第4節　E.coli基因組DNA的提取

一、實驗目的

（1）了解原核生物E.coli基因組DNA的制備原理及各種試劑的作用。

（2）掌握原核生物E.coli基因組DNA的提取和檢測方法。

二、實驗原理

基因組DNA的提取是構建基因組文庫、Southern雜交（包括RFLP）及PCR等的重要環節^［6～8］。提取基因組DNA通常要求分子量盡可能大，以增加外源基因的獲得率，所以要溫和操作，減少剪切力，盡量低溫操作^［9，10］。細胞內及抽提器皿中污染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA，所以制備過程中要抑制其核酸酶的活性。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中的溶解度可達40g/L，DNA在水中的溶解度為10g/L，呈黏性膠體溶液。

在酸性溶液中，天然狀態的DNA是以脫氧核糖核蛋白（DNP）的形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA時，先把DNP抽提出來，再把蛋白質除去，再除去細胞中的糖、RNA及無機離子等，從中分離DNA。DNP和核糖核蛋白（RNP）在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在低濃度鹽溶液中幾乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化鈉中溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中的溶解度較大。因此，在提取時，常用此法分離這兩種核蛋白。

Bandyopadhyay等比較了苯酚-氯仿法、試劑盒法和磁性分離法提取細菌基因組DNA^［10］，如表1-3所示。

磁性分離法的成本雖然不高，但市場售價仍然是比較昂貴的。苯酚/氯仿法是目前耗時但較為廉價的方法。E.coli基因組DNA提取過程中，使用苯酚作為蛋白變性劑，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白質與DNA的連接鍵已斷，蛋白質分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白質分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質，用乙醇沉淀DNA。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態，真核細胞DNA的分離通常是在EDTA及SDS一類去污劑的存在下，用蛋白酶K消化細胞獲得的。

三、材料、試劑與儀器

1.實驗材料

E.coli發酵液。

2.實驗試劑

苯酚/氯仿/異戊醇混合液（苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1，體積比）、氯仿/異戊醇混合液（氯仿∶異戊醇=24∶1，體積比，溶液Ⅰ）、異丙醇、70%乙醇、95%乙醇、100mg/mL磁性粒子、10%（質量濃度）SDS溶液、無菌超純水，YPD培養基、RNase A溶液、TE緩沖液、0.7%的瓊脂糖凝膠配制見附錄Ⅲ。

DNA結合液：10g PEG6000溶解于100mL 1.25mol/L的NaCl溶液中。

10mg/mL蛋白酶K：100mg蛋白酶K溶解于10mL 50mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，10mmol/L CaCl₂）中，分裝，20℃貯存。

10mg/mL溶菌酶：100mg溶菌酶溶解于10mL TE緩沖液中，20℃貯存。

3.實驗儀器

臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，渦旋振蕩器，恒溫水浴鍋，磁鐵或磁力架，電泳儀、電泳槽、離心管、凝膠自動成像儀、NanoDrop 2000C超微量分光光度計、微量移液器（20μL、200μL、1000μL）。

四、實驗步驟

1.酚-氯仿法

（1）1mL E.coli菌體發酵液，10000r/min離心1min，去上清液。

（2）加750μL溶液Ⅰ，懸浮沉淀，并加溶菌酶使其終濃度為1mg/mL，37℃保溫0.5h。

（3）懸液中加入蛋白酶K溶液，使其終濃度為0.1mg/mL，混勻，55℃保溫1h。

（4）加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇上下顛倒混勻，10000r/min離心5min，將上清液移至干凈離心管中，然后再用等體積苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次。

（5）用等體積氯仿/異戊醇抽提，10000r/min離心5min，取上清液移至干凈離心管中。

（6）加等體積異丙醇，顛倒混合，-20℃靜置20min，沉淀DNA，10000r/min離心5min，棄上清液。

（7）DNA沉淀加入1mL 70%乙醇吹打混勻，4℃10000r/min離心5min，棄上清液，風干乙醇，溶解于50μL的TE緩沖液中。

（8）最后貯存液中加入1μL RNase A溶液，終濃度為20μg/mL。

2.商品試劑盒法（按商品說明書操作即可）

3.磁珠法

（1）1mL E.coli菌體發酵液，10000r/min離心1min，去上清液。

（2）加450μL TE緩沖液并充分懸浮，并加入50μL、0.1g/mL（質量濃度）的SDS溶液，顛倒混合2～3次。

（3）50℃溫浴90s，懸液顯示白色黏稠狀。

（4）50μL 100mg/mL（TE緩沖液懸液）磁性粒子加入到上述懸液中，再加入500μL的DNA結合液，輕柔顛倒混合幾次，室溫保持3～5min。

（5）磁性分離，磁性粒子用95%乙醇洗滌、70%乙醇洗滌之后，室溫下風干。

（6）磁性粒子懸浮在30μL的TE緩沖液中，輕柔顛倒幾次，室溫保持10min。

（7）磁性分離，上清液轉移到新的離心管中，即為E.coli基因組DNA。

（8）DNA的TE緩沖液0.7%瓊脂糖凝膠電泳，拍照。

（9）DNA的TE緩沖液稀釋一定倍數后，測定OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀，以確定DNA含量和質量。

五、結果與分析

文獻報道幾種方法提取E.coli基因組DNA序列長度均應為23.1kb，其瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1-3。

六、注意事項

（1）裂解液要預熱，以抑制DNase，加速蛋白變性，促進DNA溶解。

（2）各操作步驟要輕柔，盡量減少DNA的人為降解。

（3）苯酚-氯仿法取各上清液時，不應貪多，以防非核酸類成分干擾。

（4）異丙醇、乙醇、CH₃COONa、CH₃COOK等要預冷，以減少DNA的降解，促進DNA與蛋白質等的分相及DNA沉淀。

（5）提取DNA過程中所用到的試劑和器材要通過高壓烤干等辦法進行無核酸酶化處理。

（6）所有試劑均用高壓滅菌超純水配制。

（7）蛋白酶K使用前60℃孵育30min，以提高其活性。

七、思考題

（1）為何市售RNase A使用前必須進行熱處理？冷卻過程應注意什么問題？

（2）簡述提取基因組DNA的原理和注意事項。

（劉長霞）