第二節 微生物菌種的分離與篩選技術

一、概述

人類利用微生物已經有幾千年的歷史，而微生物通常是肉眼看不到的微小生命體，而且廣泛存在于自然界。獲得目的微生物的渠道主要包括向菌種保藏中心購買和自行分離兩種。為了滿足人們的需要以及食品行業中的多樣性，性質優良的菌株不斷被發現。在自然界中篩選較為理想的生產菌種是一件極其細致和艱辛的工作。當前，借助于先進的科學理論和自動化的實驗設備，菌種篩選效率已大為提高。土壤是最豐富的微生物資源庫，動、植物體上的正常微生物區系是重要的菌種來源，而各種極端環境更是開發特種功能微生物的潛在資源。

二、傳統菌種分離與篩選技術

微生物菌種的分離與純化是研究和利用微生物的第一步，是微生物研究工作中最重要的環節之一。微生物的分離純化就是指從混雜的細胞群體中將不同的細胞區分開來達到分離純化，主要是根據不同的細胞所具有的各種各樣的特性來實現的，包括細胞的物理特性如密度、體積和電荷等，以及細胞的生物學特性如特異性表面標志和功能、對某種營養元素或抗生素的敏感性。不同種類的微生物，其特性和生理功能不同，因此，微生物的分離純化方法也有差異。微生物分離篩選的基本指導依據主要有根據篩選目標對象微生物的分類、生理生化與代謝特性等基本信息，研究分離篩選的培養基成分、培養條件甚至結合對象微生物的生態學理論或生產產品的特性等，在此基礎上設計分離篩選目標微生物。微生物分離篩選的基本步驟由以下幾個環節表示，分別為設計方案、采樣、增殖、分離和性能測定。

一般來說，菌種分離及篩選的操作流程如圖3-1所示。

（一）采集菌樣

首先選定目的微生物可能存在的場所，最常見的場所是土壤。由于每種微生物對生長環境包括營養物質、溫度、水分、陽光、通風等的要求都有所不同，因此在選擇場所時，必須對目的菌種有初步了解。比如要采集能分泌柚苷酶的菌株，查閱文獻或相關資料發現柚苷酶是一種能夠水解柚皮苷的胞外糖苷酶，而柚皮苷是柑橘類水果中富含的一種黃酮類物質，因此推測能分泌柚苷酶的菌株生長在柑橘類水果附近，從腐爛的柑橘類水果及其附近土壤就可以采集得到。

（二）富集培養

富集培養的首要任務是要找到適宜目的菌種的培養基，在自然條件下，凡有某種微生物大量生長繁殖的環境，必定存在著該微生物所必要的營養和其他條件，若直接采用這類自然基質經過滅菌，就可獲得一個初級的天然培養基。例如上述的產柚苷酶的菌株為曲霉，查找相關資料得知曲霉的生長溫度一般在28~30℃，常用的培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基。此外，可以根據菌種的特性適當增加或減少培養基成分或含量，比如，柚苷酶產生菌能分解柚皮苷產生葡萄糖，因此分離柚苷酶產生菌時在培養基中添加少量柚皮苷可以富集能產生柚苷酶的菌種。

（三）菌種分離純化

傳統分離純化方法包括固體培養基分離法和液體培養基分離法，固體培養基分離法利用稀釋平板對微生物進行分離純化；液體培養基分離法利用接種物在液體培養基中進行順序稀釋來純化菌種。這些方法無需特殊的儀器，分離純化的效果好。

1．固體培養基法

（1）稀釋倒平板法。先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如1∶10,1∶100, 1∶1000,1∶10000等），然后分別取不同稀釋液少許，與已溶化并冷卻至45℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時間即可出現菌落（圖3-2）。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。

（2）涂布平板法。將一定濃度、一定量的待分離菌液移到已凝固的培養基平板上，再用涂布棒快速地將其均勻涂布，使之長出單菌落而達到分離的目的。簡要操作步驟：①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液（不超過0.1mL）滴加到培養基表面。③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8~10s。④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面，涂布時可轉動培養皿，使菌液分布均勻（圖3-3）。

（3）平板劃線分離法。最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法（圖3-4），即用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行連續劃線，微生物細胞數量將隨著劃線次數增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養后，可在平板表面得到單菌落。有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法和四格法等。

2．液體培養基法

接種物在液體培養基中進行順序稀釋，至高度稀釋度，一支試管分配不到一個微生物；必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數（95%以上）表現為不生長；有微生物生長的試管得到的培養物就認為是純培養。

除了以上方法外，還可利用選擇培養基進行直接分離富集培養，或者單細胞（單孢子）培養法，但是有些微生物菌種很難進行人工培養，在實驗室條件下較難培養出菌落。這種情況還需結合微生物生態學理論綜合處理或通過分子生態檢測技術加以進一步研究，再制訂相應的分離純化方法。

3．單細胞分離法

只能分離出混雜微生物群體中占數量優勢的種類是稀釋法的一個重要缺點。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數。這時，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養以獲得純培養，稱為單細胞（或單孢子）分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。對于個體較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體，并在大量的滅菌培養基中轉移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對于個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養。在沒有顯微操作儀時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細胞分離，例如將經適當稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個細胞的液體來進行純培養物的分離。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求，多限于在高度專業化的科學研究中采用。

4．選擇培養基分離法

沒有一種培養基或一種培養條件能夠滿足一切微生物生長的需要，在一定程度上所有的培養基都是有選擇性的。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設計特定環境使之適合這種微生物的生長，因而能夠從混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養出來，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數。這種通過選擇培養進行微生物純培養分離的技術稱為選擇培養分離，特別適用于從自然界中分離、尋找有用的微生物。自然界中，大多數場合中的微生物群落是由多種微生物組成的，從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當某一種微生物所存在的數量與其他微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋法幾乎是不可能的。要分離這種微生物，必須根據該微生物的特點，包括營養、生理特征、生長條件等，采用選擇培養分離的方法。或抑制其他大多數微生物不能生長，或造成有利于該菌生長的環境，經過一定時間培養后使該菌在群落中的數量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養分離。

5．二元培養物

分離的目的通常是要得到純培養，然而，在有些情況下這是很難做到的。但可用二元培養物作為純化培養的替代物。含有兩種以上微生物的培養物稱為混合培養物，而如果培養物中只含有兩種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關系的培養物稱為二元培養物。例如二元培養物是保存病毒的最有效途徑，因為病毒是細胞生物的嚴格的細胞內寄生物；有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其他生物的細胞內寄生物，或特殊的共生關系。對于這些生物，二元培養物是在實驗室控制條件下可能達到的最接近于純培養的培養方法。另外，獵食細小微生物的原生動物也很容易用二元培養法在實驗室培養，培養物由原生動物和它獵食的微生物二者組成，例如，纖毛蟲、變形蟲和黏菌。

在以上介紹的幾種方法中，平板分離法普遍用于實驗室微生物的分離與純化。微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術完成。值得指出的是，從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落并不一定能保證是純培養。因此，純培養的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特征后才能確定，有些微生物的純培養要經過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。

（四）菌種的鑒定

在獲得純培養物后，需要對菌種進行鑒定，可通過表型特征以及遺傳特征進行鑒定，真菌類微生物一般可以通過表型特征進行鑒定，主要包括觀察菌落形態、生理和代謝特征以及生態特征。分子方面的鑒定可通過提取總DNA，擴增ITS區域(16SrDNA或28SrRNA), NCBI數據庫進行比對，選擇近緣序列構建系統發育樹進行鑒定。

（五）知識產權保護的申請

知識產權的問題越來越得到人們的關注，尤其是針對競爭激烈的微生物資源，研究方案都是應該被嚴格保護的，同時微生物資源開發包含重大的經濟利益，也包含重大的風險，為了保護自己的知識產權，在做好保密工作的同時，及時申請專利是非常必要的。

（六）菌種的改良

微生物資源的開發與利用在某種意義上講是微生物天然功能在人工控制條件下，按照人的意志進行改造。菌種改良的方法主要有傳統的隨機誘變法和基因工程手段。傳統的隨機誘變法使菌種發生基因突變，盡管這種方法與基因工程技術相比存在盲目性大、工作量大等不足，但容易實施，因此仍然是目前菌株改造最有效的方法。

（七）微生物生長條件優化、放大實驗及工程化

微生物都有其最適的生長條件，如溫度、酸度、水分活度等，在菌株未應用之前，應對該菌進行條件優化，一般的優化指標有pH、溫度和水分活度等。放大實驗或中試是微生物資源開發研究中一個重要的環節，其主要目的是對前期實驗的驗證和進一步探索。

三、食用菌的分離與鑒定方法

人們有目的地將特定品種食用菌的菌絲體單獨分離出來，從而將獲得的菌絲體進一步純化的過程為食用菌菌種分離。通常用的方法有組織分離、孢子分離、基內菌絲分離法及培養料分離法。通過觀察食用菌的生長情況即可對其進行鑒定。

（一）組織分離法

即通過切取菌索、子實體、菌核的新鮮幼嫩的組織進行分離，以獲取純菌絲的方法，屬于無性繁殖，最常用的菌種分離法之一。

（二）孢子分離法

即將食用菌成熟的有性孢子（擔孢子或子囊孢子）在適宜的培養基上萌發成菌絲體而獲得的純培養的方法，程序如下：選擇種菇—種菇消毒—采收孢子—接種—培養—挑菌落—鈍化菌種—母種。運用此法可獲得強活性、短菌齡的菌絲，同時可分離得到兼有雙親遺傳特性的有性孢子，可用于雜交育種和選育新種，適用于產孢子的真菌。

（三）基內菌絲分離法

即從食用菌生長基質中分離選擇獲得純菌種的方法。如可利用菇木及土壤等作為分離材料進行分離。此法操作較復雜，但適宜不易采得子實體、錯過子實體發生時期的菌類或膠質菌的菌種分離。

（四）培養料分離法

選擇長有優質子實體的移栽袋，待子實體長到成熟度80%時去子實體，對栽培袋進行消毒，同時將接種工具和接種培養料一起放入接種袋，消毒、接種，并在適宜條件下培養。

四、微生物分離檢測的發展

在分離篩選微生物時通常我們使用選擇性培養基來獲得單個的純化目的微生物，對于受到損傷的和熱應激的微生物還需要經過增菌培養，增菌過程包括前增菌、選擇性增菌和后增菌，因此從樣品中分離檢測某些微生物特別是病原微生物時需要很長時間，實際上檢測時間主要是等待增菌時間，這樣就遠遠不能適應快速檢測的需要，為了縮短檢測時間，有些學者考慮利用非選擇性增菌的方法來替代常規選擇性增菌步驟，節省了大量的時間，然后再用常規的標準方法來檢測和鑒定分離目標微生物。以下介紹幾種快速檢測分離微生物的方法。

（一）利用PCR-DGGE（基于聚合酶鏈式反應的變性梯度凝膠電泳）技術指導功能微生物的分離

由于食品成分的復雜性和微生物代謝途徑的多樣性，食品中微生物鑒定是一件重要但復雜的工作。現在通過分子生物學的方法在分子水平上分析食品中微生物群落結構和檢測微生物群落動態變化。

原理：采用PCR-DGGE技術對微生物群落進行多樣性分析，并將得到的信息用于指導微生物的分離，利用PCR將微生物擴增電泳進行圖譜分析，切割膠回收DNA進行測序，將測序結果進行比對。

方法：基因組總DNA的提取；基因組總DNA16S rDNA高可變區的PCR擴增；16S rDNA序列高可變區的DGGE分析；DNA片段序列分析。

應用：Orphan等通過擴增水樣中微生物群落總DNA的16SrDNA片段并克隆建庫分析了高溫油田微生物群落結構的組成；佘躍惠等基于16 SrDNA V3高可變區的PCR-DGGE圖譜分析結合條帶割膠回收DNA進行序列分析，對新疆油田注水井和相應采油井微生物群落的多樣性進行了比較并鑒定了部分群落成員（佘躍惠，2005）。程海鷹等采用PCRDGGE分析了在高溫、高壓和厭氧條件下富集培養的油藏內源微生物（程海鷹，2008）。這些研究探討了油藏微生物的種群多樣性，為內源微生物采油提供了清晰的生態學背景，從而為內源微生物提高石油采收率的機理研究提供更多理論依據。但是目前還沒有利用該技術對油藏微生物進行指導分離。

（二）針對性篩選方法——產果膠酶微生物篩選

1．透明帶法

透明帶法是將試驗用果膠酶加入果膠培養基上，恒溫培養數小時后試管培養基上部有略透明部分，用游標卡尺量出透明帶高度，透明帶越高證明酶活越大。這種方法不需加入特殊藥品，它所形成的透明帶較明顯，具有簡便、快速、結果直觀可信的特點，一次試驗可以同時做很多組樣品，省時省力，工作效率高，適用于果膠酶微生物的篩選和酶活性的定性鑒別。

2．透明圈法

（1）高碘酸透明圈法。利用果膠降解物在高碘酸中的溶解差別可以定性判斷果膠酶的存在。由于大分子聚合物不溶于酸，果膠酶降解的小分子溶于酸從而在瓊脂培養基板上形成透明圈。用果膠酶底物、緩沖液、淀粉和瓊脂配成溶液鋪板，然后加入少量的酶液，注入一點，反應一段時間后，加入高碘酸，如果該酶有活性，注入酶的點將出現透明圈。進一步可以傾出高碘酸溶液，加入砷酸鈉溶液，根據淀粉與碘的顏色反應，更易清楚地判明透明圈的存在。該方法對于果膠酶產生菌的篩選較方便，而且可以變換底物及pH等區別不同種類的果膠酶。

（2）剛果紅染料透明圈法。剛果紅染料可與果膠分解物即多糖水解物形成有濃郁色澤的復合物。測定時可用牛津杯法，將酶液加入培養基上的牛津杯中，由于所配制的果膠平板培養基中果膠是唯一碳源，所以能在其中生長的菌落均有能力產生果膠酶，作用數小時后，再加入剛果紅染色，用蒸餾水蕩去薄層表面剛果紅，對光即可見明顯的絳紅色透明圈出現。進一步可以使用鹽酸進行固定，透明圈立即變成藍色，此時透明圈仍清晰可見，但抑制了酶活力；酶活力可根據透明圈的大小判斷。

（3）十六烷基三甲基溴化胺透明圈法。十六烷基三甲基溴化胺（多糖沉淀劑）與果膠分解物也可形成無色透明圈，但背景帶乳白色，在果膠用量較大時結果較清晰，這種方法果膠用量較大，在實際運用中受到限制。

3．電泳轉移膠膜法

電泳轉移膠膜法的依據是果膠酶底物聚半乳糖醛酸鹽能被特殊染色劑染色。預先制備好聚半乳糖醛酸鹽——瓊脂糖超薄膜，果膠酶成分會自電泳凝膠上擴散進入超薄膜，經保溫后，置于溴化十二烷基三甲基胺溶液（或釕紅溶液）中保溫，此時未被酶降解的薄膜區域將染上顏色，酶作用的位點留下透明圈。用此法來檢測微量的果膠水解酶和裂解酶有一定優點，適于對電泳分離后的果膠酶作活性評價，也可用來篩選產果膠酶菌株，但操作過程較為煩瑣。

（三）針對性篩選方法——產柚苷酶微生物篩選

以柚苷酶產生菌株JMUdb054的篩選過程為例（集美大學食品與生物工程學院研究案例），了解食品新型菌株的篩選過程（圖3-5）。

1．原理

柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)組成的復合酶，它在柑橘類果汁脫苦、鼠李糖生產、食品增香、制藥工業等方面具有重要的應用價值(Yadav, et al.,2010)。柚苷酶可將柑橘類水果中的苦味物質——柚皮苷水解成無苦味的柚皮素，其中α-L-鼠李糖苷酶將柚皮苷分解為普魯寧和鼠李糖，β-D-葡萄糖苷酶又把普魯寧分解成無苦味的柚皮素和葡萄糖。如果以柚皮苷為唯一碳源或主要碳源配制培養基，柚苷酶產生菌因為產生柚苷酶，可以分解柚皮苷獲得葡萄糖和鼠李糖而快速生長，因此，可以用以柚皮苷為碳源的培養基進行平板分離和初篩，再通過測定菌株發酵液的柚苷酶活力進行復篩而分離得到柚苷酶產生菌株。

2．實驗材料與培養基

腐爛的柑橘果實及腐爛柑橘果實堆積處的土壤樣品。

基礎培養基（包括牛肉膏蛋白胨培養基、高氏培養基、查氏培養基、馬鈴薯培養基、斜面保存培養基），以柚皮苷為唯一碳源的固體平板發酵培養基和選擇性液體培養基。

3．篩選流程

4．柚苷酶活力的測定

用高效液相色譜法測定酶活力。將液體發酵液于常溫下5000r/min離心10min后取上清液作為粗酶液。準確量取1.0mL柚皮苷標準溶液(250μg/mL)與950μL檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.0)混合，置于50℃恒溫箱保溫5min，迅速加入50μL初酶液，于50℃恒溫箱中反應5min后立即于100℃沸水浴中加熱20min，迅速冷卻，經15000r/min離心10min后用0.45μm濾膜過濾，利用HPLC法測定柚皮苷和柚皮素的含量（色譜圖如圖3-6所示）。空白對照加入的酶液需事先滅活處理，按上述方法操作。

5．實驗結果

分離得到真菌146株、細菌218株以及少量放線菌。平板初篩選得到128株菌株對柚皮苷有分解作用（數據從略），說明這些菌株可能會產生降解柚皮苷的酶，即柚苷酶。經復篩得到一株具較強活力的柚苷酶菌株4-D6（圖3-7）。

6．菌株的初步鑒定

通過對菌株4-D6有性生殖、菌落形態、染色、制片及顯微觀察，發現該菌株含有有性世代；菌落在PDA上生長狀況良好，菌落呈橢圓形，表面突起為毛絨狀，邊緣粗糙，菌落初期菌絲為白色，生長孢子后為黑色，據此判斷其繁殖器官為分生孢子或粉孢子；菌絲體呈絨毛狀，分生孢子無隔膜，呈球形或擬卵圓形等；孢子梗無分枝，分生孢子聚成頭狀且串生；分生孢子梗從壁厚而膨大的菌絲細胞（足細胞）垂直生出，頂端膨大成球形的泡囊，分生孢子穗球形，紫褐色至黑色（圖3-8）。與真菌鑒定手冊第496頁中的檢索表中的描述[分生孢子穗球形，紫褐色至黑色（少有褐色或淺色的）]相符。與叢梗孢科(Moniliaceae)、單孢亞科(Amerosporoideae of Moniliaceae)、曲霉族(Aspergilleae)、曲霉屬(Aspergillus Mich.ex Fr.)、黑色曲霉組的描述基本上相吻合。進一步通過ITS-5.8SrDNA序列和鈣調蛋白基因序列系統進化分析表明該菌株是塔賓曲霉（圖3-9）。

五、微生物菌種的保藏

微生物菌種是一種極其重要而珍貴的生物資源，菌種保藏是一項十分重要的基礎性工作。菌種保藏機構的任務是在廣泛收集實驗室和生產用菌種、菌株、病毒毒株（有時還包括動、植物的細胞株和微生物質粒等）的基礎上，將它們妥善保藏，使之不死亡、不衰退、不污染和不降低生產性能，以供科研和生產單位之用。為此，國際上一些較發達國家都設有國家級的菌種保藏機構。例如，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)、美國典型菌種保藏中心(ATCC)、英國的國家典型菌種保藏所(NCTC)以及日本的大阪發酵研究所(IFO)等都是有關國家的代表性菌種保藏機構。

（一）菌種保藏原理

用于長期保藏的原始菌種稱保藏菌種或原種。菌種保藏的基本原理是：首先應挑選典型菌種或典型培養物的優良純種，最好采用它們的休眠體（如芽孢、分生孢子等）；其次是根據微生物的生理生化特性，人工創造一個有利于休眠的良好環境條件，如低溫、干燥、缺氧、缺乏營養素，以及添加保護劑或酸度中和劑等，使微生物處于代謝活動不活潑、生長繁殖受到抑制的休眠狀態。

干燥和低溫是菌種保藏中的最重要因素。據試驗，微生物生長溫度的低限約在－30℃，而酶促反應低限在－140℃。低溫須與干燥結合，才有良好保藏效果。細胞體積大小和細胞壁的有無影響著細菌對低溫的敏感性，一般體積大和無壁者較敏感。冷凍保藏前后的降溫與升溫速度對不同生物影響不同。細胞內的水分在低溫下會形成破壞細胞結構的冰晶體，而速凍可減少冰晶體的產生。在實踐中發現，較低溫度更有利于保藏，如液氮(－196℃)和－80℃的預凍效果顯著好于－25℃。冷凍干燥時添加適當保護劑可以提高菌種存活率，常用保護劑有：滲透保護劑（如甘油等）、半滲透保護劑（如海藻糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、肌醇等）、非滲透保護劑（脫脂乳、血清白蛋白、酪蛋白、酵母粉、β-環糊精、麥芽糊精、葡聚糖、透明質酸鈉、可溶性淀粉、纖維素等）、抗氧化保護劑（維生素C、谷氨酸鈉等），其中保護效果較好的有甘油、海藻糖、蔗糖、脫脂乳、透明質酸鈉、維生素C、谷氨酸鈉等，其保護機理：①甘油的羥基與胞內蛋白質形成氫鍵，以取代由水分子形成的氫鍵，從而保持蛋白質原有結構的穩定性。甘油還可與菌體表面自由基聯結，避免菌體暴露于介質中。②糖類和醇類的羥基與蛋白質中的極性基團或與細胞膜磷脂中的里氨酸基團形成氫鍵，保護細胞膜和蛋白質結構與功能的完整性。除此之外，海藻糖還具有較大的水化面積，能競爭結合更多的蛋白質水化層中的水，減少冰晶體的生成，并使蛋白質結構更加緊密。③脫脂乳等高分子保護劑以包裹形式在菌體表面形成保護層，如乳清蛋白形成的蛋白膜，可減少因細胞壁損傷而引起的胞內物質泄漏，避免菌體暴露于氧氣和介質中。此外，乳中其他成分亦有保護作用。④抗氧化保護劑可減輕過氧化物自由基對細胞的損傷作用，保護細胞結構和功能不被破壞。不同保護劑對不同菌種的保護效果各異，而且各類保護劑的保護機理各有千秋，一般復配的保護效果要優于單一保護劑，故實踐中通常以脫脂乳為基礎保護劑，通過試驗獲得復配的保護劑的最優組合配方。使用復配保護劑時，通常按一定比例與離心收集的菌泥混合，先于－80℃預速凍，再以凍干機進行干燥，即為凍干菌粉；或直接于－80℃條件下快速冷凍，即為冷凍菌液。

（二）常用的菌種保藏方法

一種良好的菌種保藏方法，首先應保持原菌優良性狀長期穩定，同時還應考慮方法的通用性、操作的簡便性和設備的普及性。在國際上最有代表性的美國ATCC中，近年來僅選擇最有效的冷凍干燥保藏法和液氮保藏法保藏所有菌種，兩者結合既可最大限度減少不必要的傳代次數，又不影響隨時分發給全球用戶，效果甚佳。我國CCCCM的菌種保藏規模目前為亞洲第一（有1.4萬余株各種微生物），現采用斜面傳代法、冷凍干燥保藏法和液氮保藏法進行保藏。具體操作方法詳見基礎微生物學實驗教程。