第四節 核酸瓊脂糖凝膠電泳
核酸瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質對核酸進行電泳的方法，其分析原理與其他支持物電泳最主要區別是，瓊脂糖凝膠兼有分子篩和電泳的雙重作用。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2～20 kb，利用脈沖電泳，可分離10 Mbp以上的DNA片段。
一、瓊脂糖的種類
瓊脂糖凝膠電泳的主要作用有：第一，根據已知分子大小的標準DNA對樣品DNA的大小進行測定；第二，用標準DNA對樣品DNA量進行估算；第三，回收純化目的DNA片段。
早期的電泳載體為天然瓊脂（agar），它是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象而影響電泳速度及分離效果。所以目前的電泳都是使用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的鏈狀多糖，含硫酸根比瓊脂少，因而分離效果明顯提高。
用于核酸電泳的瓊脂糖不能檢測到明顯的DNase和RNase活性，如果是用于檢測型電泳要考慮電內滲和凝膠的強度，而用于制備性電泳要考慮瓊脂糖的純度和類型。目前商品化瓊脂糖的種類繁多，不同公司的產品或者不同型號的產品，其雜質含量不同，制備凝膠的強度、分辨DNA的能力和熒光背景的強度都不同，因此要根據實驗用途加以選擇使用。需要注意的是，即使是相同的商品名稱，不同廠家生產的瓊脂糖其純度也是不一樣的，對電泳也會產生不同的影響。不同類型瓊脂糖對DNA電泳的影響可以參照表2-5。
表2-5 不同類型瓊脂糖分離線性DNA片段大小的范圍
瓊脂糖的分類按其熔點可分為：標準熔點瓊脂糖和低熔點瓊脂糖，按其純度可分為標準瓊脂糖和高純度瓊脂糖。商品化的瓊脂糖主要分成以下類型：
標準瓊脂糖，熔點約為90℃，1%凝膠強度≥1200g/cm2，硫酸鹽≤0.15%，電內滲EEO（-mr）≤0.15，不能檢測到明顯的DNase和RNase活性。
低熔點瓊脂糖（LMP），熔點為≤65℃，1%凝膠強度≥200 g/cm2，硫酸鹽≤0.10%，電內滲EEO（-mr）≤0.1，不能檢測到明顯的DNase和RNase活性。低熔點的瓊脂糖可以在65℃時熔化，熔化后，在37℃可保持液態數小時，因此其中的樣品如DNA可以重新溶解到溶液中回收，這樣可以在電泳后從瓊脂糖凝膠中回收特定的DNA條帶用于以后的克隆操作。雖然現在的瓊脂糖回收試劑盒可以用于標準瓊脂糖的DNA回收，但低熔點瓊脂糖一般純度更高，熔點更低，而65℃低于大多數核酸Tm，因此用于DNA片段，特別是較大的DNA片段回收的效率更高。
有些純度較高的低熔點瓊脂糖，可直接在重熔的瓊脂糖中進行DNA克隆操作，無須DNA的抽提純化步驟，如直接在重熔的瓊脂糖進行酶切、連接和轉化，也可以直接進行PCR反應等。有些高分辨的低熔點瓊脂糖，能有效地分辨10～1000 bp的DNA片段，適合用于小DNA片段的分離和回收。
有些低黏度、低熔點瓊脂糖，它是經化學修飾后，純度更高，熔點更低的瓊脂糖，熔點≤50℃，1%凝膠強度≥75 g/cm2，電內滲EEO（-mr）≤0.05，能夠分辨更小的DNA片段（小于10 bp），可直接在重熔的瓊脂糖中進行克隆操作，無須DNA的抽提步驟，也可以用于細胞的封裝和包埋后電泳。
高強度瓊脂糖比標準熔點瓊脂糖具有更高的熔點，一般熔點在95℃以上，其凝膠強度更高，1%凝膠強度≥1300 g/cm2，相同濃度下比標準熔點瓊脂糖對DNA的阻尼性更強，分辨率更高，適用于鑒定小于1 kb的DNA片段。
隨著技術的發展和更專業的實驗要求，目前針對不同用途開發了各種類型的瓊脂糖凝膠。總的來說，低熔點凝膠對DNA的回收效率更高、更方便；高純度凝膠適合直接在重熔的凝膠中進行DNA后續的酶促反應；高分辨率凝膠可以讓DNA條帶更加清晰；高強度凝膠可以方便操作；低電滲的凝膠能使DNA條帶電泳更快，縮短電泳時間。
二、電泳緩沖液組分
電泳緩沖液是指在進行核酸電泳時所使用的緩沖溶液，用以穩定體系酸堿度。緩沖液的組成和離子強度直接影響DNA遷移率。雖然Tris-Cl是最常用的緩沖液體系，但由于其中的Cl-泳動速率比樣品分子快很多，容易引起電泳帶型的不均一現象，所以電泳緩沖液常采用含有EDTA的Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）或者Tris-磷酸（TPE）緩沖液體系來進行雙鏈DNA電泳。緩沖液的EDTA可以螯合Mg2+等二價離子，以防止其在電泳時激活DNase降解DNA，此外還可防止Mg2+與核酸生成沉淀，Na+使緩沖液有一定的導電性。
TBE的緩沖能力強，適合用于長時間電泳（如過夜），并且當用于小于1 kb的片段時分離效果更好，但TBE容易造成高電滲作用，并且因與瓊脂糖相互作用生成非共價結合的四羥基硼酸鹽復合物而使DNA片段的回收率降低，所以不適用于對DNA回收率要求較高的電泳。此外，由于硼離子對T4 DNA連接酶有抑制作用，如果硼離子去除不徹底會影響到連接效率，所以若制備的DNA片段需用于連接反應，最好使用TAE緩沖液。
TPE的緩沖能力強，適于長時間電泳，但TPE含磷酸鹽濃度高，容易使DNA發生沉淀，也不適用于DNA的回收。
TAE是使用最廣泛的緩沖液，其特點是超螺旋DNA在TAE中分辨率比在TBE中好，測得的分子大小更接近于實際，用TBE電泳時，分子大小的測量值會大于實際值。雙鏈線狀DNA在TAE緩沖液中的遷移率較其他兩種緩沖液快約10%，大于13 kb的DNA片段用TAE緩沖液電泳將取得更好的分離效果。TAE的缺點是緩沖容量小，不適合長時間電泳（如過夜），如需長時間電泳必須要有循環裝置，使兩極的緩沖液得到交換。
電泳緩沖液通常配成濃縮液于室溫保存，TAE為50×，TPE為10×，TBE為5×，但TBE濃縮液長時間保存會發生沉淀，不適宜長期保存。緩沖液的工作濃度TAE為1×，TPE為1×，TBE為0.5×。
由于RNA易降解，所以RNA的電泳比DNA的電泳操作復雜。用于RNA電泳的電泳槽需用去污劑溶液洗凈，用水沖洗，乙醇干燥，然后灌滿3%H2O2，于室溫放置10 min，再用經DEPC處理的水徹底沖洗。
RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進行。非變性電泳使用1.0%～1.4%的凝膠，不同的RNA條帶即能分開，但無法判斷其分子大小。只有在完全變性的條件下，RNA的泳動率才與分子大小的對數呈線性關系，因此要測定RNA的分子大小，一定要用變性凝膠，而在需快速檢測所提總RNA樣品完整性時，配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可。
RNA變性凝膠電泳緩沖液采用MOPS緩沖液，10×的MOPS緩沖液組成：0.4 mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS）（pH7.0），0.1 mol/L NaAc，10 mol/L EDTA，用甲醛或乙二醛加上二甲基亞砜（DMSO）作為變性劑。乙二醛-DMSO凝膠比含有甲醛-DMSO凝膠更難于進行電泳，因為RNA在乙二醛-DMSO凝膠中泳動速率較慢，而且需將電泳液進行循環以避免電泳過程中形成過高的H+梯度，盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率，但用含有乙二醛-DMSO的凝膠對RNA進行電泳分離，通常Northern雜交所顯示的RNA條帶更為銳利。需要注意的是，乙二醛可與EB發生化學反應，所以制膠和電泳過程中避免使用EB，應選擇電泳后染色。
三、凝膠的染色方法
瓊脂糖凝膠的染色方法（以EB為例）有兩種，一種是電泳后染色，一種是染色與電泳同時進行。
電泳完畢將凝膠放到含0.5μg/mL EB的電泳緩沖液或水中，于室溫下染色20～40 min，即可置于紫外燈下觀察。若再用水浸泡20 min可以減少背景，提高檢測的靈敏度。當EB太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30 min后再觀察。EB濃度過高會增加背景，過低會使DNA染色不足，都會降低EB檢測的靈敏度。
在瓊脂糖熔化后加入EB至終濃度0.5μg/mL，制好膠，然后加樣電泳，電泳結束就可以直接在紫外燈下觀察；也可以在電泳槽的電泳緩沖液里加入EB至終濃度0.5μg/mL，然后放入瓊脂糖凝膠上樣電泳，電泳結束后也可在紫外燈下直接觀察。染色與電泳同時進行可以在電泳過程中隨時觀察核酸遷移情況，EB帶正電荷，在電場中向正極移動，電泳時間長后正極EB的濃度升高，背景會加深，而負極EB濃度降低，背景降低。
EB的正電荷可中和核酸分子的負電荷，同時由于它的嵌入增加了核酸分子的剛性，所以在含EB的膠內電泳，核酸的遷移速度減慢，如雙鏈線狀DNA遷移速度減慢約15%。因此，用電泳方法測定核酸分子大小時，應在電泳后染色更為準確。另外，在凝膠中未與核酸結合的EB向負極泳動，會使樣品中各條帶染色不均勻，故此法也不宜用于根據熒光強度定量檢測核酸。
四、瓊脂糖的脈沖電泳
脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）是一種分離大分子DNA的電泳方法。在普通的凝膠電泳中，電場方向是恒定的，大于50 kb的DNA分子移動速度相近，不同分子的DNA很難分離形成足以區分的條帶。1984年，Schwartz和Centor發明了交變脈沖場凝膠電泳技術。與常規的恒定直流單向電場凝膠電泳不同，交變脈沖場凝膠電泳加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場方向、電流大小以及作用時間都在交替地變換著，每次電流方向改變后持續1 s到5 min左右，然后再改變電流方向，反復循環，這種電場稱為脈沖式交變電場，這種電泳也稱為PFGE。在PFGE中，電場不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個方向）變動。相對較小的分子在電場轉換后可以較快轉變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉向較為困難，因此小分子向前移動的速度比大分子快。
PFGE可以用來分離大小從10 kb到10 Mb的DNA分子，也可以應用于通過細胞的包埋電泳來分離真核生物的染色體。PFGE可以對人類染色體內切酶物理圖譜分析，并將大片段DNA分子直接克隆，是人類基因組序列測定工程中有效的方法之一；還可以探測細胞染色體上百萬堿基對以上的基因組DNA的缺失；適于單向電場電泳難以分辨的DNA物理圖譜的制作等。
瓊脂糖凝膠中電泳主要是利用分子篩的效應來分離DNA，普通的恒定直流單向電場凝膠電泳使DNA分子在凝膠中泳動的受力和方向都不發生變化，大分子DNA分子在電場作用下通過孔徑小于分子大小的凝膠時，將會改變無規卷曲的構象，沿電場方向伸直，與電場平行才能通過凝膠，此時，大分子DNA（大于20 kb，有些情況大于40 kb）通過凝膠的方式相同，分子篩效應相同，遷移率無差別（也稱“極限遷移率”），從而影響凝膠電泳分離大于20 kb的大分子DNA片段的效果。
PFGE施加在凝膠上至少有兩個電場方向，時間與電流大小也交替改變，使得DNA分子必須隨時調整其泳動的方向，來適應凝膠孔隙的無規則變化，與小分子的DNA相比，大分子DNA需要較多的次數來更換其構型和方位，使之能夠按新的方向游動，所以遷移率變慢，從而達到了分離大分子DNA的目的。
PFGE正是基于不同DNA大小的差異來分離不同DNA分子。在交變脈沖電場中，線性分子改變形狀和泳動方向所需時間與其分子大小大致成正比，大分子線性DNA改變泳動方向所需時間比小分子線性DNA要長，因為前者變形能力低于后者。當某一線性DNA在脈沖場中改變形狀、調整方向、進行遷移所需的時間大于脈沖場脈沖維持時間時，DNA的遷移速度將減為最低。當DNA分子變形、轉向所需時間與脈沖時間較接近時，遷移率與DNA相對分子質量成反比。因此，根據被分離DNA分子的范圍選擇適當的脈沖時間，經過較長時間不斷變形、轉向、泳動，不同大小的DNA就被分離。在普通的凝膠電泳中，DNA走過的路線是直線的；在PFGE中，DNA走過的路線是“之”字形的，但其凈遷移方向與普通電泳一樣，垂直于樣品孔，略彎。
影響PFGE分辨率的因素包括幾方面：兩個脈沖場的均一性；兩個脈沖場的脈沖時間以及它們之間的比率；兩個脈沖場的強度和方向。為了增強PFGE對大小差異較大的DNA樣品的分辨率，可采用交變脈沖梯度電場，即在電泳過程中，先用較短的交變脈沖時間使較小的DNA分子分離，然后用較長的交變脈沖時間分離較大的DNA分子。
Schwartz等最先設計的脈沖電場凝膠電脈裝置采用了交變脈沖垂直定向電場和線電極，但由于其產生的電場不均一，導致其分辨力降低。為此，人們又研制出多種其他脈沖電場電泳裝置。具有比較典型特征的類型有以下幾種：
（1）反轉電場凝膠電泳（field inversion gel electrophoresis,FIGE）。
這種電泳舍棄了電場垂直或正交排列，交變電場均一，并且是180°反向的，從而使DNA沿相當筆直的軌跡運動，應用微處理機增加電泳時脈沖的絕對長度并保持正反向脈沖的比例不變，可使分辨力達到最大，能分辨長達200 kb的DNA片段。
（2）鉗位均勻電場電泳（contour-clamped homogeneous electric field,HCEF）。
這種電泳中，由多個在水平凝膠的周圍、沿正方形或正六邊形排列的電極產生電場，這些電極都被鉗制在預定的電位上，正方形排列的電極所產生的電場互為90°，正六邊形排列的電極產生的電場則隨凝膠的位置和電極極性不同而互成120°或60°，在特定的條件下有可能分辨長達5000 kb的DNA分子。
（3）正交交變電場凝膠電泳（orthogonal field alternating gel electrophoresis,OFAGE）。
正交交變電場中，兩交變電場的電流方向相互垂直。OFAGE可用于超螺旋、疏松及線性同等DNA分子的分離，理論上它可以在合適的電泳條件下明顯地分離和區別這三種DNA。
五、DNA瓊脂糖電泳的回收
在DNA克隆操作中，經常需要通過瓊脂糖凝膠電泳分離出目的DNA片段，然后再用凝膠回收。由于瓊脂糖中的酸根和羥基多糖等物質對多種工具酶都有抑制作用，因此，從瓊脂糖凝膠回收DNA包括了DNA的電泳分離和純化兩方面。
近年來，瓊脂糖特別是低熔點瓊脂糖的純度有了很大的提高，有些高純度低熔點瓊脂糖可以在凝膠中直接完成DNA的酶切和連接反應等酶促反應。高純度低熔點瓊脂糖電泳后，將含有DNA條帶的瓊脂糖切下，于65℃保溫熔化，再自然冷卻到室溫就可以直接在熔化的瓊脂糖-DNA混合物中加酶，進行后續實驗，還可以在凝膠中進行各種酶促反應。這種方法反應條件溫和，非常適合大片段DNA的回收。缺點是高純度低熔點瓊脂糖價格較昂貴。
隨著商品化的DNA凝膠回收試劑盒普及，也使得從瓊脂糖凝膠回收DNA片段變得更加簡便，而且回收率高。DNA凝膠回收試劑盒，對300 bp～10 kb的DNA片段回收效率較高，對一些較大或者較小的DNA片段可能效果較差。總之，從瓊脂糖凝膠回收DNA技術仍然是分子生物學中一種重要的技術，應根據自己的實驗要求選擇合適的回收方法。
由于膠回收的質量和數量直接影響后續的一系列實驗——比如酶切連接、轉化篩選、測序或者PCR擴增、標記乃至顯微注射等，所以從瓊脂糖凝膠回收目的DNA片段最基本的要求就是保證回收質量和回收率。
回收產物的質量主要指純度和完整度。普通級別的瓊脂糖的硫酸根和羥基多糖等物質對多種工具酶都有抑制作用，在回收過程中，如果這些物質殘留過多會強烈抑制后續的連接、酶切或者標記、擴增等實驗。此外，極微量的純化介質或混入回收產物中的某些試劑也會對結果產生嚴重的影響。對于大片段DNA回收，還要考慮DNA完整度，在回收過程中，機械剪切力可能會使回收產物斷裂而出現DNA大小不一致。
回收率是指回收得到目的DNA片段的得率，關系到回收得到的目的DNA的量，對于樣品量較小的DNA回收率就顯得更為重要了。無論是采取常規的回收方法還是試劑盒回收方法，都會使部分目的DNA片段受到損失，因而盡可能多地回收電泳凝膠條帶中的目的片段，提高產物得率，對于后續實驗來說是非常重要的。回收率的多少通常和回收產物的大小以及量的多少有關，比如DNA片段越大，和固相基質的結合力越強，就越難洗脫，回收率就低；上樣DNA的量越少，相對損失越大，回收率越低，因此，根據情況選擇不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于樣品的大小和多少對回收率都有顯著的影響，所以回收率并非是一成不變的。影響瓊脂糖DNA回收率有兩個關鍵因素：
第一，瓊脂糖的質量。瓊脂糖的質量影響到DNA分子的回收率，低熔點瓊脂糖高于普通瓊脂糖，高純度瓊脂糖高于普通瓊脂糖，割膠越少回收率越高。
第二，回收目的DNA片段的分子大小。DNA片段分子太大或太小都會影響其回收率，當大于20 kb或小于100 bp時，回收率都是明顯降低的。
需要注意的是，目前常用柱式膠試劑盒對小片段和大片段DNA的回收率都較低，小片段的DNA分子和純化膜的結合力較差，導致回收率低；而超過10 kb的大片段DNA，由于與純化膜的結合力過強，不容易被洗脫下來，在離心過柱時可能被“扯斷”，因此常規的離心過柱的方法并不適合大片段DNA的回收。大片段DNA，特別是大于30 kb的DNA片段的回收，可以采用經典的膠回收方法。
（1）低熔點瓊脂糖回收法。
傳統的低熔點瓊脂糖回收法有挖塊法和直接法，由于早期低熔點瓊脂糖較昂貴，所以一般是用挖塊法回收DNA。即首先進行普通的瓊脂糖凝膠的電泳，在長波紫外光下觀察DNA電泳狀況，當電泳到一定區間時，在DNA條帶前面的凝膠上挖一個小孔，將熔化的低熔點瓊脂糖倒入小孔補平，繼續電泳，待DNA條帶進入低熔點瓊脂糖后，切下含有DNA的低熔點瓊脂糖，加入5倍體積的TE溶液，在65℃熔解低熔點瓊脂糖；然后分別用飽和酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次；再用乙醇和醋酸銨來沉淀DNA；用70%乙醇漂洗后風干，用水溶解即得回收的目的DNA片段。含有DNA的低熔點瓊脂糖膠塊也可以用瓊脂糖酶來處理，其反應條件更溫和，但瓊脂糖酶的價格高，而且瓊脂糖酶只適合純度較高的低熔點瓊脂糖。
目前DNA膠回收試劑盒已經非常普及，不需要低熔點瓊脂糖，不需要有機溶劑抽提，實驗步驟也十分簡單。大多數試劑盒都可以用于普通瓊脂糖中DNA的回收，DNA在普通瓊脂糖中電泳，然后在紫外燈下切下含有DNA條帶的膠塊，利用試劑盒附帶的溶液和柱子來純化目的DNA片段，但其回收的純度和回收率稍低于低熔點瓊脂糖，對連接率和回收量要求較高的最好使用高純度的低熔點瓊脂糖。
低熔點瓊脂糖直接法的實現得益于高純度低熔點瓊脂糖產品的出現，其回收步驟更簡單，電泳后，直接將條帶切下65°保溫熔化，然后可以直接在熔化的瓊脂糖-DNA混合物中加酶進行后續實驗。低熔點瓊脂糖直接法不需要經過DNA抽提，減少抽提過程的DNA損失，非常適合大片段DNA的回收，但是這種高純度低熔點瓊脂糖產品，所謂的GTG就是遺傳技術級瓊脂糖，價格仍較昂貴。
（2）電洗脫法。
電洗脫法一般是將電泳分離后含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠切割下來，裝于透析袋中，繼續在高電壓下電泳，這時目的DNA會從凝膠中電泳出來并進入透析袋中，由于DNA分子大（一般用于＞5 kb的片段），不能透過透析袋，保留于透析袋中。取出透析袋中含DNA的溶液，用乙醇沉淀或者進一步用酚/氯仿抽提純化后用乙醇沉淀。這種回收方法效率較低，只適合用于大片段和量較大的DNA的回收，也是傳統手工操作DNA回收方法之一。
（3）試劑盒法。
目前的回收試劑盒都是屬于洗脫型回收法，它用能吸附核酸的特定膜或者填料來代替有機溶劑的抽提，回收率可以達到70%～90%。目前商品化的試劑盒種類非常多，根據其吸附核酸的材料不同可以分為膜式回收試劑盒和玻璃奶純化填料膠回收試劑盒。
膜式回收試劑盒操作簡單快速，只需要將電泳凝膠中的產物條帶切下，用溶解緩沖液徹底溶解，加到有能吸附DNA純化膜的純化柱中，離心，再洗滌一次，離心后用洗脫緩沖液洗脫，得到的純化產物溶液可以直接用于后續實驗。柱回收試劑盒回收快速、簡單，結果穩定，整個過程不需要什么技巧，大約10 min就可以完成純化過程，因而是目前商品膠回收試劑盒使用最多的方法，但是這個方法更適用于0.5～15 kb的DNA片段的回收。
與柱回收試劑盒相比，玻璃奶純化填料膠回收試劑盒可以根據每次回收實驗時預期回收量來調整純化填料的量，使得實驗不受限于柱子的載量，也不會造成浪費。玻璃奶純化填料膠回收試劑盒的操作步驟基本上和膜式膠回收試劑盒一樣，將電泳凝膠的條帶切下，用溶膠緩沖液溶解，然后加入玻璃奶純化填料混合，使其吸附DNA，快速離心沉淀棄上清液，再洗滌一次沉淀，風干沉淀，最后用洗脫液將DNA片段從純化介質中釋放出來，再離心取上清液，就可以得到回收的DNA。這個方法適合不同大小的片段，特別是大片段的回收，但是操作較前者復雜一些，涉及多次離心沉淀和取上清液，有可能會誤吸了微量的沉淀；另外對沉淀的干燥程度也有點技巧，干燥過度則不好洗脫，干燥不夠會殘留有機溶液，影響回收的純度。針對這一缺點，目前已經有了改進版的玻璃奶純化填料膠回收試劑盒，它結合了柱回收的優點，把混合了玻璃奶純化介質的凝膠溶解液加入到一種離心過濾柱上，這種柱子不帶純化填料，只有一層溶液可以通過而玻璃奶不能通過的過濾膜，這樣離心后，溶液被去除，結合有目的DNA的玻璃奶填料留在柱子里，再利用洗脫緩沖液進行離心洗脫得到目的DNA。這種試劑盒避免了單純用玻璃奶純化填料所遇到的問題。只是因為實驗操作較復雜，普及不如膜式的膠回收試劑盒。
需要注意的是，不同的廠家的核酸提取或者回收試劑盒采用的純化材料和試劑不完全相同，回收質量和回收率會有一定的差異，特別是回收小片段和大片段DNA，所以應該根據自己的實驗要求并借鑒他人的使用經驗來選擇合適的回收試劑盒，如果試劑盒不能達到實驗目的，應該考慮經典的回收方法（表2-6）。
表2-6 試劑盒對不同大小的DNA的回收率
（1）二氧化硅。
在離液鹽（如硫氰酸鉀溶液、NaI、NaClO4）的條件下，二氧化硅可以同核酸發生吸附反應，而在低鹽條件下，核酸又可以從濾膜中釋放出來，蛋白質和其他雜質不會被吸附，從而達到純化核酸的目的，可以用于RNA和DNA的提取。將二氧化硅制成硅膠膜后，使用更為方便，而且成本低，目前大多商品試劑盒都是采用硅膠膜作為純化DNA的介質。但是當硅膠膜質量較差時，在洗脫過程脫落的痕量二氧化硅會抑制PCR反應，目前隨著膜技術的發展，硅膠膜的質量也得到了很大的提高，這一問題也得到改善。
（2）氧化鋁。
氧化鋁對核酸有很好的吸附作用，其制成的多孔氧化鋁膜（aluminum oxide membranes,AOM）是一種良好的核酸提取基質，是二氧化硅的替代物而且也不會抑制PCR，但缺點是較硅膠膜的成本高。
（3）玻璃粉或玻璃珠。
玻璃粉或玻璃珠被證實為一種有效的核酸吸附劑，特殊玻璃粉經化學處理制成的玻璃奶懸浮液，能高效、快速吸附DNA，在高鹽溶液中，核酸可被吸附至玻璃基質上，離液鹽碘化鈉或高氯酸鈉可促進DNA與玻璃基質的結合。在該方法中，細胞在堿性環境下裂解，裂解液用醋酸鉀緩沖液中和后，直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板，被異丙醇沉淀的質粒DNA結合至玻璃珠，用80%乙醇抽真空洗滌，除去細胞殘片和蛋白質沉淀，最后用含RNase A的TE緩沖液洗脫與玻璃珠結合的DNA，獲得的DNA可直用于后續的各種酶促反應。
（4）磁珠。
磁珠是無孔、單分散度、聚苯乙烯和二乙烯基構成的超級磁性顆粒，不同類型的磁珠在其表面共價結合有不同基團（—OH-、≡NH、OH（NH2）COOH等），用于共價連接蛋白和核酸配體，其純化原理類似于玻璃奶的純化方式。也有預先共價連接鏈霉親和素的磁珠，可將任何生物素標記的核酸或蛋白吸附在表面；還有的將磁珠用特異性的寡核苷酸探針標記，用于吸附和分離提取特異性的核酸片段，這種方法專一性強，提取純度高。磁珠純化核酸操作較煩瑣，成本也較高，多用于純化mRNA，如利用結合了Biotin-Oligo（dT）探針的磁珠能專一地吸附含有poly（A）結構的mRNA。
①增加電泳時的DNA上樣量。
②切膠時保證膠塊包括完整的DNA條帶前提下，盡量減小膠塊的體積。
③把切下的兩塊或多塊膠熔化后，無論多大的體積都用一根管子，轉移到同一個柱子上。
④溶膠時所加的溶液可多一點，這樣更有利于DNA與膜的結合，不過一般不要超過750μL。
⑤溶膠溶液的鹽濃度、酸堿性和疏水性影響著DNA與柱子吸附材料的結合，是影響膠回收的關鍵因素。因此，如果電泳緩沖液的pH偏高，可在溶膠液中加入10μL（pH 5.0，3 mol/L的NaAC）。
⑥為了提高膜對DNA分子吸附力，可以在加熱熔化膠后的液體里添加30%異丙醇，對于提高小片段DNA的回收率更有效。
⑦加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10 min），以使乙醇充分揮發。
⑧最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用20～50μL洗脫液洗脫。
⑨在加入洗脫液之后，可以在55℃水浴5 min以上再洗脫以提高回收率。
⑩將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。
六、DNA瓊脂糖電泳的注意事項
配制凝膠的濃度據實驗需要而定，一般在0.8%～2.0%之間，盡量根據實際需要的量來配制。用微波爐加熱熔化瓊脂糖的時間不宜過長，否則會因水分蒸發導致凝膠濃度增高。沒用完的凝膠可以再次熔化，但隨著熔化次數的增加，水分丟失也越多，凝膠濃度則會越來越高，導致實驗結果不穩定。為了防止這種現象，對凝膠濃度要求較為準確的可以在溶膠前稱重，溶膠后補充水至原重量。
一般每個制膠模具均配有多個齒型不同的梳板，用于制備不同大小的膠孔來滿足不同電泳目的的要求，如大膠孔適用于DNA片段回收實驗，小膠孔適用于PCR產物、酶切產物鑒定等。一般來說，根據上樣量盡量選擇最小的膠孔，得到的電泳條帶致密清晰，便于結果分析。另外，制膠時都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm，以免拔梳板時損壞凝膠孔底層，導致點樣后樣品滲漏。
上樣的樣品需要和上樣緩沖液充分混勻，上樣緩沖液儲存液一般為6×或10×，表示其濃度為工作濃度的6倍或10倍，使用時上樣緩沖液應稀釋到1×的濃度。制備好瓊脂糖凝膠后將凝膠放到緩沖液中，使緩沖液浸過膠面，并使梳孔充滿緩沖液；梳孔不能有氣泡存在，以免影響加樣，甚至影響電泳帶型；然后利用移液器在膠孔上方小心將DNA樣品加到孔中，利用上樣緩沖液的沉淀作用將樣品沉到孔中。注意吸頭不要接觸到凝膠，否則造成膠孔損壞，影響DNA的電泳帶型。切記，不可先上樣再加電泳緩沖液，以免緩沖液沖走樣品或引起膠孔之間樣品交叉污染。
將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連，負極與負極相連，上樣一段靠近負極，使樣品從負極向正極移動。電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應相同，電泳緩沖液剛好沒過凝膠1 mm為好，電泳緩沖液太多則電流加大，凝膠發熱。電泳時凝膠上所加電壓一般不超過5 V/cm（此處長度指的是正負電極之間的距離），根據實驗需要也可作適當調整，增高電壓，可縮短電泳時間，但核酸條帶相對來說不夠整齊，不夠清晰；相反，降低電壓，電泳時間較長，但核酸條帶整齊清晰。為保持電泳所需的離子強度和pH，要注意更新電泳緩沖液，在進行電泳的過程中，溴酚藍有可能會變黃，這是由于電泳液使用過久或殘留在電泳液中的凝膠變質引起的。要特別注意，回收DNA的電泳要全部換新的電泳緩沖液。
微型凝膠和中型凝膠槽只能裝少量的緩沖液，比較大的電泳槽更容易減弱緩沖液的緩沖能力，所以應該優先考慮用緩沖能力更強的TBE緩沖液。