第二節(jié)　影響核酸電泳的因素

帶電的核酸分子在一定的電場下，其遷移速率受多種因素的影響，主要因素有以下幾方面：

一、核酸分子大小和構(gòu)型

從U=αQ/（6πrη）公式中可以知道，影響電泳中核酸分子移動速率的因素包括核酸分子的大小、電荷數(shù)、顆粒形狀和空間構(gòu)型。一般而言，電荷密度愈大，電泳移動速率越快，但是由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相對分子質(zhì)量相同的雙鏈DNA幾乎具有等量的電荷密度，即使相對分子質(zhì)量不同，核酸分子的電荷密度差異也不大，所以核酸分子的電荷密度對電泳移動速率的影響不明顯，例如，對于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān)，而與堿基排列及組成無關(guān)。

在一定的電場強(qiáng)度下，電泳中DNA分子的遷移速度主要取決于凝膠對核酸分子的分子篩效應(yīng)。分子篩效應(yīng)與DNA分子本身的大小和構(gòu)型有關(guān)，對線形的核酸分子來說，核酸分子的遷移速度與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。

在正常的電泳條件下相對分子質(zhì)量相同但構(gòu)型不同的質(zhì)粒（plasmid）DNA分子，電泳移動速率的大小順序為：閉環(huán)質(zhì)粒分子（ccDNA）＞線性質(zhì)粒分子（LDNA）＞單鏈開環(huán)的質(zhì)粒分子（ocDNA），但是由于質(zhì)粒在電泳的移動速率還與提取質(zhì)粒的狀況、瓊脂糖濃度、電場強(qiáng)度、EB和緩沖液有關(guān)，如果在非正常電泳的條件下有可能會出現(xiàn)相反的情況。一般來說，相對分子質(zhì)量在10 kb以下的質(zhì)粒在較低濃度的瓊脂糖凝膠上電泳，質(zhì)粒DNA的遷移速度比相對分子質(zhì)量相同的線性分子快20%～30%。凝膠電泳正是利用這一特點不僅可分離相對分子質(zhì)量不同的DNA分子，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。

二、凝膠的類型和濃度

凝膠的類型及濃度對核酸電泳的影響主要是通過分子篩效應(yīng)的影響，瓊脂和聚丙烯酰胺都可以通過濃度的改變來制成篩孔大小各異的凝膠，在篩孔大的凝膠中，核酸遷移速度快，篩孔小的遷移速度慢。不同的凝膠及濃度不同，篩孔的數(shù)目也不同，產(chǎn)生的分子篩效應(yīng)不同。

DNA的遷移率與凝膠濃度的關(guān)系可用公式

logU=logUoKrT

表示。U：遷移率；Uo：DNA的自由電泳遷移率；T：膠濃度；Kr：介質(zhì)阻滯系數(shù)，它是與凝膠性質(zhì)、樣品相對分子質(zhì)量、形狀等有關(guān)的常數(shù)。由此可見DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度呈線性關(guān)系，同一DNA分子的遷移速度在不同濃度的凝膠中各不相同，因此凝膠濃度的選擇取決于要分離DNA分子的大小。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度的凝膠，達(dá)到可以分離不同相對分子質(zhì)量核酸分子的目的。在瓊脂糖凝膠電泳中，分離小于0.5 kb的DNA片段所需膠濃度是1.2%～1.5%，分離大于10 kb的DNA分子所需膠濃度為0.3%～0.7%，DNA片段大小在兩者之間則所需膠濃度為0.8%～1.0%；在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，分離小于30 bp的DNA片段所需膠濃度是15%～20%，而大于0.5 kb的DNA片段所需膠濃度是2%～2.6%。瓊脂糖凝膠濃度的選擇大致可參考表2-3，需要注意的是不同廠家生產(chǎn)的瓊脂糖其純度不一樣，對電泳也會產(chǎn)生不同的影響。聚丙烯酰胺凝膠的篩孔主要是由Acr與Bis的相對比例決定，還受到凝膠濃度的影響，其濃度的選擇可參考表2-4來選擇。

表2-3　不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍

注：瓊脂糖凝膠濃度為質(zhì)量濃度（m/V）。表2-4同。

表2-4　不同濃度聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍

三、電場的電壓和方向

在低電壓時，核酸分子的遷移速率主要受分子篩效應(yīng)的影響，而受分子的電荷效應(yīng)影響較小，因此在較低電壓和相對分子質(zhì)量較小的核酸分子電泳時，線狀核酸分子的遷移速率與所加電壓成正比。隨著電場強(qiáng)度的增加，核酸分子的遷移率受電荷效應(yīng)影響也會加大，表現(xiàn)出相對分子質(zhì)量不同的核酸分子的遷移率的增加幅度是不同的，相對分子質(zhì)量越大的片段，隨著電壓升高引起的遷移率升高幅度也越大，由此可見增加電壓可以使凝膠的有效分離范圍縮小。例如，在瓊脂糖凝膠電泳中，要使大于2 kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不應(yīng)超過5 V/cm；分離50 kb以上大分子的DNA片段，采取較低的電壓（0.5～1.0 V/cm）和較長的瓊脂糖凝膠才能取得很好的分離效果。需要注意的是，在5 V/cm的場強(qiáng)下雖能得到結(jié)果，但分辨率不高，因此在需要精確測定DNA分子大小或要求高的分辨率時，應(yīng)降低電泳的電壓至1 V/cm，并適當(dāng)延長電泳距離和時間。

如果電場方向是恒定的，大于50～100 kb的DNA分子在瓊脂糖凝膠上遷移速率幾乎是相同的，也就是說此時無法分辨DNA的大小，所以在真核生物總DNA電泳時只能看到一條DNA條帶，而看不到不同的染色體條帶。如果電泳的電場方向周期性改變，則DNA分子的移動方向被迫周期性改變，經(jīng)過的路徑也更大，由于相對分子質(zhì)量大的DNA分子，適應(yīng)新的電場方向所需的時間長，通過脈沖電場就可以分辨相對分子質(zhì)量更大的DNA分子（達(dá)到10000 kb）。用于大片段DNA分離的脈沖電場電泳有以下兩種電泳方式：倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE），用于分離10～2000 kb的DNA分子；鉗位均勻電場電泳（CHEF），可分離大于10 Mb的DNA分子。通常，脈沖電場電泳用以鑒定、分離制備大于50 kb的DNA大分子。

四、電泳緩沖液的離子強(qiáng)度

為了保持電泳過程中待分離生物大分子的電荷以及電泳環(huán)境pH的穩(wěn)定性，電泳緩沖液通常要保持一定的pH和離子強(qiáng)度。電泳緩沖液的離子強(qiáng)度一般在0.02～0.2mol/L，離子強(qiáng)度過低不僅緩沖能力差，還會導(dǎo)致電流太小，電泳緩慢，如果用蒸餾水配制凝膠和電泳，DNA幾乎不移動；離子強(qiáng)度過高，會在待分離分子周圍形成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），由于離子氛與待分離分子的移動方向相反，它們之間產(chǎn)生了靜電引力，使得DNA分子的移動速率降低。如果誤用沒有經(jīng)過稀釋的電泳緩沖液的母液來制膠和電泳，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中，不僅DNA分子電泳緩慢，而且電導(dǎo)率高，導(dǎo)致電流過大，產(chǎn)生大量的熱量，嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性，另外高離子強(qiáng)度緩沖液的黏度也會對電泳速度產(chǎn)生影響。

使用稀釋倍數(shù)過大的緩沖液進(jìn)行電泳，DNA電泳條帶的帶型會變粗且松散；如果用稀釋倍數(shù)不夠的緩沖液來制膠，電泳都表現(xiàn)為使DNA分子電泳變得緩慢，如用2×TAE或者1×TBE來作為電泳緩沖液，會導(dǎo)致DNA的移動速率降低，但是得到的DNA條帶帶型會更緊湊。因此在進(jìn)行DNA雜交實驗中，為了使帶型更緊湊，提高分辨力，可以用2×TAE或者1×TBE，但電泳需要在更低電壓的條件下進(jìn)行，并延長電泳時間。

五、核酸染料

EB是核酸電泳中最常用的染料，它會嵌入到核酸堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng)，還會使線狀DNA遷移率降低15%。當(dāng)DNA分子中嵌入的EB分子逐漸增多時，原來為負(fù)超螺旋狀態(tài)的分子開始向共價閉合環(huán)狀轉(zhuǎn)變，電泳遷移速度由快變慢；當(dāng)嵌入的EB分子進(jìn)一步增加時，DNA分子由共價閉合環(huán)狀向正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變，這時電泳遷移速率又由慢變快。這個臨界點的游離EB的質(zhì)量濃度為0.1～0.5 g/mL，即電泳時所加的濃度。由于EB嵌入堿基會使超螺旋DNA解鏈，使遷移率下降，同時由于電荷的中和，也會影響到DNA的遷移，其對線狀分子與開環(huán)分子影響較小而對超螺旋態(tài)的分子影響較大。一般的電泳可以忽略EB對電泳的影響，而對于特殊電泳，為了更為準(zhǔn)確地比較DNA的相對分子質(zhì)量，最好在無EB的狀況下電泳，電泳完畢再進(jìn)行染色。

需要注意的是，由于EB是帶正電的分子，在電場中向負(fù)極移動，如果在凝膠中或者電泳緩沖液中添加EB，長時間電泳后，正極的EB濃度升高，背景加深，而負(fù)極EB濃度降低，背景降低，拍出來的電泳圖像中膠的正負(fù)兩端背景差異很大。

目前除了EB外，還出現(xiàn)多種可以代替EB的無毒化學(xué)染料，不同的染料對電泳DNA條帶的影響有所不同，不同染料在不同的電壓與不同載樣量下對電泳的帶型扭曲程度、分辨率以及帶型的影響也有所不同，所以在使用上要注意積累一定的經(jīng)驗。為了避免染料對電泳中DNA條帶的影響，最好采用電泳后再染色的觀測方法。

六、樣品組分和加樣量

與其他的電泳一樣，核酸電泳同樣會受到樣品組分的影響。如果提取的DNA純度太差，含有較多的蛋白質(zhì)或多糖類物質(zhì)，可能會使DNA滯留在膠孔中；如果樣品里含有較高的鹽濃度，會拖慢DNA的遷移并使鄰孔內(nèi)的DNA產(chǎn)生變形條帶；同一樣品使用不同的溶液溶解或上樣，也會影響電泳時DNA的遷移速度，得到不同的電泳帶形。

加樣量一般是根據(jù)加樣孔的大小、DNA片段大小和需要加樣量的多少來確定，當(dāng)加樣孔大時需要的DNA加樣量也要相應(yīng)加大，否則會造成DNA電泳條帶過淺，甚至看不到電泳條帶。相反，加樣孔小時可以適當(dāng)減少樣品的加樣量。需要注意的是，即使加樣孔夠大，加樣量過多會造成膠孔的超載，從而導(dǎo)致電泳的條帶拖尾或者彌散達(dá)不到分離的目的，對于大片段的DNA影響更大。一般每一個制膠模具均配有多個齒型大小不同的梳板，梳板齒寬厚則形成的加樣孔體積大，梳齒窄薄則形成的加樣孔體積小，梳板的選擇主要根據(jù)加樣體積來確定，一般來說，當(dāng)加樣量小時盡量選擇薄的梳板，這樣獲得電泳條帶清晰，便于照相和結(jié)果分析。

七、上樣緩沖液

電泳樣品需要按一定比例和上樣緩沖液混勻后再加到膠孔中，上樣緩沖液主要由指示劑和沉淀劑組成。指示劑常用的有溴酚藍(lán)和二甲苯青FF，沉淀劑常用30%甘油或40%蔗糖，有些上樣緩沖液含有10 mmol/L的EDTA,EDTA可以螯合Mg2+，防止電泳過程中DNA被降解。使用上樣緩沖液有三個作用：第一，增大樣品密度，以確保DNA均勻沉淀到膠孔；第二，使樣品帶顏色，使加樣容易；第三，通過指示劑可以判斷電泳進(jìn)程（參見表2-1，表2-2）。

上樣緩沖液不會對電泳的遷移率產(chǎn)生影響，不同的凝膠或者不同的核酸電泳會采用不同上樣緩沖液。選用哪一種指示劑純屬個人喜好，但是，不同的凝膠電泳使用的緩沖液成分也有所不同，所以應(yīng)根據(jù)實驗中電泳凝膠的類型和核酸類型來選擇相應(yīng)的上樣緩沖液，如在RNA甲醛凝膠電泳中要使用甲醛凝膠加樣緩沖液，而用堿性凝膠時應(yīng)當(dāng)使用溴甲酚綠作為示蹤染料，因為在堿性pH條件下，其顯色較溴酚藍(lán)更為鮮明。目前有些商品化的上樣緩沖液會添加一定濃度的SDS（十二烷基硫酸鈉），其目的是減少蛋白質(zhì)對DNA電泳的影響，而在大片段電泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可有效減少DNA條帶的彎曲和拖尾現(xiàn)象。

八、其他因素

除了以上常見的主要影響因素會影響到電泳之外，還有一些其他容易被忽略的因素也會影響到電泳的結(jié)果，如溫度和電滲等都會對電泳產(chǎn)生一定的影響。由于支持介質(zhì)表面可能會存在一些帶電基團(tuán)，瓊脂可能會含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si—OH基團(tuán)，在pH＞3時，這些基團(tuán)電離會使支持介質(zhì)表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子，在電場的作用下向電極方向移動，形成介質(zhì)表面溶液的流動，這種現(xiàn)象就是電滲。這時可用不帶電的有色染料或有色葡聚糖點在支持物的中心，以觀察電滲的方向和距離。聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳比瓊脂糖水平電泳更容易受電滲的影響，所以在進(jìn)行長度較大的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，一般先用硅烷溶液處理玻璃板再制膠，這樣不僅可以使制膠更容易，能減少電滲的影響，還可以使電泳完畢后卸膠時更容易，減少凝膠破裂的可能性。

正常的溫度對電泳的影響不大，但是溫度過高會影響到溶液的黏度，特別會使介質(zhì)黏度降低，分子運(yùn)動加快，引起自由擴(kuò)散變快，遷移率增加。電泳中產(chǎn)生的熱通常是由中心向四周散發(fā)的，所以介質(zhì)中心溫度一般要高于四周，尤其是管狀電泳，由此引起中央部分介質(zhì)相對于四周部分黏度下降，摩擦系數(shù)減小，電泳遷移速度增大。由于中央部分的電泳速度比邊緣快，所以電泳分離帶通常呈弓形。降低電流強(qiáng)度，可以減小生熱，但會延長電泳時間，引起待分離生物大分子擴(kuò)散的增加，影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶鰪?qiáng)度，同時可以適當(dāng)冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。一般的電泳溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響，通常電泳可在室溫下進(jìn)行。只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5%或者使用低熔點瓊脂糖凝膠時，為增加凝膠硬度，防止電泳產(chǎn)生的熱量融化凝膠，可在低的溫度條件4℃進(jìn)行電泳。但是在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，為了保持凝膠對雙鏈DNA的變性作用，保證單鏈DNA的分離效果，則需要在較高的溫度（60℃左右）條件下進(jìn)行電泳。

凝膠厚度也會對電泳產(chǎn)生影響，如在瓊脂糖凝膠電泳中，小于5 mm時，凝膠太薄，凝膠易碎，還會導(dǎo)致加樣孔太小，造成加樣的困難和樣品之間容易污染；大于7 mm時，凝膠太厚，不但會浪費(fèi)瓊脂糖凝膠，還會造成核酸泳動速度慢，電泳需時長，條帶松散不清楚，易造成拖尾現(xiàn)象，不易于觀察。

此外，還有電泳裝置的質(zhì)量也會對電泳產(chǎn)生一定的影響，如鉑金絲太細(xì)會導(dǎo)致電泳變慢，不平直會影響到帶型的平整。太小的電泳槽，由于緩沖液少而緩沖能力差，不適合長時間電泳。垂直電泳對電泳槽的質(zhì)量要求更高，玻璃板側(cè)面漏電會容易形成“八”字形的電泳帶型，對于大于1000 V以上的高壓電泳（如變性PAGE的測序電泳）影響更大，這時用硅烷溶液處理玻璃板就更重要了，此外還有上下槽的絕緣率等都會對電泳產(chǎn)生一定的影響。