第2節(jié)　磁珠法提取質(zhì)粒DNA

磁珠分離技術(shù)已在生物分子分離純化領(lǐng)域有較為廣泛的應(yīng)用。單分散磁珠粒子，內(nèi)核是具有超順磁性的磁芯，外層包被二氧化硅，有非常好的化學(xué)穩(wěn)定性和機械穩(wěn)定性，其粒徑有納米級、亞微米級和微米級，比表面積大。磁珠法純化核酸操作簡便、快捷，不需要苯酚、氯仿等有毒有機溶劑抽提，無需離心、沉淀等耗時步驟，可配合自動化儀器進行自動化操作，實現(xiàn)高通量提取。純化的核酸可以直接應(yīng)用于PCR、酶切、雜交等后續(xù)實驗。

一、實驗?zāi)康?/h3>

掌握使用磁珠法提取質(zhì)粒DNA，了解提取原理及各種試劑的作用。

二、實驗原理

磁性SiO₂復(fù)合微球與DNA的吸附機理類似于硅類吸附介質(zhì)：DNA在低pH 值高鹽條件下可以吸附沉積到磁性SiO₂復(fù)合微球表面，當溶液環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)楦遬H 值溶液時，DNA又可以被成功地從磁性SiO₂復(fù)合微球表面解吸附。DNA/RNA結(jié)合到磁珠上主要靠靜電作用、疏水作用和氫鍵作用。細胞或組織在一定的裂解液（胍鹽、去污劑、蛋白酶K等）作用下，核酸從生物樣本中釋放出來，隨后核酸在結(jié)合液（聚乙二醇、碘鹽、高氯酸鹽和醇等）存在的條件下，特異性地與二氧化硅磁珠結(jié)合，形成核酸-磁珠復(fù)合物，該復(fù)合體經(jīng)過磁場作用，從生物裂解液中分離出來，其后復(fù)合體經(jīng)過鹽溶液洗滌后去除非特異性吸附的雜質(zhì)，醇洗滌去除鹽分后，可以用TE緩沖液進行洗脫，將核酸純化。

三、材料、試劑與儀器

1.實驗材料

含pET-28a的E.coli。

2.實驗試劑

卡那霉素、LB培養(yǎng)液（配制方法見附錄Ⅲ）。

磁珠吸附法試劑盒組分：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ及溶液Ⅲ配制見本章第1節(jié)，其中溶液Ⅰ使用前加入RNase A（工作濃度為20μg/mL），TE緩沖液配制見附錄Ⅲ，70%乙醇。

DNA結(jié)合液配制：20g PEG8000溶解于100mL 2mol/L的NaCl溶液中。

100mg/mL Fe₃O₄@SiO₂亞微球：100mg Fe₃O₄@SiO₂亞微球分散到1mL的TE緩沖液中。

3.實驗儀器

磁鐵或磁力架，其他同堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

四、實驗步驟

1.Fe₃O₄@SiO₂制備^［5］

（1）配制物質(zhì)的量濃度為0.13mmol/mL的FeCl₃·6H₂O的無水乙二醇溶液，將一定質(zhì)量的FeCl₃·6H₂O加入到無水乙二醇中，室溫攪拌，直至成為澄清溶液。接著加入CH₃COONa、PEG4000，二者的終質(zhì)量濃度分別為100mg/mL、25mg/mL，反應(yīng)液的體積不超過反應(yīng)釜體積的3/5，劇烈攪拌30min，轉(zhuǎn)移至密封高壓反應(yīng)釜中，200℃反應(yīng)8h。冷卻至室溫后，將磁性產(chǎn)物用95%乙醇、純水交替洗滌3次，無水乙醇洗滌2次，磁性分離，磁性粉末即為Fe₃O₄亞微米磁球，貯存在無水乙醇中，使用前60℃真空干燥過夜。

（2）稱取0.5g Fe₃O₄多孔亞微球，加入1mol/L的NaOH溶液200mL，加熱升溫至90℃，400r/mim攪拌10min，再加入6mL油酸，反應(yīng)30min，磁性分離，無水乙醇洗滌5次，得到油基Fe₃O₄亞微球。

（3）上述油基Fe₃O₄亞微球用丙酮、乙醇交替洗滌2次，加入15mL正硅酸乙酯（TEOS）、1.5g表面活性劑Triton X-100，超聲5min，加入100mL去離子水，超聲混勻20min。將上述分散混合液轉(zhuǎn)移到1000mL圓底燒瓶中，加入80mL氨水、200mL無水乙醇，90℃、800r/min攪拌4h，磁性分離，用乙醇和去離子水交替清洗3次，產(chǎn)物即為SiO₂包覆的Fe₃O₄亞微球，即Fe₃O₄@SiO₂，無水乙醇封存。使用前60℃真空干燥。

2.Fe₃O₄@SiO₂提取質(zhì)粒DNA

（1）取3mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12000r/min離心1min，盡量除凈上清液（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

（2）向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液Ⅰ（確保已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。

（3）向離心管中加入250μL溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，使菌體充分裂解。此時菌液應(yīng)變得清亮黏稠，否則應(yīng)減少菌體量，菌體過多裂解不徹底。

（4）向離心管中加入300μL溶液Ⅲ，立即快速地上下顛倒混合10～15次，充分混勻，此時將出現(xiàn)絮狀沉淀，12000r/min離心2min。

（5）將離心管中的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中，加入50μL的100mg/mL磁球、400μL的DNA結(jié)合液，顛倒混勻，室溫放置5min，其間顛倒混勻數(shù)次，防止磁珠沉淀。

（6）磁分離，棄上清液，70%乙醇洗滌2次，開蓋揮發(fā)殘留的乙醇。

（7）加入50～100μL的TE緩沖液，用移液器吸打混勻，室溫放置10min，注意防止磁珠沉降。

（8）磁分離，上清液即為收集到的質(zhì)粒DNA，將其轉(zhuǎn)移到新的離心管中，-20℃保存。

五、結(jié)果與分析

（1）溶劑熱法制備Fe₃O₄亞微米粒子及Fe₃O₄@SiO₂亞微米粒子，掃描電子顯微鏡（SEM）及透射電子顯微鏡（TEM）觀察粒徑均為200nm左右（圖1-1），均一性良好。Fe₃O₄亞微米單個粒子的磁響應(yīng)性遠遠強于納米尺寸的單個粒子，非常適合生物大分子的分離。

（2）獲得的質(zhì)粒DNA分子進一步做瓊脂糖凝膠電泳確定，純度檢測同堿裂解法。

六、注意事項

（1）收集菌體提取質(zhì)粒前，培養(yǎng)基要去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮。

（2）在添加溶液Ⅱ后，混合一定要柔和，采用上下顛倒的方法，不要在振蕩器上劇烈振蕩。加溶液Ⅱ后溶液會變澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后則出現(xiàn)絮狀沉淀。

（3）使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)渾濁，如有渾濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

（4）在漂洗和洗脫的過程中，為防止磁珠沉降可反復(fù)上下顛倒離心管。

七、思考題

簡述Fe₃O₄@SiO₂亞微球分離DNA的原理。

（劉長霞）