第三節(jié) 微生物菌種分離篩選研究實(shí)例

一、蛋白酶產(chǎn)生菌種的篩選及應(yīng)用技術(shù)

蛋白酶是在一定的pH和溫度條件下，通過(guò)內(nèi)切和外切作用使蛋白質(zhì)水解為小肽和氨基酸的生物酶（周蘭姜，2011），在所有工業(yè)用酶中是應(yīng)用最為廣泛的一種，約占整個(gè)酶制劑產(chǎn)量的60%以上（王俊英，2012）；蛋白酶既可以從動(dòng)植物組織中提取，也可以通過(guò)微生物發(fā)酵工藝進(jìn)行生產(chǎn)，目前蛋白酶制劑主要利用曲霉、芽孢桿菌等微生物發(fā)酵制備（宋鵬，2012）。與動(dòng)植物資源比較，微生物來(lái)源的蛋白酶生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低、易控制、不受土地和季節(jié)等限制，且微生物產(chǎn)生的蛋白酶多為胞外酶，日趨成為工業(yè)酶制劑的主要來(lái)源（馬桂珍，2011），因此分離篩選能易純化制備、分泌具有良好酶學(xué)特性并在適宜的培養(yǎng)條件下能提高產(chǎn)酶活性的菌株，是基礎(chǔ)科研人員的目標(biāo)和任務(wù)。

Fang等從海底泥漿中分離出一株能在多種有機(jī)溶劑下正常生長(zhǎng)，且蛋白酶穩(wěn)定性良好的菌株Bacillus sphaericus DS11，通過(guò)蛋白酶活力測(cè)定達(dá)465U/mL(Fang, et al.,2009)。Reddy等從土壤中分離出菌株Bacillus sp.RKY3，經(jīng)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面方法優(yōu)化后酶活達(dá)939U/mL (Reddy, et al.,2008)。Karan等從鹽水湖中分離出的產(chǎn)胞外蛋白酶菌株Geomicrobium sp.EMB2，在有機(jī)溶劑、鹽溶液、表面活性劑、洗滌劑和堿性溶劑中有顯著穩(wěn)定性，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后酶活達(dá)721U/mL(Karan, et al.,2011)。Wang等運(yùn)用響應(yīng)面方法優(yōu)化Colwellia sp.NJ341的發(fā)酵培養(yǎng)基，使其蛋白酶活性達(dá)183.21 U/mL(Wang, et al., 2008)。Chi等從鹽田沉積物中分離出一株蛋白酶高產(chǎn)菌Aureobasidium pullulans，通過(guò)優(yōu)化最高酶活達(dá)7.2U/mL(Chi, et al.,2007)。任佩等采用檢測(cè)水解透明圈和測(cè)定蛋白酶活力的方法，從章魚腸道中分離篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶的菌株QDV-3，其所產(chǎn)蛋白酶在SDSPAGE電泳上顯示至少有5種，分子質(zhì)量范圍為32.4~124.2kD（任佩，2013）。鄧加聰?shù)葟酿B(yǎng)殖場(chǎng)附近淤泥中采樣，分離得到20株膠原蛋白水解活性的菌株（鄧加聰，2013）。經(jīng)活性平板初篩、搖床復(fù)篩及酶活測(cè)定，篩選得到1株膠原蛋白酶活性為28.70U/mL的菌株。衛(wèi)春會(huì)等采用傳統(tǒng)微生物分離方法從高溫大曲中分離得到3株細(xì)菌（衛(wèi)春會(huì)，2014），通過(guò)酪素培養(yǎng)基確定了蛋白酶活性最高的是細(xì)菌JX1，其產(chǎn)物蛋白酶的活性達(dá)到142.636U/g。

（一）蛋白酶產(chǎn)生菌的選育原理

蛋白質(zhì)分解菌可利用明膠液化和牛乳胨化試驗(yàn)檢驗(yàn)。明膠是由膠原蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在25℃以下可維持凝膠狀態(tài)（固體狀態(tài)），而在25℃以上明膠就會(huì)液化，有些微生物能分泌明膠水解酶（胞外酶），可將大分子明膠水解成小分子明膠，從而使明膠液化，甚至在4℃仍能保持液化狀態(tài)。

牛乳含有酪蛋白成分，具有酪蛋白水解酶的細(xì)菌水解酪蛋白為小分子物質(zhì)，可直接出現(xiàn)胨化現(xiàn)象，據(jù)此可知該菌為蛋白質(zhì)分解菌。

能夠產(chǎn)生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板生長(zhǎng)后，其菌落可形成明顯的蛋白水解圈。水解圈與菌落直徑的比值（D/d值），常被作為判斷該菌株蛋白酶產(chǎn)生能力的初篩依據(jù)。但是，由于不同類型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，細(xì)菌在平板上的生長(zhǎng)條件也和液體環(huán)境中的生長(zhǎng)情況差別很大，因此在平板上產(chǎn)圈能力強(qiáng)的菌株不一定就是高產(chǎn)蛋白酶菌株。可再次利用干酪素平板培養(yǎng)基，依據(jù)D/d值確定產(chǎn)蛋白酶菌株。

通過(guò)初篩得到的菌株還必須用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵液中蛋白酶活力的仔細(xì)調(diào)查、比較，才有可能真正得到需要的蛋白酶高產(chǎn)菌株，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)篩。需要指出的是，因?yàn)椴煌甑倪m宜產(chǎn)酶條件差別很大，常需選擇多種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶菌株的復(fù)篩工作，否則可能漏掉一些已經(jīng)得到的高產(chǎn)菌株。

蛋白酶活力的測(cè)定按中華人民共和國(guó)頒布的標(biāo)準(zhǔn)QB747-80（工業(yè)用蛋白酶測(cè)定方法）進(jìn)行。其原理是Folin試劑與酚類化合物如酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)等在一定的溫度和pH下發(fā)生反應(yīng)形成藍(lán)色化合物；用蛋白酶分解酪蛋白（底物）生成含酚基的氨基酸與Folin試劑呈藍(lán)色反應(yīng)，通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定可知酶活大小。

（二）蛋白酶產(chǎn)生菌的選育流程與方法

1．蛋白酶產(chǎn)生菌的選育流程

待檢樣品→預(yù)處理→梯度稀釋→平板初篩→發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩→粗酶提取→蛋白酶活力測(cè)定→高產(chǎn)蛋白酶菌株

2．蛋白酶產(chǎn)生菌的初篩方法

脫脂牛乳瓊脂法以傾注平板法制成不同檢樣稀釋度的平板后，于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，用1%鹽酸或10%醋酸溶液淹沒(méi)平板1min，傾去多余的酸溶液，計(jì)數(shù)因細(xì)菌分解蛋白質(zhì)的作用而產(chǎn)生透明圈的菌落數(shù)。蛋白質(zhì)分解菌的計(jì)數(shù)以每毫升或每克樣品中蛋白質(zhì)分解菌的菌落數(shù)報(bào)告。

軟瓊脂明膠覆蓋法：向滅菌平板中倒入少許作為底層培養(yǎng)基（以剛好鋪滿底部為準(zhǔn)），凝固后吸取適當(dāng)檢樣稀釋液0.1mL接種于底部培養(yǎng)基，用無(wú)菌玻璃涂布棒將平板上的菌液涂布均勻，然后倒入已熔化并冷卻至50℃左右的軟瓊脂明膠覆蓋培養(yǎng)基10~12mL立即混勻，凝固后將平板倒置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。之后用10mL 5%醋酸淹沒(méi)平板表面，15min后傾去酸液，計(jì)算具有透明圈的菌落數(shù)。

明膠穿刺法：取高層明膠培養(yǎng)基試管，用接種針穿刺接種待檢純培養(yǎng)物，置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~5d，觀察明膠液化情況，以此判斷是否為蛋白酶分解菌。

脫脂牛奶—干酪素瓊脂平板培養(yǎng)法：又稱脫脂牛奶瓊脂平板法，即向滅菌平板中倒入15~20mL脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基，凝固后吸取適當(dāng)檢樣稀釋液0.1mL接種于培養(yǎng)基，用無(wú)菌玻璃涂布棒將平板上的菌液涂布均勻，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察透明圈產(chǎn)生情況。干酪素瓊脂平板法，即挑取上述培養(yǎng)基中D/d值（透明圈與菌落直接比）較大的菌落，劃線培養(yǎng)于干酪素瓊脂培養(yǎng)基，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察透明圈產(chǎn)生情況。劃線分離兩次，篩選出D/d值較大的菌落，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩。

目前研究報(bào)道中較多采用脫脂牛奶—干酪素瓊脂平板培養(yǎng)法篩選產(chǎn)蛋白酶菌株，該法操作簡(jiǎn)單，觀察方便，篩選率高。

3．蛋白酶活力的測(cè)定

將初篩得到的蛋白酶產(chǎn)生菌株接種到適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃下于150r/min搖床培養(yǎng)2d。將發(fā)酵液離心或過(guò)濾后按照QB747-80中方法測(cè)定蛋白酶活力，篩選出高產(chǎn)蛋白酶活力菌株。

蛋白酶活力的測(cè)定參照丁魯華（1984年）的方法進(jìn)行測(cè)定。蛋白酶活力單位定義：1.0mL酶液于35℃, pH7.2條件下，每分鐘水解2%酪蛋白溶液產(chǎn)生lμg酪氨酸的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

（三）蛋白酶產(chǎn)生菌的選育實(shí)例——豆制品發(fā)酵

豆制品是以大豆為主要原料經(jīng)過(guò)加工制作或精煉提取而得到的產(chǎn)品，種類多達(dá)幾千種，包括具有幾千年生產(chǎn)歷史的傳統(tǒng)豆制品和采用新技術(shù)生產(chǎn)的新型豆制品。傳統(tǒng)豆制品包括發(fā)酵性與非發(fā)酵性豆制品；目前發(fā)酵豆制品微生物主要包括下面幾大類：一是細(xì)菌類，以枯草芽孢桿菌為典型代表，日本的納豆(Natto)生產(chǎn)的主要菌種就是納豆芽孢桿菌，它不僅可以分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶，更主要的是它可以生成納豆激酶(Nattokinase)，芽孢桿菌也是生產(chǎn)淀粉酶的主要菌株，生產(chǎn)蛋白酶的為枯草桿菌1398，藤黃小球菌(Micrococcus luteus)是克東腐乳釀造用的主要微生物。二是真菌類，主要以毛霉、根霉(Rhizopus)、米曲霉(Aspegillus oryzae)為主，腐乳釀制以毛霉為主，有總狀毛霉(Mucor racemosus)、高大毛霉(Mucormucedo)、雅致放射性毛霉(Actinomucor elegans)、腐乳毛霉(Mucor sufu)等，國(guó)內(nèi)登記的有腐乳毛霉3.25，雅致放射性毛霉3.2778等；米曲霉也是發(fā)酵豆制品常見(jiàn)的霉菌，如米曲霉3.042、醬油曲霉等，主要用于制作豆醬和豆豉（王瑞芝，2009）。

我國(guó)傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵制品之一豆豉，不僅具有良好的風(fēng)味，還具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉采用的是自然制曲，包括酵母及曲霉等多種微生物，屬于多菌種混合發(fā)酵豆豉；其中，米曲霉型豆豉起源最早且分布廣泛，其所分泌的蛋白酶對(duì)發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)具有重要作用。以下以豆制品發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶典型菌株毛霉菌的分離篩選為例，介紹蛋白酶產(chǎn)生菌的分離篩選過(guò)程。

1．高產(chǎn)蛋白酶產(chǎn)生菌的初步篩選

以鄧芳席(1995)分離篩選優(yōu)良毛霉菌株為例。

（1）單菌分離

從自然生霉的腐乳毛胚、臘八豆曲或?yàn)g陽(yáng)豆豉曲樣品上取少量毛霉孢子，點(diǎn)種在牛奶瓊脂平板上20℃培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)速度快，菌絲致密，孢子量多的單個(gè)菌落，繼續(xù)進(jìn)行多次點(diǎn)種培養(yǎng)。然后用稀釋平板分離，待長(zhǎng)出單菌落移接斜面。

（2）小試管初篩

采用透明帶法，取培養(yǎng)4d的PDA瓊脂平板毛霉菌種約0.25cm2，放入小試管初篩液體培養(yǎng)基表面，20℃培養(yǎng)5d。測(cè)量菌絲下培養(yǎng)液澄清層高度，選擇透明帶出現(xiàn)較早，并且較寬的菌株進(jìn)行菌種復(fù)篩。

或取活化培養(yǎng)好的培養(yǎng)液5mL，振蕩混勻后用接種環(huán)以點(diǎn)接法點(diǎn)滴在脫脂乳固體培養(yǎng)基上，于20~40℃范圍培養(yǎng)48h，挑選菌體周圍產(chǎn)生透明圈較大的菌株，并記錄透明圈直徑。

（3）三角瓶復(fù)篩

取毛霉PDA瓊脂平板菌種一小塊，接入三角瓶麩皮培養(yǎng)基中，于20℃培養(yǎng)4d，提取酶液，測(cè)定蛋白酶活力，這樣得到初始菌株。

液體培養(yǎng)法：將挑選出的菌株接種到100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，選取合適的溫度培養(yǎng)48h，取10mL發(fā)酵液，離心(4500r/min,20min,4℃)收集上清液，上清液即為粗酶液。收集粗酶液測(cè)定蛋白酶的活力。

2．高產(chǎn)蛋白酶生產(chǎn)菌株的誘變育種

一般野生型菌株的性能及耐受性較差，遺傳不穩(wěn)定，往往不能滿足現(xiàn)代快速發(fā)酵的需求，因此采用不同處理方法進(jìn)行菌種選育是必不可少的，通過(guò)誘變能夠得到適用于豆豉發(fā)酵的高效菌株，以達(dá)到縮短發(fā)酵周期和提升發(fā)酵產(chǎn)能的目的。

得到初始菌株后可以采用60Co射線誘變或紫外線、亞硝基胍等其他方式結(jié)合處理，可以采取以下的程序獲得高產(chǎn)蛋白酶或耐高溫的菌株（徐建國(guó)，2010），具體程序如下：

菌種活化?菌懸液制備?紫外誘變條件優(yōu)化及誘變?高產(chǎn)蛋白酶菌株篩選?突變菌株蛋白酶活力測(cè)定?優(yōu)選高蛋白酶活力菌株?亞硝基胍誘變條件優(yōu)化?高產(chǎn)蛋白酶菌株篩選?突變菌株蛋白酶活力測(cè)定?優(yōu)選及遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)

陳方博(2010)采用氦氖誘變與亞硝基胍誘變技術(shù)處理產(chǎn)蛋白酶菌株米曲霉(HDF-C14)，細(xì)胞發(fā)生正突變率為15.79%，而用脈沖頻率2450MHz處理試驗(yàn)菌株，并不能促進(jìn)細(xì)胞正突變。

3．產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

可以依據(jù)實(shí)際情況采用單一或多種方法混合選育，在確定篩選菌株后再考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和接種量等發(fā)酵條件對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，并改變培養(yǎng)基的氮源、碳源及起始pH值，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（吳滿剛，2014）。

將篩選出的菌株接種到100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35℃,150r/min的搖床培養(yǎng)48h，測(cè)定粗酶液中蛋白酶活力，考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和接種量等發(fā)酵條件對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，并改變培養(yǎng)基的氮源、碳源及起始pH值，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。

（四）蛋白酶產(chǎn)生菌的選育實(shí)例——魚醬油發(fā)酵

魚醬油作為傳統(tǒng)魚類發(fā)酵產(chǎn)品，有著悠久的歷史，是人們的主要蛋白質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)氨基酸重要來(lái)源之一。傳統(tǒng)的魚醬油是以海產(chǎn)低值魚為原料，與一定比例的海鹽混合后經(jīng)過(guò)腌制和長(zhǎng)期自然發(fā)酵，最后過(guò)濾而成的色澤透亮，香氣濃郁的液體調(diào)味品。傳統(tǒng)魚醬油的高鹽環(huán)境使發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物為嗜鹽菌，主要包括芽孢桿菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和片球菌屬中極度耐鹽的細(xì)菌，也包括含有細(xì)菌視紫紅質(zhì)光合色素的紅色極端嗜鹽古細(xì)菌(extremely halophilic red archaea)和嗜鹽乳酸菌(halophilic lactic acid bacteria)。嗜鹽乳酸菌中僅有四聯(lián)球菌屬中的一些細(xì)菌能在高鹽濃度(18%NaCl)下正常生長(zhǎng)(Udomsil, et al.,2010)。泰國(guó)魚露發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌群是芽孢桿菌、棒狀桿菌，還有少量的假單胞菌和紅色極端嗜鹽古細(xì)菌(Antonio, et al.,1998)。黃紫燕等對(duì)傳統(tǒng)魚露發(fā)酵中的微生物動(dòng)態(tài)進(jìn)行了分析（黃紫燕，2010），檢測(cè)出乳酸菌和酵母菌是發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌。海洋魚類因其蛋白質(zhì)含量豐富、種類繁多，在魚醬油發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮主要作用的是產(chǎn)蛋白酶菌類。下面就以魚醬油不同時(shí)期的發(fā)酵樣品為例，簡(jiǎn)述蛋白酶產(chǎn)生菌的選育過(guò)程。

（1）魚醬油蛋白酶產(chǎn)生菌的初篩

目前研究中多采用脫脂牛奶—干酪素瓊脂平板法。取魚醬油發(fā)酵過(guò)程中不同發(fā)酵時(shí)期的樣品，經(jīng)預(yù)處理后配制成不同梯度稀釋液。分別吸取0.1mL稀釋液接種于脫脂牛奶瓊脂平板上，用無(wú)菌玻璃涂布棒將菌液涂布均勻后，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察透明圈產(chǎn)生情況。用接種環(huán)挑取D/d值較大的菌落，劃線接種于干酪素瓊脂培養(yǎng)基，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察透明圈產(chǎn)生情況。劃線分離兩次，篩選出D/d值較大的菌落，進(jìn)一步作下一步的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

（2）魚醬油蛋白酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種到牛肉膏蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)2d。取發(fā)酵液離心后按照QB747-80中的方法測(cè)定蛋白酶活力，根據(jù)蛋白酶活力的大小最后得到高產(chǎn)蛋白酶活力的菌株。

二、產(chǎn)海洋活性物質(zhì)的微生物篩選方法

海洋微生物天然活性物質(zhì)的篩選首先是海洋微生物的分離篩選。篩選時(shí)不僅要考慮到海洋微生物的多種來(lái)源以及特定的生長(zhǎng)環(huán)境，而且還要考慮到微生物的種類。由于產(chǎn)生特定活性物質(zhì)的微生物是從海洋的不同區(qū)域中采集的大量微生物菌株樣品中篩選出來(lái)的，需要大量篩選工作才有可能得到有價(jià)值的菌株。因此需要一套廉價(jià)簡(jiǎn)易的、快速有效的培養(yǎng)篩選模式，首先將無(wú)活性的大部分菌株排除掉，再通過(guò)別的手段獲得具有重要意義和實(shí)用價(jià)值的高產(chǎn)菌株。研究常用快捷有效的自動(dòng)化高通量藥物篩選方法(HTS)或快速分子篩選方法進(jìn)行篩選，以下介紹幾種常用且有效的篩選方法。

（一）高通量篩選法

中國(guó)海洋大學(xué)在已有tsFT210細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)篩選模型基礎(chǔ)上（朱天驕，2002），利用研究室現(xiàn)有條件建立了海蝦生物致死法篩選模型，并通過(guò)組合使用這2種模型，探討了海蝦生物致死法一級(jí)初篩和對(duì)初篩活性菌株利用流式細(xì)胞術(shù)模型二級(jí)復(fù)篩的分級(jí)組合篩選模式（韓小賢，2005）。利用這種模型進(jìn)行分級(jí)組合篩選，充分發(fā)揮2種模型各自的長(zhǎng)處，形成了細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)以及細(xì)胞毒等抗癌活性微生物菌株的簡(jiǎn)便快速且經(jīng)濟(jì)可行的組合篩選模式，該分級(jí)組合篩選模式與流式細(xì)胞術(shù)篩選模型的單獨(dú)篩選模式相比，無(wú)漏篩，具有成本低、速度快、復(fù)篩樣本數(shù)目大大縮小、流式細(xì)胞術(shù)篩選的工作量減少等特點(diǎn)，適用于大量菌株抗腫瘤活性的體外篩選。

（二）BIA篩選法

此方法多用于海洋微生物中抗腫瘤物質(zhì)的篩選。雖然抗腫瘤物質(zhì)篩選方法很多，但試驗(yàn)證明，在體外模型中BIA法以其獨(dú)特的篩選機(jī)制顯示出不可忽視的優(yōu)勢(shì)。它是利用遺傳學(xué)方法構(gòu)建的一株具有K2lacZ片段的溶源性E.coli指示菌菌株，該菌株在正常條件下不表達(dá)β-半乳糖苷酶，但當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)中含有能作用于DNA的化合物時(shí)，菌株就會(huì)被誘導(dǎo)產(chǎn)生B2半乳糖苷酶。因此，通過(guò)檢測(cè)是否有β-半乳糖苷酶產(chǎn)生就可初步確定樣品中是否含有能夠作用于腫瘤細(xì)胞DNA的物質(zhì)。由于天然藥物中不少是通過(guò)使腫瘤細(xì)胞DNA受損傷起作用，因此，可利用此法檢測(cè)天然產(chǎn)物中具有這種作用機(jī)理的抗腫瘤活性物質(zhì)（張亞鵬，2006），進(jìn)行快速、特異性方法篩選菌株。

（三）流式細(xì)胞術(shù)篩選法

流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometer, FCM)能夠?qū)?xì)胞和細(xì)胞器及生物大分子進(jìn)行高達(dá)每秒上萬(wàn)個(gè)染色體的分析，而且一個(gè)細(xì)胞多參數(shù)分析并可分選細(xì)胞。與傳統(tǒng)的用熒光鏡檢測(cè)細(xì)胞方法相比，這種以流動(dòng)的方式（相對(duì)靜態(tài)方式）測(cè)量細(xì)胞具有速度快、精度高和準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)，可以說(shuō)FCM是目前最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)，該儀器在醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)生命科學(xué)中已得到廣泛應(yīng)用，在微藻研究中的應(yīng)用相對(duì)說(shuō)來(lái)較為新穎。流式細(xì)胞術(shù)一經(jīng)引入微藻學(xué)，便很快在微藻的不同研究領(lǐng)域擴(kuò)展開。

（四）海洋微生物活性產(chǎn)物的其他篩選法

目前，在海洋微生物中篩選活性藥物的技術(shù)中，高通量篩選方法的應(yīng)用和完善，提供了在短時(shí)間內(nèi)篩選大量化合物的能力，而這又使得從海洋微生物分離提取各種化合物成為發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（梁劍光，2004）。所以，擴(kuò)大海洋生物的化學(xué)研究，將會(huì)建立更多更有效的海洋微生物活性物質(zhì)篩選方法。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)的科研工作者在研究海洋微生物殺蟲活性篩選方法中，初篩采用浸蟲法，將初篩表現(xiàn)活性的菌株采用“細(xì)胞毒”法（MTT法）進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果從294株供試菌株中，共有效篩選出7株活性較高的菌株（徐守健，2006）。

胡志鈕等以鹵蟲為指示動(dòng)物，采用雙層瓊脂擴(kuò)散方法構(gòu)建了一種殺蟲微生物篩選模型（胡志鈕，2000）。該模型具有靈敏度高、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合于海洋微生物殺蟲活性物質(zhì)的早期大量初篩工作。利用該模型對(duì)1240株分離于廈門海區(qū)潮間帶的放線菌進(jìn)行了初篩，殺蟲陽(yáng)性率為2.3%，展示了海洋微生物是殺蟲活性物質(zhì)研究和開發(fā)的重要來(lái)源。

許文思等（許文思，2001）建立了一種利用兩個(gè)菌株對(duì)DNA損傷修復(fù)的差異性的DDRT法，可以用來(lái)檢測(cè)受試物對(duì)DNA的毒性；建立了液體懸浮法和瓊脂固體篩選方法，用于抗腫瘤藥物的篩選。這兩種方法簡(jiǎn)便易行，其中瓊脂固體篩選方法與常用的抗生素生物鑒定杯碟法一樣簡(jiǎn)單，適用于大量篩選各種來(lái)源的抗腫瘤藥物。從抗腫瘤藥物的作用機(jī)理來(lái)看，多數(shù)抗腫瘤藥物的作用機(jī)制主要是作用于DNA，因而DDRT法可應(yīng)用于篩選并得到作用于DNA的抗腫瘤物質(zhì)。李根等利用這一方法對(duì)海洋微生物進(jìn)行抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選（李根，2004），并對(duì)其抗腫瘤作用和DDRT篩選方法作初步探討，獲得成功。

Lemos等使用非選擇性分離技術(shù)(Lemos, et al.,1986)，從北太平洋海水中分離到一種能產(chǎn)生抗生素和紫色素的色桿菌，這種化合物能抑制金黃色葡萄球菌。

（五）優(yōu)化發(fā)酵條件法

研究微生物合適的發(fā)酵條件，從而更快培養(yǎng)分離微生物也是一種方法。魏向陽(yáng)等研究了產(chǎn)脂肪酶菌株L42的篩選及最適發(fā)酵培養(yǎng)條件（魏向陽(yáng)，2008），結(jié)果表明最佳生長(zhǎng)條件為20℃,5%接種體積分?jǐn)?shù)，培養(yǎng)基初始pH為8.0，搖瓶裝液體積50mL（250mL三角瓶），NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%~4%，培養(yǎng)24h，獲得大量脂肪酶。林學(xué)政等通過(guò)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)海洋嗜冷菌產(chǎn)脂肪酶條件（林學(xué)政，2005），首先經(jīng)南極科考從表層水深至3300米不等的南大洋的海洋環(huán)境中采樣，在含Tween80的培養(yǎng)基平板上分離培養(yǎng)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定脂肪酶酶活，比較產(chǎn)酶活性獲得酶活較高的菌株。邵鐵娟等對(duì)產(chǎn)低溫堿性脂肪酶海洋菌株進(jìn)行研究（邵鐵娟，2004）。朱義明等也曾從廣西北海70個(gè)海洋動(dòng)物表皮或腸道中分離并篩選了抗金黃色葡萄球菌的微生物（朱義明，2007）。

以下進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件法篩選微生物的案例，說(shuō)明此法的實(shí)際應(yīng)用。幾丁質(zhì)酶是誘導(dǎo)性酶，而幾丁質(zhì)廣泛存在于甲殼類動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物的外殼中，因此要有針對(duì)性從海洋中取樣，富集培養(yǎng)分解幾丁質(zhì)的菌株，利用以幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行菌株富集培養(yǎng)，限制了絕大多數(shù)不能利用幾丁質(zhì)的微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)了能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的菌株生長(zhǎng)繁殖，使目標(biāo)微生物在富集培養(yǎng)液中所占比例增大，進(jìn)而篩選目標(biāo)微生物。篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物較為常用的方法是透明圈法，以不溶性白色膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源制成平板，以平板上菌落周圍透明圈的大小判斷菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性的高低。

此外，還可以考慮將環(huán)境介質(zhì)或一些與環(huán)境介質(zhì)相關(guān)的特定化學(xué)物質(zhì)或細(xì)胞信號(hào)分子，如cAMP、細(xì)胞能源物質(zhì)ATP及微生物復(fù)蘇促進(jìn)因子(resuscitation-promoting factor, RPF)等，添加至微生物培養(yǎng)基中。岳秀娟等探索了在培養(yǎng)基中加入土壤浸出液的分離方法（岳秀娟，2006），發(fā)現(xiàn)4株必須在含有土壤提取液的培養(yǎng)基上才能生長(zhǎng)的菌株，表明傳統(tǒng)的分離方法確實(shí)可能忽略了這類微生物的分離。為克服培養(yǎng)過(guò)程中氧氣對(duì)微生物的毒害作用，可采取兩方面措施。一方面降低“活性氧物質(zhì)”；另一方面則在培養(yǎng)過(guò)程中添加具有降解毒性氧能力的物質(zhì)，使處于VBNC狀態(tài)的微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上得以恢復(fù)生長(zhǎng)繁殖能力，從而增加可用于分離與培養(yǎng)的微生物種類。

三、產(chǎn)組胺微生物的分離與篩選

生物胺，一類含氮低分子量化合物的總稱，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為雜環(huán)類（色胺、組胺）、芳香族（苯基乙胺、酪胺）和脂肪族（精胺、亞精胺、尸胺和腐胺）(Lonvaud,2001)。其中組胺的毒性最大，酪胺次之。Taylor等發(fā)現(xiàn)二級(jí)胺包括腐胺和色胺的存在具有協(xié)同作用(Taylor &Speckhard,1983)，能增強(qiáng)組胺的毒性。另外，Shalaby等指出生物胺也可能是誘變前體(Shalaby,1996)，胺的存在可以和亞硝酸鹽反應(yīng)形成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝胺。據(jù)研究報(bào)道，生物胺廣泛存在于各種食品中，如干酪、發(fā)酵香腸、果酒、水產(chǎn)品和發(fā)酵蔬菜等，特別是富含蛋白質(zhì)及氨基酸強(qiáng)化食品和發(fā)酵食品。食品中過(guò)量的生物胺會(huì)對(duì)機(jī)體健康造成不良的影響(Til, et al.,1997; Laura & Natalija,2007)。美國(guó)FDA通過(guò)對(duì)大量組胺中毒暴露數(shù)據(jù)的評(píng)估，確定組胺危害作用水平為500mg/kg（食品）。歐盟規(guī)定鯖科魚類中組胺含量不得超過(guò)100mg/kg；其他食品中組胺不得超過(guò)100mg/kg，酪胺不得超過(guò)100~800mg/kg。以下將從微生物角度出發(fā)，利用鑒別培養(yǎng)基結(jié)合HPLC檢測(cè)篩選，以腌制蔬菜作為待分離樣品，以此分離出產(chǎn)組胺菌株，并經(jīng)16 SrDNA序列分析鑒定種屬；對(duì)得到的可疑菌株進(jìn)一步研究其pH、溫度和鹽度等培養(yǎng)因素對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)組胺量的影響，以明確產(chǎn)組胺菌株的生理生化特性，從而為發(fā)酵食品類組胺物質(zhì)的控制提供理論依據(jù)。

（一）產(chǎn)組胺菌株的鑒別篩選

從發(fā)酵腌制蔬菜等樣品液中經(jīng)分離純化得到細(xì)菌菌株，挑取斜面保藏的分離純化菌株分別對(duì)應(yīng)在MRS和PCA培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接活化2~3代，再將各菌株通過(guò)點(diǎn)種法接種于產(chǎn)組胺菌鑒別培養(yǎng)基（蛋白胨5.00g，牛肉浸膏5.00g, L-組氨酸5.00g，氯化鈉2.50g,5'-磷酸吡哆醛0.05g，瓊脂15.00g，溴甲酚紫0.06g，蒸餾水1000mL，加熱溶解，調(diào)pH至5.5后經(jīng)滅菌操作），放置于30℃條件下培養(yǎng)48h，菌落生長(zhǎng)良好且周圍有紫色暈環(huán)產(chǎn)生的確定為產(chǎn)組胺可疑菌株，再經(jīng)劃線法接種于產(chǎn)組胺菌鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行復(fù)篩。

（二）產(chǎn)組胺菌株的確認(rèn)

將4℃斜面保藏的經(jīng)初步篩選的可疑菌株連續(xù)劃線轉(zhuǎn)接2~3代，挑取一環(huán)活化后的菌株分別對(duì)應(yīng)接種于MRS肉湯培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30℃下振蕩培養(yǎng)18h。以1%接種量將新鮮種子液接種于組胺發(fā)酵培養(yǎng)基(L-組氨酸10.00g，大豆蛋白胨17.00g，葡萄糖2.50g，丙酮酸鈉10.00g，氯化鈉3.00g，磷酸氫二鉀2.50g，蒸餾水1000mL，調(diào)pH6.0)中，于30℃下培養(yǎng)36h，以不接種培養(yǎng)作對(duì)照組，以HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液樣品中是否有組胺產(chǎn)生。

通過(guò)產(chǎn)組胺菌鑒別培養(yǎng)基篩選，有6株MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)菌株能使培養(yǎng)基變紫紅色，如圖3-10所示。將6株菌株分別編號(hào)為M1至M6，其中M1為0天，M2和M3為5天，M4和M5為10天，M6為20天的冬瓜腌制體系中的優(yōu)勢(shì)菌株。將菌株M1至M6接種培養(yǎng)于組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用HPLC檢測(cè)其發(fā)酵液中的組胺含量。

產(chǎn)組胺菌株的16 SrDNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育的建立：提取組胺菌株的總DNA，菌株的16 SrDNA經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)M1、M2和M5以及M3和M4的堿基序列分別完全相同，因此，歸屬5株菌株為2個(gè)菌種。將16SrDNA序列在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，同種菌中各取菌株M1和M3構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3-11所示。由圖3-11可知，M1和M3均為腸桿菌屬，而M1和Enterobacter aerogenes（產(chǎn)氣腸桿菌）、M3和Enterobacter xiangfangensis分別聚成一支，相似度的值均達(dá)到90以上。M1和Enterobacter aerogenes、M3和Enterobacter xiangfangensis親緣關(guān)系最近。

四、細(xì)菌素產(chǎn)生菌的選育與發(fā)酵技術(shù)

食品安全問(wèn)題一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。隨著生活質(zhì)量不斷提高，健康綠色的食品也越來(lái)越受到人們的青睞。人們對(duì)食品中的防腐劑安全性提出了更高的要求。而我國(guó)使用的食品防腐劑絕大部分都是化學(xué)合成物，某些化學(xué)防腐劑對(duì)人體都有一定的毒害，所以尋找一種可替代化學(xué)防腐劑的天然安全防腐劑是目前科學(xué)家所關(guān)注的焦點(diǎn)。20世紀(jì)20年代中期，Gratia發(fā)現(xiàn)大腸桿菌V菌株代謝過(guò)程中能產(chǎn)生一些抑制?菌株生長(zhǎng)的物質(zhì)，隨后Gratia和Fredrericp對(duì)V菌株的分泌物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)是一種類似于噬菌體，但不能夠自主復(fù)制的物質(zhì)在起作用，F(xiàn)redrericp稱其為大腸菌素(Gratia,1925)。1928年Rogers等首次在革蘭氏陽(yáng)性菌中發(fā)現(xiàn)類似于大腸桿菌素的代謝產(chǎn)物(Rogers,1928)。1933年Whitehead等(Whitehead,1933)從乳酸菌中分離得到一類具有抑菌活性的物質(zhì)，在1947年將這類物質(zhì)命名為尼生素(nisin)(Mattick,1947)。Jacob等人稱這類抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素(Mary-Harting, 1972)。直到1982年Konisly對(duì)細(xì)菌素做出了明確的定義：細(xì)菌素(bacteriocin)是由某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抑菌能力的蛋白質(zhì)或者多肽，抑菌范圍不僅局限于同源細(xì)菌，產(chǎn)生菌對(duì)其細(xì)菌素有一定的自身免疫性(Jack,1995)，既可以由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生，也可以由革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生。

乳酸菌素是一類由乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的多肽類物質(zhì)，具有較好的熱穩(wěn)定性，能有效地抑制或殺死食物中多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性致病菌和腐敗菌，少數(shù)乳酸菌素對(duì)革蘭氏陰性菌也有一定的抑菌效果。美國(guó)FDA早在1988年就正式批準(zhǔn)細(xì)菌素Nisin可用于奶酪的生產(chǎn)中（彭沈軍，1995），從而開創(chuàng)了細(xì)菌素作為生物防腐劑應(yīng)用于食品中的先例。現(xiàn)在細(xì)菌素nisin作為一種天然的防腐劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用在食品領(lǐng)域中，我國(guó)在20世紀(jì)90年代也批準(zhǔn)了Nisin的使用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌素的研究已經(jīng)比較深入，除了已經(jīng)廣泛研究的乳酸鏈球菌肽(nisin)，還有乳球菌素(lactococcin)、片球菌素(pediocin)、明串珠菌素(canonic)、肉食桿菌素(carnobacteriocin)、植物菌素(plantadcin)、乳桿菌素(lactocin)等(Tagg,1976)。細(xì)菌素高產(chǎn)菌株的篩選、育種和發(fā)酵條件的優(yōu)化是目前細(xì)菌素研究的重點(diǎn)。

（一）傳統(tǒng)誘變育種

微生物育種，無(wú)論是從自然變異中選擇或是人工誘變選擇都是建立在遺傳和變異的基礎(chǔ)上，而遺傳和變異是生物界生命活動(dòng)的基本屬性之一。誘變育種是以人工誘變基因突變?yōu)榛A(chǔ)的最主要的微生物育種方法，是各國(guó)沿用至今的有效方法，尤其是在發(fā)酵工業(yè)中絕大多數(shù)優(yōu)良高產(chǎn)菌株都是采用誘變育種的方法獲得的。對(duì)nisin生產(chǎn)菌的誘變育種的方法有：紫外線誘變，微波誘變等。

1．紫外線誘變

是最早使用、應(yīng)用最廣、效果明顯的微生物誘變方法，這種方法誘變率高，而且不易回復(fù)突變，是微生物育種中最常用和有效的誘變方法之一。紫外線誘發(fā)微生物突變的波長(zhǎng)范圍為200~300nm，最有效的波長(zhǎng)為253.7nm，當(dāng)紫外線照射微生物細(xì)胞時(shí)，DNA強(qiáng)烈吸收此光譜而引起突變或殺傷作用。我們一般采用15W紫外燈照射，15W的紫外燈放射出來(lái)的光譜大約有80%集中在誘變最有效的253.7nm。紫外線對(duì)微生物誘變的量，在燈的功率和距離一定的情況下，劑量大小由照射時(shí)間決定。

2．微波誘變

是一種新興的、操作簡(jiǎn)單又比較安全的誘變育種方法。微波是高頻交變的電磁波，具有傳導(dǎo)能力和很強(qiáng)的穿透力，能夠造成水、蛋白質(zhì)、核苷酸、脂肪和碳水化合物等極性分子快速震動(dòng)，這種震動(dòng)會(huì)引起菌體內(nèi)DNA分子間強(qiáng)烈的摩擦，使DNA分子氫鍵和堿基堆積化學(xué)力受損，使DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引起變異（李豪，2005）。由于微波具有傳導(dǎo)作用和極強(qiáng)的穿透力，所以在誘變過(guò)程中究竟是微波輻射直接作用DNA引起變異，還是因?yàn)榇┩噶κ辜?xì)胞壁通透性增加導(dǎo)致DNA交換而引起突變，到目前為止還不是很明確。但是微波育種可以避免化學(xué)試劑和某些物理誘變方法對(duì)人體造成傷害，這是微波誘變育種的優(yōu)點(diǎn)。

（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)手段育種

1．Genome shuffing技術(shù)育種

隨著分子生物學(xué)和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，在上個(gè)世紀(jì)末提出了一種將傳統(tǒng)誘變和原生質(zhì)體融合的新興菌種改良技術(shù)(genome shuffing)，其原理是首先通過(guò)傳統(tǒng)誘變篩選得到若干正向突變菌株，然后將這些突變菌株作為遞推式原生質(zhì)體融合的出發(fā)菌株庫(kù)，經(jīng)多次原生質(zhì)體融合后，株內(nèi)基因組間發(fā)生隨機(jī)重組，最終通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得改良菌株。1996年，Stoyanova等(Stoyanova,1998)將兩個(gè)同源低產(chǎn)nisin產(chǎn)生菌L.lactic 729和L.lactic 1605進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選出的融合子的nisin產(chǎn)量比融合前提高了10~14倍。實(shí)踐表明，Genome shuffing技術(shù)在選育高產(chǎn)nisin菌株方面效果顯著。

2．基因工程方法育種

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的日益完善，以及對(duì)各種細(xì)菌素生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)認(rèn)識(shí)的深入，越來(lái)越多科學(xué)家利用基因工程手段對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生菌進(jìn)行遺傳改造而獲得高產(chǎn)菌株。目前，主要是通過(guò)對(duì)nisin生物合成的相關(guān)基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)或增加其拷貝數(shù)來(lái)提高nisin合成能力。而II類細(xì)菌素中的片球菌素PediocinPA-1的基因工程育種，則應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增編碼成熟pediocin PA-1的基因片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)，是目前常用的基因工程生產(chǎn)體系。

同時(shí)，隨著細(xì)菌細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的深入，科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)很多細(xì)菌都能夠依靠分泌某種化學(xué)分子來(lái)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并協(xié)調(diào)群體行為。細(xì)菌依賴信號(hào)分子密度識(shí)別的一種細(xì)胞間相互交流通訊機(jī)制，可調(diào)控基因表達(dá)，這種現(xiàn)象被稱為細(xì)菌的群體感應(yīng)(quorum sensing, QS) (Bassler,1999)（詳見(jiàn)第7章第二節(jié)）。很多細(xì)菌會(huì)低水平地合成并分泌自誘導(dǎo)小分子信號(hào)分子，細(xì)菌通過(guò)這些信號(hào)分子進(jìn)行信息的交流；當(dāng)信號(hào)分子處于低濃度狀態(tài)時(shí)，它不足以誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)；信號(hào)分子的濃度隨著細(xì)菌濃度的增大而增大，當(dāng)這個(gè)信號(hào)分子的濃度到達(dá)閾值時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)一些結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)其自身合成基因的表達(dá)，產(chǎn)生更多的信號(hào)分子來(lái)誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因和自身基因大量表達(dá)，這種正反饋機(jī)制也可以用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)菌素的高產(chǎn)。目前研究已證實(shí)多數(shù)II型細(xì)菌素的生物合成由QS系統(tǒng)調(diào)控。植物乳桿菌中的L. p lantarum C11、L.p lantarum WCFS1和L.plantarum NC8中細(xì)菌素的生物合成與QS系統(tǒng)調(diào)控密切相關(guān)。其中植物乳桿菌C11的調(diào)節(jié)操縱子plnABCD編碼一個(gè)自動(dòng)調(diào)整的系統(tǒng)，激活自身轉(zhuǎn)錄，同時(shí)促進(jìn)另外4種位于pln基因座的操縱子轉(zhuǎn)錄，plnABCD分別編碼自誘導(dǎo)肽（成熟自PlnA）、HPK(PlnB)和兩種高度同源的反應(yīng)調(diào)節(jié)器PlnC和PlnD。這類細(xì)菌素的群體感應(yīng)的基因調(diào)控機(jī)制一般按以下幾個(gè)步驟：自誘導(dǎo)前提肽段在核糖體內(nèi)合成，并結(jié)果特殊的轉(zhuǎn)錄修飾和加工，形成有活性的自誘導(dǎo)肽，由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外。隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，自誘導(dǎo)肽在細(xì)胞外積累，到一定量后便激活細(xì)胞膜上的PlnB蛋白——組氨酸蛋白激酶并與其結(jié)合，在保留的組氨酸殘基處自磷酸化，硫酸基團(tuán)則被運(yùn)輸給作為調(diào)節(jié)因子的PlnC和PlnD基因編碼的蛋白PlnC和PlnD。被磷酸化后的調(diào)節(jié)因子特意結(jié)合到目標(biāo)啟動(dòng)子，阻遏或激活目標(biāo)蛋白的表達(dá)，使自誘導(dǎo)肽和細(xì)菌素產(chǎn)生。所以可以通過(guò)外加自誘導(dǎo)肽，讓自誘導(dǎo)肽的濃度到達(dá)閾值，從而促進(jìn)細(xì)菌素的高產(chǎn)。

鑒于目前細(xì)菌素工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際情況，需要選擇合適的育種技術(shù)和生物學(xué)手段來(lái)獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的細(xì)菌素表達(dá)菌株。隨著生命科學(xué)技術(shù)和工業(yè)微生物技術(shù)的發(fā)展，細(xì)菌素規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用將有廣闊的前景。

（三）細(xì)菌素發(fā)酵技術(shù)

目前細(xì)菌素的應(yīng)用研究存在細(xì)菌素產(chǎn)量低等問(wèn)題，細(xì)菌素的發(fā)酵技術(shù)是細(xì)菌素應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。由于只有nisin是被批準(zhǔn)工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌素，本文著重以nisin為例介紹關(guān)于細(xì)菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵技術(shù)。

1．菌種的篩選

產(chǎn)nisin原始生產(chǎn)菌株大多是從乳制品中分離的，少量從蔬菜和肉類的樣品中經(jīng)多次分離后得到的。最終的工業(yè)生產(chǎn)用菌株大多是通過(guò)對(duì)原始菌株的誘變得到的。其誘變方法主要是進(jìn)行物理化學(xué)復(fù)合誘變，誘變后隨機(jī)篩選出菌株進(jìn)行培養(yǎng)確定生產(chǎn)能力。該方法工作量大，操作繁瑣。因此，至今已報(bào)道的有采用雙層平板法進(jìn)行初篩，減小了工作量，提高了篩選高產(chǎn)菌的幾率。還有利用基因技術(shù)對(duì)nisinZ的產(chǎn)生菌進(jìn)行定點(diǎn)突變并對(duì)突變體的性質(zhì)進(jìn)行了研究，但該方法還沒(méi)有大范圍的采用；還有根據(jù)乳鏈菌肽抗性與乳糖發(fā)酵緊密聯(lián)系的原理對(duì)乳鏈菌肽抗性菌株進(jìn)行了篩選；當(dāng)然還有通過(guò)構(gòu)建產(chǎn)nisin的基因工程菌得到高產(chǎn)nisin的菌株(Cheigh,2005)。

2．培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件

nisin的發(fā)酵生產(chǎn)主要是通過(guò)乳酸鏈球菌菌株培養(yǎng)基加碳源（通常是蔗糖）、氮源（如蛋白胨、酵母粉）、無(wú)機(jī)鹽類和吐溫等得到；發(fā)酵的效果主要受碳源和氮源的影響，另外，磷酸鹽、陽(yáng)離子、表面活性劑和抑制劑的種類和含量等對(duì)生產(chǎn)也有很大的影響。

（1）碳源

nisin發(fā)酵中最佳的碳源是葡萄糖和蔗糖，利用葡萄糖和蔗糖發(fā)酵可得到最大的nisin產(chǎn)量，另外，木糖也是合適的碳源。一些研究表明，間歇補(bǔ)充碳源有利于提高nisin產(chǎn)量。

（2）氮源

nisin的合成需要利用大量的氨基酸，因此氮源的種類直接影響著nisin的產(chǎn)量，一般選用胰蛋白、酪蛋白的水解物、植物蛋白胨、玉米漿等為氮源生產(chǎn)nisin。經(jīng)研究表明，以大豆蛋白胨、酵母膏、魚粉、棉子粉作氮源較為理想。此外，在基本培養(yǎng)基（以蔗糖為碳源添加8種必需氨基酸和5種維生素）中添加nisin前體氨基酸如半胱氨酸、蘇氨酸和絲氨酸等，有助于發(fā)酵液中nisin產(chǎn)量的提高。

（3）其他因素

無(wú)機(jī)磷酸根能夠影響某些nisin生產(chǎn)菌的產(chǎn)量，KH2PO4被認(rèn)為是最佳的磷源；金屬離子也是影響nisin發(fā)酵的因素，Ca2+能促進(jìn)nisin的生物量及活性增加，Mn2+則會(huì)減少nisin約1/3的產(chǎn)量(Matsusaki, et al.,1996)。

（4）pH

在最優(yōu)化的發(fā)酵條件下，可使乳酸菌菌體產(chǎn)量和nisin產(chǎn)量達(dá)到最優(yōu)值。目前工業(yè)化生產(chǎn)中，最佳的發(fā)酵溫度為30℃, pH的控制一般為5.8~6.3，由于菌種和培養(yǎng)基的不同，最佳pH值略有差異，目前控制pH值的方法有流加NaOH溶液和去除發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的乳酸(Yu,2002)，這兩種方法均可使nisin的產(chǎn)量得到大幅度的提高。生產(chǎn)中可通過(guò)將最后穩(wěn)定的酸性p H值反復(fù)堿化至初始p H值（中間的間隔時(shí)間大約為6小時(shí)）而使nisin產(chǎn)量翻倍。

3．發(fā)酵類型

目前工業(yè)化生產(chǎn)nisin大多采用分批發(fā)酵的形式，操作簡(jiǎn)單，能夠獲得較高的nisin產(chǎn)量，一般維持在4500~6000IU/mL，但是生物量和nisin的生成容易受到高濃度底物和代謝產(chǎn)物累積的制約，發(fā)酵終點(diǎn)不易判斷，生產(chǎn)效率低。

采用連續(xù)化工業(yè)生產(chǎn)可以通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基而解決這個(gè)制約的問(wèn)題，從而提高目標(biāo)物的產(chǎn)率。另外還有應(yīng)用膜技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞循環(huán)的連續(xù)化發(fā)酵技術(shù)，即將產(chǎn)生的nisin不斷地分離出反應(yīng)器，減少了代謝產(chǎn)物的抑制，產(chǎn)率略高于分批發(fā)酵和無(wú)細(xì)胞循環(huán)的連續(xù)發(fā)酵。用回收細(xì)胞進(jìn)行的連續(xù)發(fā)酵（用陶瓷膜保留細(xì)菌素）可在高稀釋度下生產(chǎn)nisinZ，在生產(chǎn)能力上有一定改善。但是連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌操作復(fù)雜，發(fā)酵過(guò)程中容易染菌，對(duì)設(shè)備要求高。

孔健等(2001)以海藻糖為載體對(duì)nisin生產(chǎn)菌進(jìn)行的固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)器中細(xì)胞濃度的增大，可以在稀釋率高于菌株最大生長(zhǎng)率的條件下進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，提高了生產(chǎn)效率，并且發(fā)酵液中的游離細(xì)胞少，有利于產(chǎn)品的分離純化。固定化培養(yǎng)有高產(chǎn)率、高細(xì)胞濃度、長(zhǎng)期操作穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但是固定化培養(yǎng)的缺點(diǎn)是單位效價(jià)較低，目前固定細(xì)胞顆粒的穩(wěn)定性和連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，仍然是首先需要解決的問(wèn)題。

補(bǔ)料分批發(fā)酵方式可以避免在分批發(fā)酵中因一次投料過(guò)多造成的底物抑制，葡萄糖的阻遏效應(yīng)以及因菌體生長(zhǎng)過(guò)旺而導(dǎo)致的nisin合成原料的不足，又比連續(xù)培養(yǎng)更易操作和更精確；應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中可以避免原料的浪費(fèi)，縮短生產(chǎn)周期，提高最終產(chǎn)物的濃度，對(duì)于降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率有著深遠(yuǎn)的意義。目前，對(duì)于nisin的補(bǔ)料分批發(fā)酵有非反饋控制和反饋控制兩類。前者完全是憑借經(jīng)驗(yàn)操作，可以是一次補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)液，也可以少量多次補(bǔ)加，還可以連續(xù)流加補(bǔ)料；而流加補(bǔ)料又分為恒速流加、變速流加和指數(shù)流加三種，這種非反饋控制的補(bǔ)料操作簡(jiǎn)單，但帶有一定的盲目性，重復(fù)性較差。后者是根據(jù)一、兩個(gè)可在線檢測(cè)的參數(shù)（如基質(zhì)糖殘留量、pH值和溶解氧濃度等）設(shè)定控制點(diǎn)，分為恒pH、恒殘?zhí)牵闳苎醯榷喾N補(bǔ)料方式，相對(duì)盲目性要小得多，重復(fù)性較好。

4．培養(yǎng)新型發(fā)酵方式——混菌發(fā)酵

將能利用乳酸的酵母菌(Kluyveromyces marxianus)和乳酸菌(Lactococcus lactis)共同培養(yǎng)，并通過(guò)控制發(fā)酵液中的溶氧濃度來(lái)控制發(fā)酵過(guò)程中的pH值。加堿控制pH值為6.0時(shí)，Nisin的產(chǎn)量為58mg/L；與酵母菌共培養(yǎng)時(shí)，nisin的產(chǎn)量為98mg/L(3920IU/mL)，是純培養(yǎng)的1.7倍(Shimizu, et al.,1999)。Liu等將Lactococcus lactis與另一種酵母Saccharomyces cerevisiae共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸基本都被酵母菌利用，且pH值維持在6左右，混合培養(yǎng)中nisin的產(chǎn)量為150.3mg/L，是L.lactis純培養(yǎng)的1.85倍(Liu, et al.,2006)。郭淑文等(2010)以乳清為原料將乳酸鏈球菌與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)混菌共培養(yǎng)，結(jié)果表明，混菌發(fā)酵對(duì)nisin的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，在接種比例為乳酸菌3%(V/V)，酵母菌5%(V/V)，混菌發(fā)酵16h時(shí)，效價(jià)達(dá)到782.05IU/mL，遠(yuǎn)高于單菌發(fā)酵。混菌發(fā)酵時(shí)，酵母菌的存在確實(shí)可以促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，比單菌發(fā)酵的乳酸菌數(shù)高出近5倍；研究還表明，混菌發(fā)酵解除了乳酸鹽對(duì)nisin發(fā)酵的抑制作用，這也是混菌發(fā)酵促進(jìn)nisin產(chǎn)生的原因。

加入酵母菌進(jìn)行混合培養(yǎng)的發(fā)酵不但能消耗掉生成的乳酸，同時(shí)由于酵母菌不能利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳糖或麥芽糖，從而不會(huì)影響nisin的產(chǎn)量，也不增加發(fā)酵成本，是一種很有前景的措施。

五、一種乳酸菌的分離與篩選

（一）乳酸桿菌的分離

從不同基質(zhì)中分離乳酸桿菌時(shí)，根據(jù)乳酸桿菌所在生長(zhǎng)環(huán)境的不同以及是否為優(yōu)勢(shì)菌可選擇不同組分的培養(yǎng)基。

1．MRS培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基適用于已知乳酸桿菌，是待分離區(qū)系的優(yōu)勢(shì)菌。目前MRS培養(yǎng)基已經(jīng)成為國(guó)際上公認(rèn)的用于乳酸桿菌分離較好的培養(yǎng)基，常用于從乳酸桿菌發(fā)酵制品中分離菌種以及菌種分離后的傳代培養(yǎng)。

2．RSMA

RSMA培養(yǎng)基是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種非選擇性培養(yǎng)基，其最大優(yōu)點(diǎn)是可以使不同菌種在其表面生長(zhǎng)并形成顏色各異易于鑒別的菌落。因此，便于乳酸桿菌與其他細(xì)菌的鑒別。但此培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分比較單一，不適于從菌群組成復(fù)雜的環(huán)境中分離乳酸桿菌。

3．番茄汁瓊脂培養(yǎng)基

這是一種傳統(tǒng)的用于分離乳酸桿菌的培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基中含有一定量的番茄汁，為乳酸桿菌的生長(zhǎng)提供了必要的營(yíng)養(yǎng)，使得乳酸桿菌在此環(huán)境下更易生長(zhǎng)。但操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，目前不常用。

4．其他培養(yǎng)基

某些選擇性培養(yǎng)基可用于在菌群復(fù)雜的基質(zhì)（例如腸道）內(nèi)進(jìn)行乳酸桿菌的分離。

（二）乳酸桿菌的鑒定

1．屬水平的鑒定

此水平的鑒定是乳酸桿菌整體鑒定過(guò)程中較為簡(jiǎn)單且最為基本的步驟，常用的方法是對(duì)分純后的乳酸桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，選擇無(wú)分叉的G+桿菌。這種菌能在pH4.5的條件下生長(zhǎng)，且經(jīng)過(guò)一系列相關(guān)試驗(yàn)均為陰性，即可鑒定其為乳酸桿菌屬。

2．種水平的鑒定

（1）生化鑒定

此水平的生化試驗(yàn)主要采用糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)。依據(jù)不同乳酸桿菌對(duì)糖的利用情況不同進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)的生化鑒定成本較低，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且反應(yīng)管種類較少，所得結(jié)果的判定受到限制。近年來(lái)，多采用最新研制的可得結(jié)果準(zhǔn)確可靠的快速生化鑒定系統(tǒng)。但價(jià)格昂貴，此兩種方法均不適于大規(guī)模菌種的鑒定。

（2）基因鑒定

PCR-隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的分析檢測(cè)，以獲得基因組DNA在待測(cè)區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性進(jìn)行鑒別，具有快速、簡(jiǎn)便、成本相對(duì)較低、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，尤其對(duì)于鑒別親緣關(guān)系較近的細(xì)菌更為有效，但需要相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株做參比。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR即RELP，是一種全基因組方法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、終點(diǎn)判斷準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但酶的選擇困難且價(jià)格昂貴。

PCR-變性梯度凝膠電泳PCR-DGGE可以區(qū)分含堿基成分不同而片段大小一致的DNA序列，甚至一個(gè)堿基對(duì)的不同都會(huì)引起DNA片段停留于凝膠的位置各異，具有快速、全面的特點(diǎn)。但此技術(shù)也有其限制性。

多重PCR可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)操作者技術(shù)要求較高且多重PCR的結(jié)果特異性較差。

3．株水平的鑒定

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)方法被認(rèn)為是乳酸桿菌分類鑒定的最好也是最有效的方法，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

思考題

1．什么叫微生物的分離，微生物分離有哪些常用方法？

2．以蛋白酶產(chǎn)生菌為例，設(shè)計(jì)一種高產(chǎn)蛋白酶菌種選育的整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，并寫出操作的實(shí)驗(yàn)原理及方法。

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