葉病時指出煙草花葉病并非由細菌的病原因子誘發，而是由過濾性病毒引起的（即煙草花葉病毒）。
俄國出生的法國微生物學家維諾格拉斯基（Sergei Winogradsky，1856—1953）于1887年發現硫黃細菌，1890年發現硝化細菌，論證了土壤中硫化作用和硝化作用的微生物學過程以及這些細菌的化能營養特性。他最先發現自生固氮細菌，并運用無機培養基、選擇性培養基以及富集培養等原理和方法，研究土壤細菌各個生理類群的生命活動，揭示土壤微生物參與土壤物質轉化的各種作用，為土壤微生物學的發展奠定了基礎，并且首次提出了自養生物的概念及其與自然循環的關系。
（四）發展成熟時期
微生物學發展成熟期是從19世紀末開始一直至今。其中人們常以1953年沃森（James Watson）和克里克（Francis Crick）提出的DNA雙螺旋結構作為節點。在此以前，稱之為發展期，而此后為成熟期。
20世紀上半葉微生物學發展欣欣向榮。微生物學研究主要沿著兩個方向發展，即應用微生物學和基礎微生物學。隨著微生物與人類疾病和軀體防御機能的深入研究，促進了醫學微生物學和免疫學的發展。1928年弗萊明發現青霉素和1940年瓦克斯曼對土壤中放線菌素的研究成果導致了抗生素科學的出現，這是工業微生物研究的一個重要領域。環境微生物學在土壤微生物學研究的基礎上發展起來。隨著微生物應用成果不斷涌現，進一步促進了基礎研究的深入，于是細菌和其他微生物的分類系統在20世紀中葉出現了，通過深入對細胞化學結構和酶及其功能的研究發展了微生物生理學和生物化學。微生物遺傳與變異的研究導致了微生物遺傳學的誕生。
自1953年美國科學家沃森和英國科學家克里克提出DNA雙螺旋結構，微生物學研究重點轉向了分子微生物學，并在較短的時間內取得了一系列進展，提出了一些新的概念，如生物多樣性、進化、三原界學說，細菌染色體結構和全基因組測序，細菌基因表達的整體調控和對環境變化的適應機制，細菌的發育及其分子機制，細菌細胞之間和細菌同動植物之間的信號傳遞，分子技術在微生物原位研究中的應用等。經歷近150年成長起來的微生物學，在新的時期將作為統一生物學的重要內容繼續向前發展。