第三節(jié)　核酸的檢測(cè)方法

核酸分子無(wú)法用肉眼直接觀察，在電泳后需染色或顯色并采用一定的檢測(cè)方法才能觀察到核酸的帶型。理想的核酸染色試劑應(yīng)滿(mǎn)足以下條件：吸收和發(fā)射光譜應(yīng)在可見(jiàn)光區(qū)，以降低散射和熒光背景；應(yīng)有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，以獲得高靈敏度；染料的存在不會(huì)嚴(yán)重改變電泳譜圖；有些核酸還需要做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，如連接、轉(zhuǎn)化等，染料的存在不影響下一步的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟛煌怂崮z有多種染色、檢測(cè)的方法，主要可以分為兩類(lèi)：一類(lèi)是直接染色檢測(cè)法，如溴化乙錠染色法和銀染法；一類(lèi)是標(biāo)記物檢測(cè)法，首先是讓標(biāo)記物和待測(cè)核酸結(jié)合或者摻入待測(cè)核酸，然后再通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)待測(cè)核酸，常用的標(biāo)記有同位素標(biāo)記、地高辛標(biāo)記和熒光標(biāo)記。

一、溴化乙錠染色法

核酸電泳中最常用的染色劑是溴化乙錠。溴化乙錠全稱(chēng)為3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽（ethidium bromide,EB），是一種熒光染料，本身的熒光很弱。EB分子可嵌入核酸堆積配對(duì)的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出橙紅色熒光。

EB激發(fā)熒光的能量來(lái)源于兩個(gè)方面：一是核酸吸收波長(zhǎng)為260 nm的紫外線后，將能量傳遞給EB分子；二是EB分子本身主要吸收300和360 nm波長(zhǎng)的紫外光能量，來(lái)源于這兩個(gè)方面的能量最終激發(fā)EB分子發(fā)射出波長(zhǎng)為590 nm的可見(jiàn)光譜中的橙紅色熒光。同時(shí)EB-DNA復(fù)合物中EB發(fā)出的熒光比游離在核酸分子外EB分子發(fā)出的熒光強(qiáng)度要大幾十倍，因此當(dāng)核酸含量較高的時(shí)候，電泳后不需要對(duì)背景處理就可以直接觀察核酸電泳的帶型。如果核酸含量較低或者瓊脂糖的質(zhì)量較差，吸附較多的EB分子，會(huì)使EB的背景太深而看不清核酸的電泳條帶，此時(shí)可將凝膠浸泡于蒸餾水中30 min以上，減少背景。也可以添加一定的熒光淬滅劑來(lái)加快和提高褪色效果，常用的淬滅劑有鹵素粒子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。

在核酸電泳中常用1 mmol/L的MgSO4或10 mmol/L的MgCl2加快和提高褪色效果，但是使用熒光淬滅劑在時(shí)間上需要把握好，淬滅時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，背景降低的同時(shí)檢測(cè)靈敏度也會(huì)下降。一般，1 mmol/L的MgSO4不超過(guò)1 h，10 mmol/L的MgCl2約5 min，這樣可以檢測(cè)到至少1 ng的DNA樣品。在高離子強(qiáng)度的飽和溶液中，DNA大約每2.5個(gè)堿基插入一個(gè)EB分子，單鏈DNA、RNA分子中若有自身配對(duì)的雙鏈區(qū)也可被EB分子嵌入，但嵌入量少，因而檢出靈敏度較低，要大于100 ng才能檢測(cè)到。

在紫外線照射EB-DNA復(fù)合物時(shí)，不同波長(zhǎng)的紫外線出現(xiàn)不同的效應(yīng)。當(dāng)用254 nm的紫外線照射時(shí)，紫外線主要由核酸分子吸收后傳遞給EB分子，其檢測(cè)靈敏度最高，但對(duì)DNA損傷嚴(yán)重，會(huì)造成核酸的斷裂和嘧啶二聚體的形成。此外，用254 nm的紫外光照射時(shí)，核酸的熒光壽命（fluorescence life time）也短，照射時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)褪色嚴(yán)重。當(dāng)利用360 nm紫外線照射時(shí)，紫外線主要由EB分子吸收，檢測(cè)的靈敏度較低，但對(duì)DNA損傷小，長(zhǎng)時(shí)間的照射僅有少量的核酸斷裂，不會(huì)形成二聚體，幾乎不褪色，所以適合對(duì)DNA樣品的長(zhǎng)時(shí)間觀察和回收等操作。300 nm紫外線照射時(shí)，主要由EB分子吸收，對(duì)觀測(cè)樣品而言，有較高的檢測(cè)靈敏度，且對(duì)DNA損傷不是很大，僅有輕微的褪色，所以成為核酸回收實(shí)驗(yàn)的最適合觀察波長(zhǎng)。

需要特別注意的是，如果電泳回收DNA將用于連接反應(yīng)，需要用360 nm紫外線進(jìn)行觀察。有研究報(bào)道，用波長(zhǎng)小于300 nm紫外線照射30s，就能使DNA片段的連接效率下降98%以上，而用360 nm紫外線照射2 min，不會(huì)對(duì)連接效率產(chǎn)生影響（圖2-1）。

EB分子見(jiàn)光易分解，一般用鋁箔或黑紙包裹容器在避光條件下室溫保存，染色時(shí)也應(yīng)避光。EB是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有較強(qiáng)的毒性并被認(rèn)為有致癌性，操作時(shí)需要小心，染色時(shí)需要戴乳膠手套，如果不慎接觸應(yīng)立即用水沖洗干凈。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)對(duì)含EB的溶液進(jìn)行凈化處理再行棄置，以避免其污染環(huán)境和危害人體健康。對(duì)于污染EB的桌面和玻璃器皿可以使用商品化EB高效清除劑，它能有效破壞EB的結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)清除EB污染的目的。這種清除劑還可用于清除緩沖液、有機(jī)溶液和各種固體（玻璃、不銹鋼、塑料、地板、設(shè)備等）表面的EB污染。

對(duì)于EB溶液的處理，一般可以用木炭過(guò)濾或用化學(xué)方法使其失活。在使用木炭過(guò)濾后，需將木炭焚燒使其失活。化學(xué)中和方法可以加等體積的漂白粉，攪拌4 h，靜置4天，用NaOH調(diào)至pH 4～9，倒入排水溝的同時(shí)用大量水沖洗；也可以每100 mL的EB溶液加5%磷酸，加12 mL 0.5 mol/L的NaNO 3，攪拌并靜置20 h，用NaOH調(diào)至pH 4～9，倒入排水溝。對(duì)于EB含量大于0.5 mg/mL的溶液也可以采用以下方法處理，將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5 mg/mL，加入等體積的0.5 mol/L KMnO4，混勻，再加入等量的25 mol/L HCl，混勻，置室溫?cái)?shù)小時(shí)，加入等體積的2.5 mol/L NaOH，混勻并廢棄。

二、化學(xué)染料染色法

由于EB具有毒性和致癌性，會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生一定的污染，所以尋找更安全的核酸染料成了實(shí)驗(yàn)者迫切需要解決的問(wèn)題。目前市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了不少可以代替EB的無(wú)毒核酸染料產(chǎn)品，它的作用機(jī)理及使用方法與EB相同。

市場(chǎng)上存在的多種不同商品名的新型核酸染料，它們其中一些可能在化學(xué)成分上是一樣或相似的，常見(jiàn)的有SYBR-Green、Goldview和GelRed/GelGreen等。SYBR-Green和Sybrgold穩(wěn)定性很差，易降解（怕光、怕水、怕熱），在紫外燈下本底色較重，其毒性還存在爭(zhēng)議。

Goldview被認(rèn)為就是吖啶橙（acridine orange,AO）的衍生物，它靈敏度較差，本底色較重，對(duì)于大片段DNA的染色效果還湊合，但是對(duì)500 bp以下的片段染色效果不是很好，在紫外燈下不穩(wěn)定，容易淬滅。

Goldview不僅能染DNA，也可用于染RNA，在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈DNA呈紅色熒光。目前尚未發(fā)現(xiàn)Geneview有致癌性，但它有一定的刺激性，在使用過(guò)程還需要戴上手套。

Genegreen利用紫外線做激發(fā)光源，在效果上和EB有差距，可能是紫外線波長(zhǎng)不一樣。根據(jù)染料的特性，應(yīng)使用相應(yīng)的光源和激發(fā)波長(zhǎng)，如果激發(fā)波長(zhǎng)不對(duì)，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。

GelRed穩(wěn)定性較好，靈敏度高，幾乎沒(méi)有底色，對(duì)核酸遷移的影響小于其他染料，可以用微波爐加熱。在312 nm激發(fā)的UV凝膠成像系統(tǒng)中，GelRed染色效果和EB差不多，可以完美地替代EB，使用254 nm激發(fā)的UV凝膠成像系統(tǒng)或可見(jiàn)光激發(fā)的凝膠觀察裝置中，GelRed足以替代任意一種染料。GelRed在紫外線下不容易淬滅，可以用于膠回收，其毒性也是最低的，但其價(jià)格遠(yuǎn)高于其他的替代染料。

化學(xué)染料染色能滿(mǎn)足一般DNA檢測(cè)的要求，是比EB更安全的染料，但是有報(bào)道認(rèn)為，有些化學(xué)染料存在穩(wěn)定性差、難于保存的缺點(diǎn)，且在某些濃度低、片段短的染色中效果不及EB，故目前尚不能完全取代EB。此外，化學(xué)染料對(duì)不同DNA片段電泳影響具有不確定性，使用化學(xué)染料時(shí)最好電泳完成后再進(jìn)行染色。

三、銀染法

銀染液中的銀離子（Ag+）可以和核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，用還原劑（如甲醛）將Ag+還原成銀顆粒并沉積在核酸條帶上，形成黃色或黑褐色的條帶。銀染主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳，其靈敏度比EB高200倍，在厚度小于0.5 mm的凝膠中，能檢測(cè)出0.5 ng的RNA。銀染法可用于分子標(biāo)記和DNA測(cè)序，但銀染色后核酸和銀離子形成不可逆的穩(wěn)定復(fù)合物，核酸的結(jié)構(gòu)被破壞，不宜做核酸的回收，也不適用于制備電泳。銀染法檢測(cè)DNA雖然也可以用于瓊脂糖凝膠染色，但不常用。

銀染法存在專(zhuān)一性不強(qiáng)和重復(fù)性較差的缺點(diǎn)，銀離子不僅能與核酸染色，也能與蛋白質(zhì)、去污劑反應(yīng)產(chǎn)生相似的顏色，形成較深的背景，如在檢測(cè)PCR結(jié)果的電泳中，由于Taq酶也會(huì)被染成與DNA一樣的顏色，使得泳道有與核酸電泳條帶顏色一樣的彌散條帶狀現(xiàn)象出現(xiàn)，上樣量較大時(shí)顏色會(huì)更深，會(huì)覆蓋較弱的電泳條帶。銀染DNA條帶顏色的深淺與核酸含量不成正相關(guān)，而與核酸的堿性組成有關(guān)，因此銀染法獲得的DNA條帶不能反映DNA的真實(shí)含量，不能用于核酸含量的比較。銀染法對(duì)使用的各種試劑、水以及在染色過(guò)程的pH、溫度及反應(yīng)時(shí)間等要求較高，反應(yīng)溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)及水和試劑的純度太差，都會(huì)造成背景加深或影響到檢測(cè)的靈敏度，不同廠家、不同批次的試劑或者反應(yīng)時(shí)間的差異也可能會(huì)造成重復(fù)性差。此外，銀染存在許多不同的顯色方法，這些方法的操作時(shí)間和得到的染色背景都有很大差異。目前有很多商品化的銀染試劑盒，這些試劑盒不僅操作方便，而且重復(fù)性也較好。

四、放射性檢測(cè)法

放射性檢測(cè)法是利用放射性同位素來(lái)檢測(cè)目的核酸，可以把標(biāo)記的NTP置換DNA末端核苷酸，或?qū)?biāo)記的dNTP摻入DNA序列中，電泳完成后檢測(cè)凝膠中的核酸帶型；也可以把完成電泳的凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的膜上（如硝酸纖維素膜或尼龍膜），然后與放射性同位素標(biāo)記過(guò)的探針進(jìn)行雜交，再檢測(cè)膜上特定的核酸條帶。結(jié)合了放射性同位素的核酸可以利用X光膠片曝光來(lái)檢測(cè)核酸條帶及其含量，或者是利用放射性成像設(shè)備來(lái)檢測(cè)，如美國(guó)Amersham公司Typhoon多功能激光掃描成像系統(tǒng)，可以檢測(cè)磷屏、多色熒光、化學(xué)發(fā)光，可用于同位素、熒光、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的電泳凝膠、雜交膜、組織切片、生物芯片等多種樣品的掃描，并用軟件對(duì)得到的圖像進(jìn)行分析。

常用于核酸標(biāo)記的同位素有32P、33P和35S，它們都屬于β衰變釋放出的β粒子，但是它們?cè)谀芰可嫌胁顒e。32P釋放的β粒子能量高，穿透力較強(qiáng)，因此靈敏度較高，放射自顯影所需的時(shí)間也短。32P的缺點(diǎn)是半衰期較短，射線的散射較嚴(yán)重，導(dǎo)致X膠片上的帶型會(huì)變得肥大而且輪廓不夠銳利，因而影響到分辨率。當(dāng)遇上對(duì)分辨率要求較高的實(shí)驗(yàn)（如原位雜交的實(shí)驗(yàn)），則會(huì)影響到對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。35S釋放的β粒子能量較32P低，檢測(cè)的靈敏度也較32P低，但其射線的散射作用較弱，在X膠片上顯影的帶型較銳利，分辨率高，適用于對(duì)分辨率要求較高的原位雜交實(shí)驗(yàn)。33P檢測(cè)的靈敏度介于32P和35S之間，其散射作用小于32P，檢測(cè)靈敏度較35S高，但其價(jià)格較昂貴，也很少?gòu)S家生產(chǎn)，因而很少使用。

需要注意的是，32P標(biāo)記的商業(yè)產(chǎn)品有核苷酸（32P-NTP）和脫氧核苷酸（32P-dNTP），其劑型有水溶液型和乙醇溶液型，前者可以直接使用，后者需要離心、干燥，重新溶解后再使用。此外，還要特別注意32P在三磷酸核苷酸分子上的標(biāo)記位置，有些方法需要α位標(biāo)記，如缺口平移和隨機(jī)引物標(biāo)記法使用[α-32P]dNTP；有些方法需要γ位標(biāo)記，如利用多核苷酸激酶的末端標(biāo)記法使用是[γ-32P]NTP。

用放射性同位素標(biāo)記檢測(cè)核酸有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，靈敏性高，一般可達(dá)到0.5～5 pg或更低濃度核酸的檢測(cè)水平。延長(zhǎng)曝光時(shí)間，采用增敏屏增敏（一種專(zhuān)門(mén)的X曝光盒），可以檢測(cè)極少量或拷貝數(shù)少的基因組。第二，特異性高。用放射自顯影法，樣品中存在的無(wú)關(guān)核酸或非核酸成分不會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，準(zhǔn)確率高，假陽(yáng)性率低。第三，方法簡(jiǎn)便。用放射自顯影法只對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境有一定的要求，不需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備，所以放射性同位素標(biāo)記核酸探針在一些有條件的單位作為主要的標(biāo)記方法仍在使用。

放射性同位素標(biāo)記技術(shù)也存在以下缺點(diǎn)：第一，半衰期短，標(biāo)記的探針不能長(zhǎng)期保存，如32P和33P半衰期只有14.3天，放射強(qiáng)度逐日變化。35S的半衰期可達(dá)88天，但衰變能量只有32P的1/10，所以靈敏度比32P低。第二，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，用放射自顯影需要較長(zhǎng)的曝光時(shí)間（1～15天），35S的曝光時(shí)間更長(zhǎng)，所以為了防止凝膠中的核酸擴(kuò)散，一般放置-70℃的冰箱中曝光。第三，能生產(chǎn)的單位少，價(jià)格較昂貴，特別是α-32P標(biāo)記的dATP（400 Ci/mmol）。第四，放射性同位素對(duì)人體有害，實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境易被污染，放射性廢物處理困難，因此，推廣使用受到限制。放射性檢測(cè)現(xiàn)多用于DNA分子雜交（Southern雜交和Northern雜交）、分子標(biāo)記、文庫(kù)篩選和DNA測(cè)序，也可以進(jìn)行回收制備。

五、地高辛檢測(cè)法

地高辛（Digoxigenin,DIG）是一種從洋地黃類(lèi)植物（毛地黃和毛花毛地黃）中提取的類(lèi)固醇物質(zhì)。由于該植物的花和葉片是DIG在自然界中的唯一來(lái)源，因此抗DIG的抗體不會(huì)與其他的生物物質(zhì)結(jié)合，從而可以滿(mǎn)足特異性標(biāo)記的需要。DIG分子是通過(guò)自身一個(gè)含有11個(gè)碳原子的空間臂與尿嘧啶核苷酸上的C5位置相連，DIG標(biāo)記的核苷酸可以通過(guò)末端標(biāo)記法、缺口平移標(biāo)記法、隨機(jī)引物標(biāo)記法或者PCR方法摻入到核苷酸探針中，然后利用探針去檢測(cè)轉(zhuǎn)移到膜上的特定核酸。

對(duì)于DIG標(biāo)記探針的雜交檢測(cè)，可選用連接有堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）、過(guò)氧化物酶（peroxidase）、熒光素（fluorescein）、若丹明（rhodamine）或是膠體金（colloidal gold）等高親和性的抗DIG抗體共軛物，也可選用不帶任何共軛連接的抗DIG抗體和二級(jí)抗體。

檢測(cè)的靈敏度主要依賴(lài)于對(duì)不同抗DIG抗體共軛物顯示方法的選擇，以連接有堿性磷酸酶的抗DIG抗體為例，既可以使用NBT或BCIP做底物的顯色法，也可以使用HNPP熒光堿性磷酸酶底物，檢測(cè)的靈敏度常規(guī)可達(dá)到0.1 pg（Southern雜交）。

利用DIG標(biāo)記的dNTP嵌入DNA序列，然后利用免疫化學(xué)顯色，或利用X光片通過(guò)發(fā)光法來(lái)檢測(cè)DNA，檢測(cè)效果與放射性效果一樣，安全無(wú)放射性污染，靈敏度高，但成本較高，一般用于分子標(biāo)記和文庫(kù)篩選。

與放射性標(biāo)記和檢測(cè)技術(shù)相比較，DIG靈敏度高，完全可滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要，某些方面甚至可與放射性標(biāo)記的靈敏度相媲美。此外，DIG標(biāo)記還有如下優(yōu)點(diǎn)：曝光時(shí)間短，結(jié)果顯示的時(shí)間是以分鐘計(jì)算，無(wú)須幾小時(shí)甚至幾天的自顯影過(guò)程；安全環(huán)保，不接觸放射性物質(zhì)，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染；探針可重復(fù)使用，最少可以穩(wěn)定儲(chǔ)存一年；可輕松進(jìn)行探針剝離和重探。

六、熒光標(biāo)記法

利用熒光染料標(biāo)記的核苷酸摻入到核苷酸鏈中，然后利用特定波長(zhǎng)的激光激發(fā)熒光來(lái)檢測(cè)DNA。熒光檢測(cè)一般需要專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)設(shè)備，所以熒光標(biāo)記法主要用于熒光定量PCR和DNA自動(dòng)化測(cè)序。熒光標(biāo)記法還可以把4種核苷酸標(biāo)記成4種不同的顏色，以更好識(shí)別不同的核苷酸，例如在自動(dòng)化測(cè)序中，4種雙脫氧核苷酸標(biāo)記成4種不同的顏色，使得四種熒光染料的測(cè)序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測(cè)序的精確度。