第3節 質粒DNA瓊脂糖凝膠電泳及其膠回收
瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，在高溫溶液狀態下是無規卷曲狀態，當冷卻時，通過氫鍵形成螺旋纖維，繼續保持較低的溫度，螺旋纖維之間在“節點”靠氫鍵連接形成三維結構即為凝膠［6］。膠結構均勻，含水量大（占98%～99%），對樣品吸附極微，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好，需樣量少，是核酸平板凝膠電泳的常用方法，也可用于大分子蛋白的分離和鑒定［7］。凝膠中瓊脂糖的濃度愈大，形成的空隙愈小。不同濃度的瓊脂糖凝膠分離DNA分子大小如表1-2所示。
表1-2 瓊脂糖濃度和DNA分子大小的關系［7］
凝膠電泳不僅可以進行核酸片段分析，還可以作為分離純化DNA分子的手段。瓊脂糖DNA片段回收方法有透析法、反復凍融法、低熔點法及試劑盒回收法等［8，9］，磁珠法也是近幾年興起的回收瓊脂糖凝膠電泳DNA片段的方法。
一、實驗目的
學習將獲得的核酸片段進行瓊脂糖電泳分離、鑒定及用酚/氯仿從凝膠中回收質粒DNA的基本方法。
二、實驗原理
DNA等電點較低，在特定的緩沖條件下帶負電荷的DNA分子向正極方向移動。其移動速率依賴于分子片段的大小，分子愈大，移動速率愈慢。特定大小的DNA片段在不同濃度的膠中移動速率均不同，可用DNA marker（DNA標記）來比較它們的大小。核酸經熒光染料染色嵌入核酸堿基中，以紫外線激發產生熒光，通過核酸的位置判斷核酸分子的大小及分離效果。
三、材料、試劑與儀器
1.實驗材料
商品化試劑盒及磁珠法提取獲得的E.coli質粒pET-28a。
2.實驗試劑
50×TAE電泳緩沖液、1.5%瓊脂糖、上樣緩沖液（含溴酚藍指示劑）、核酸染料GoldView（10000×）、10kb的DNA marker、酚/氯仿（1∶1）、10%CH3COONa、無水乙醇、70%乙醇。
3.實驗儀器
電泳儀、電泳槽、凝膠自動成像儀、微波爐、離心管、冰箱、臺式離心機、電子天平、微量移液器（20μL、1000μL）。
四、實驗步驟
（1）將1.5%瓊脂糖凝膠置于微波爐中加熱至瓊脂糖完全熔化（注意！防止突沸及膠液外溢）。讓瓊脂糖在室溫下冷卻30min以上，待手持膠液不燙手時，加入3.0μL熒光染料（GoldView）混勻，隨即倒入電泳槽內，插上梳子后使之凝結。未使用的電泳膠片可以用保鮮膜封存，或浸入1×TAE緩沖液內，置于4℃冰箱中，留待下次再使用。
（2）取5μL的E.coli pET-28a質粒DNA溶液與2μL上樣緩沖液混合，加入到齒孔，并在其他齒孔中加入5μL的DNA marker進行比較，連接電源插頭（黑色為負極-，紅色為正極+），帶負電荷的DNA分子會由負極移向正極，80～100V電泳1h，或直至上樣緩沖液染劑前端距膠底1.5cm（注意！勿碰觸高壓電的電泳儀器）。
（3）將膠取出，置于凝膠自動成像儀，紫外燈下觀察、拍照。
（4）切膠稱重，-20℃凍融搗碎2次。
（5）等體積酚/氯仿，振蕩5min（如果膠的量少，可將酚/氯仿的比例提高），12000r/min，5min。
（6）取上清液，加入10% CH3COONa混勻，再加入2倍體積無水乙醇混勻，12000r/min，10min。
（7）棄上清液，離心管中加入70%乙醇500μL，12000r/min，5min。
（8）棄上清液，干燥即得。
五、結果與分析
通過電泳圖譜可以檢測所提DNA片段的大小和相對純度，也可以進行特定片段純化。在細菌細胞內共價閉環DNA質粒以超螺旋形式存在，若在提取過程中質粒DNA其中一條鏈有斷裂或多處斷裂但不在同一位置，則解螺旋成環狀DNA分子，若在2條鏈的同一處斷裂，則成線狀DNA分子。若出現后兩種情況，電泳遷移速率為：共價閉環DNA>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。圖1-2為商品化試劑盒與磁珠法提取質粒DNA電泳圖，可通過條帶判斷DNA分子的純度及分子大小。
圖1-2 純化的質粒DNA pET28a電泳圖［5］
M—DNA marker；1—商品試劑盒（硅膠柱）提取質粒；2，3—Fe3O4@SiO2提取質粒
六、注意事項
（1）戴手套把瓊脂糖放在強UV（紫外線）透射光源板上，300nm紫外線激發即可對結果拍照存檔，盡量減少身體（臉或手）和膠體暴露于UV下過久，有時會使DNA產生缺口或突變。
（2）以刀片將E.coli pET-28a質粒載體DNA切下，做DNA純化及濃縮，若分離的DNA條帶過細，可適當增加酚/氯仿的比例。
七、思考題
（1）瓊脂糖凝膠電泳分離DNA分子量的范圍是多少？
（2）為何瓊脂糖凝膠電泳適合作為核酸分離介質？
（劉長霞）