第1節　堿裂解法提取質粒DNA

質粒是存在于染色體DNA外的、能夠獨立復制的小分子DNA，其長度有數千個堿基對（kb）。細菌質粒是重組DNA技術中常用的基因運載工具。質粒的提取純化技術是最常用、最基本的實驗技術，堿裂解法是最常用的少量制備質粒DNA的方法。

一、實驗目的

自大腸桿菌（E.coli）菌株中分離純化質粒。學習利用堿裂解法使菌體分解或破碎釋放出質粒DNA，再以酚/氯仿萃取、乙醇將DNA沉淀，獲得質粒DNA分子。

二、實驗原理

堿裂解法提取分離E.coli質粒DNA的原理是利用堿裂解菌體，并使質粒DNA及染色體DNA變性，打開雙螺旋鏈呈單股狀態再加酸中和，染色體DNA因分子過大無法恢復配對并與其他分子如蛋白等沉淀下來。質粒DNA分子小很快恢復DNA原堿基配對而溶于水中，通過離心作用，即可將染色體DNA與質粒DNA分離。加入溶液Ⅰ的目的主要是將細菌團塊重新懸浮于緩沖溶液中并兼有破壁作用，溶液Ⅱ含有SDS及NaOH，前者可將細菌溶解，后者可使DNA變性，溶液Ⅲ是由醋酸及鉀鹽組成的，前者在于中和堿，后者則與DNA形成復合物而有利于DNA的沉淀。加入溶液Ⅲ后離心，大部分的蛋白質與染色體DNA會留在下面的有機層，而上層的水層所含的質粒DNA可用乙醇沉淀，或酚/氯仿/異戊醇萃取去除殘留蛋白質，氯仿可使蛋白質變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可以消除抽提過程中出現的泡沫，70%乙醇洗滌除鹽。

三、材料、試劑與儀器

1.實驗材料

實驗前一天，將含pET-28a質粒的E.coli DH5α菌株接種至3mL含卡那霉素50μg/mL的LB培養液中，并在37℃下振蕩培養過夜。

2.實驗試劑

溶液Ⅰ（GTE溶液）：25mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、10mmol/L EDTA（pH 8.0）、50mmol/L葡萄糖，121℃、高壓滅菌15min，貯存于4℃。

溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1% SDS（使用前以10mol/L NaOH與10% SDS稀釋配制）。

溶液Ⅲ：3mol/L醋酸-醋酸鉀溶液（pH 5.2），4℃保存備用。

其他：LB培養液、1mg/mL RNase A溶液、TE緩沖溶液、苯酚/氯仿/異戊醇（三者體積比為25∶24∶1）、無水乙醇或異丙醇、70%乙醇、100mg/mL卡那霉素母液。

3.實驗儀器

高壓滅菌鍋、微量移液器（20μL，200μL，1000μL）、渦旋振蕩器、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、臺式離心機、微量離心管、真空干燥機及NanoDrop 2000C超微量分光光度計。

四、實驗步驟

（1）將過夜培養菌液分別倒入1.5mL微量離心管中，以6000r/min離心2min后，棄上清液。

（2）沉淀菌體加入100μL預冷的溶液Ⅰ，渦旋振蕩器劇烈振蕩，使菌體完全懸浮，室溫放置5min。

（3）加入200μL溶液Ⅱ，蓋上管蓋后將離心管反復上下顛倒數次（不可振蕩），室溫放置5min。

（4）加入150mL溶液Ⅲ，亦溫和搖勻，室溫放置5min。

（5）以12000r/min（13400g）離心10min，小心吸取上清液至另一離心管中。

（6）加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇（約350μL），振蕩混合有機相和水相，然后12000r/min離心10min，將上清轉移至一新離心管中。

（7）加入2倍體積無水乙醇，混合均勻，-20℃放置30min。

（8）12000r/min離心10min，小心棄上清液，加入1mL 70%乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心2min，棄上清液。

（9）將開口的離心管置于超凈工作臺，吹干乙醇。

（10）加入2μL的RNase A溶液，加入20μL的TE緩沖液溶解，37℃放置20min，-20℃保存。

五、結果與分析

pH 7～8.5和低離子濃度的條件下（如10mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH 8.0）測定A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.6～1.9，低于1.6說明有蛋白質、酚等污染，高于1.9有RNA污染，大于2.0可能被異硫氰酸胍污染，公認純DNA為1.8。A₂₆₀/A₂₃₀比值在2.0～2.5，小于2.0表明樣品被糖類、鹽類或有機溶劑污染。也可用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測所提取DNA的情況。

六、注意事項

（1）收集菌體提取質粒DNA前，培養基要去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮。

（2）在添加溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后采用上下顛倒的柔和混合方法，不要在振蕩器上劇烈振蕩，以免污染基因組DNA。其中加入溶液Ⅱ后，溶液變澄清，并有黏性，加入溶液Ⅲ后，出現絮狀沉淀。

（3）配制酚/氯仿溶液過程中，吸取酚溶液時，注意吸取下層，上層為酚飽和的水溶液，下層為水飽和的酚溶液。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。苯酚能造成皮膚的嚴重燒傷及衣物損壞，使用時應注意小心操作。如果不小心皮膚上碰到苯酚則應用堿性溶液、肥皂及大量的清水沖洗。

（4）苯酚/氯仿/異戊醇溶液分上下兩層，上層是隔絕空氣作用的Tris-HCl液，所以應取下層溶液。

（5）采用有機溶劑（苯酚/氯仿/異戊醇）抽提時，應充分混合。經苯酚/氯仿抽提后，吸取上清液時注意不要把中間的白色層吸入，其中含蛋白質等雜質。

（6）如果用異丙醇沉淀DNA時，鹽等雜質易下沉，所以沉淀要在室溫下進行，并且時間不宜過長，限于20min以內。沉淀離心后，還要用70%乙醇洗滌，以除去鹽類及揮發性小的異丙醇。

（7）有些質粒本身可能在某些菌種中穩定存在，但經過多次轉接有可能造成質粒丟失。因此，不要頻繁轉接，每次接種時應挑單菌落。

七、思考題

質粒DNA提取過程中是如何與染色體DNA實現分離的？

（劉長霞）