第二節(jié)　長(zhǎng)期毒理學(xué)試驗(yàn)

長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，就是反復(fù)多次給藥于動(dòng)物，觀察藥物對(duì)動(dòng)物的毒性反應(yīng)，一般是指連續(xù)給藥14天以上。過去將長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)分別稱為亞急性毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)和終生毒性試驗(yàn)，現(xiàn)各國(guó)都改稱為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)或重復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)。

長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)可以觀察連續(xù)反復(fù)給藥時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、劑量-毒性效應(yīng)的關(guān)系、主要靶器官（如近年來開展的含馬兜鈴酸中藥的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)研究）毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度、毒性反應(yīng)的可逆性等；動(dòng)物的耐受量、無毒反應(yīng)劑量、毒性反應(yīng)劑量及安全范圍；還可了解毒性產(chǎn)生時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及可能反復(fù)產(chǎn)生毒性反應(yīng)的時(shí)間、有無遲發(fā)性毒性反應(yīng)、有無蓄積毒性或耐受性等。這充分說明了長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)在臨床前安全性評(píng)價(jià)和有毒中藥研究中的重要地位，也是研究周期最長(zhǎng)、困難最大、耗資最高、重復(fù)量大的試驗(yàn)，它對(duì)于有毒中藥毒性作用靶器官、反應(yīng)的性質(zhì)和程度、毒性反應(yīng)的可逆性以及作用機(jī)制等起著舉足輕重的作用。

一、基本內(nèi)容和要求

各國(guó)對(duì)新藥臨床前長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的要求雖然有差別，個(gè)別國(guó)家差別甚至較大，但大多數(shù)國(guó)家的基本要求和內(nèi)容是近似或相同的，過多過繁的要求未必實(shí)用或合理，但過少過簡(jiǎn)則達(dá)不到長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的目的。下面主要根據(jù)我國(guó)新藥臨床前毒理學(xué)指導(dǎo)原則的要求，參照國(guó)外大多數(shù)國(guó)家的規(guī)定及我們的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)作綜合介紹。

1.動(dòng)物

嚙齒類動(dòng)物首選大鼠，非嚙齒類動(dòng)物選用犬（首選Beagle犬，也可用雜種犬），必要時(shí)可用猴或其他大動(dòng)物。動(dòng)物應(yīng)寫明供應(yīng)單位及郵政編碼、動(dòng)物品系及動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)（雜種犬例外）。大鼠要求6～8周齡，每次試驗(yàn)時(shí)體重差異不超過平均體重的20%。試驗(yàn)周期3個(gè)月以上，則可選5～6周齡大鼠。Beagle犬一般用4～12月齡，雜種犬齡 ＜ 5年。性別要求各半。

2.飼養(yǎng)管理

飼料應(yīng)寫明供應(yīng)單位，若自配的應(yīng)提供配方及成分含量的檢測(cè)報(bào)告。動(dòng)物室內(nèi)溫度、濕度、光照和通風(fēng)條件應(yīng)寫清楚。籠養(yǎng)大鼠每籠不宜超過5只，雌雄分開，有條件時(shí)單寵飼養(yǎng)，試驗(yàn)前至少適應(yīng)觀察1周。食量每天記錄，體重每周稱一次。犬單籠飼養(yǎng)，定量喂食，Beagle犬試驗(yàn)前至少馴養(yǎng)1～2周，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。雜種犬要預(yù)先檢疫、驅(qū)蟲，試驗(yàn)前至少馴養(yǎng)1個(gè)月。

3.受試藥

應(yīng)寫明藥名、批號(hào)、來源、規(guī)格、純度、理化特性、保存條件及配制方法。對(duì)所用的溶媒或其他賦形劑也應(yīng)注明規(guī)格、來源、純度、批號(hào)。受試藥應(yīng)符合臨床試用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)和藥效、一般藥理、急性毒性、藥代動(dòng)力學(xué)研究用藥有相同的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4.給藥途徑

一般要求與臨床給藥途徑相同。灌服時(shí)可直接灌服，也可將藥混入飼料或飲水中，但必須保證受試藥分布均勻。在配制飼料或溶于飲水中后藥仍應(yīng)穩(wěn)定，并要保證計(jì)量準(zhǔn)確。臨床靜脈注射（大鼠）時(shí)可用小鼠代替，肌內(nèi)注射或皮下注射時(shí)可變換注射部位，特殊情況另作說明。

5.劑量及分組

一般設(shè) 3個(gè)劑量組，劑量以 mg（ml、IU）/kg（m²）表示。一般以不等濃度等容量給藥。

（1）低劑量組：

目的是尋找動(dòng)物安全劑量范圍，為臨床劑量設(shè)計(jì)提供參考。它應(yīng)高于整體動(dòng)物最佳有效劑量或預(yù)計(jì)每天人用量，此劑量下應(yīng)不出現(xiàn)毒性反應(yīng)。

（2）中劑量組：

應(yīng)使動(dòng)物產(chǎn)生輕微的或中等程度的毒性反應(yīng)。

（3）高劑量組：

目的是為尋找毒性靶器官、毒性反應(yīng)癥狀及搶救措施提供依據(jù)，也為臨床毒副反應(yīng)監(jiān)測(cè)提供參考。高劑量應(yīng)使動(dòng)物產(chǎn)生明顯的或嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，或個(gè)別動(dòng)物死亡。

（4）另設(shè)空白對(duì)照組：

給予溶媒或其他賦形劑，若所用溶媒或賦形劑有毒性時(shí)則增加正常對(duì)照組，每組大鼠雌雄各10只，3個(gè)月以上應(yīng)增加到雌雄各20只；用大動(dòng)物時(shí)每組雌雄各3只，大劑量組宜各4只。

6.給藥周期

臨床給藥1～3天，則動(dòng)物給藥周期為14天，1周則為1個(gè)月，4周則為3個(gè)月，1個(gè)月以上需6～9個(gè)月。3個(gè)月或3個(gè)月以上可采取每周6天給藥，周日休息。每天給藥時(shí)間應(yīng)相同。

7.檢測(cè)指標(biāo)

（1）一般觀察：

外觀體征和行為活動(dòng)（包括神態(tài)萎靡、蜷縮不動(dòng)或過度興奮、躁動(dòng)驚跳、肌肉麻痹或震顫、步態(tài)異常等）、皮毛貼身或稀疏豎散、食量、體重及糞便性狀、顏色變化。大動(dòng)物應(yīng)增加瞳孔、肛溫、腹瀉、嘔吐、流涎、尿、皮膚黏膜（充血、發(fā)紺、蒼白）、眼、鼻、外陰部的異常分泌物等。群養(yǎng)時(shí)應(yīng)將出現(xiàn)中毒反應(yīng)的動(dòng)物取出單籠飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死動(dòng)物應(yīng)及時(shí)尸檢，一般宜1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。

（2）血液學(xué)指標(biāo)：

紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、白細(xì)胞總數(shù)及分類、血小板計(jì)數(shù)、凝血時(shí)間。這里Hb和紅細(xì)胞壓積（hematokrit，HCT）比紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）要穩(wěn)定可靠，尤其是貧血及血液學(xué)障礙時(shí)更明顯，如促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）實(shí)驗(yàn)時(shí)就發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。

（3）血液生化指標(biāo)：

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（total protein，Alb）、血糖（blood glucose，Glu）、總膽紅素（total bilirubin，TBill）、肌酐（creatinine，Cr）、總膽固醇 total cholesterol，TCh）。

（4）尿液檢查：

對(duì)大動(dòng)物要做尿液檢查。

（5）病理檢查器官①系統(tǒng)尸檢：

應(yīng)全面細(xì)致，為組織學(xué)檢查提供依據(jù)；②臟器系數(shù)：心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、胸腺、睪丸、子宮、腦和前列腺；③組織學(xué)檢查：對(duì)照組和高劑量組及尸檢異常時(shí)要詳細(xì)檢查，其他劑量組在高劑量組有異常時(shí)才進(jìn)行檢查，檢查器官有心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胰腺、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、垂體、前列腺、脊髓、胸骨（骨和骨髓）、淋巴結(jié)、膀胱、甲狀腺、胸腺、睪丸（連及附睪）、子宮（連及卵巢）和視神經(jīng)；④心電圖導(dǎo)聯(lián)：大動(dòng)物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)時(shí)必須做這一項(xiàng)。

8.恢復(fù)期觀察

最后一次給受試物后24小時(shí)每組活殺1/2～2/3動(dòng)物檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，留下1/3～1/2動(dòng)物繼續(xù)觀察2～4周，再活殺檢查，了解毒性反應(yīng)的可逆程度和可能出現(xiàn)的遲發(fā)性毒性反應(yīng)。在此期間，除不給受試物外，其他觀察內(nèi)容與給受試物期間相同。引起不可逆損傷者要慎重考慮臨床試驗(yàn)問題。

9.檢測(cè)指標(biāo)的時(shí)間

大鼠3個(gè)月以內(nèi)，一般在最后一次給藥后24小時(shí)和恢復(fù)期結(jié)束各進(jìn)行一次。必要時(shí)中間可進(jìn)行一次；大鼠3個(gè)月以上，可在試驗(yàn)中間活殺少量動(dòng)物（高劑量組和對(duì)照組）檢測(cè)指標(biāo)。犬的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)時(shí)則應(yīng)測(cè)正常值2次，即未給藥時(shí)測(cè)2次，給藥后1.1～1.5個(gè)月測(cè)1次，停藥測(cè)1次，恢復(fù)期結(jié)束測(cè)1次。

10.資料整理

（1）首頁(yè)寫明試驗(yàn)指導(dǎo)者，課題負(fù)責(zé)人，病理學(xué)檢查、血液生化指標(biāo)測(cè)定、血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定及給藥觀察等負(fù)責(zé)人的姓名、職稱，實(shí)驗(yàn)開始及結(jié)束日期，實(shí)驗(yàn)承擔(dān)單位，研究室負(fù)責(zé)人和資料保存單位等。

（2）第二頁(yè)書寫試驗(yàn)摘要。

（3）第三頁(yè)開始寫正文、引言、材料與方法、結(jié)果。用設(shè)計(jì)合理的統(tǒng)計(jì)圖、表清楚地顯示給受試物前、給受試物期間及停給受試物后各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定值（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差），以便了解受試物的劑量-毒性關(guān)系，有變化的指標(biāo)應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

（4）應(yīng)客觀地描述尸檢及組織病理學(xué)檢查結(jié)果，對(duì)各種異常現(xiàn)象可用半定量的方式表述，以便揭示其與劑量和時(shí)間的關(guān)系。

二、劑量設(shè)計(jì)

毒理學(xué)研究是保證臨床用藥安全的關(guān)鍵，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)是最主要的內(nèi)容，且難度最大、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、耗資而復(fù)雜，其成功與否的關(guān)鍵是劑量設(shè)計(jì)。

劑量設(shè)計(jì)的方法有多種，下面就常見的幾種方法作一介紹。

1.藥效學(xué)有效劑量法

根據(jù)藥效學(xué)（大鼠的藥效學(xué)）劑量選擇，原則上低劑量應(yīng)略高于主要藥效學(xué)研究的有效劑量，此劑量下動(dòng)物應(yīng)不出現(xiàn)毒性反應(yīng)，中劑量應(yīng)高于藥效學(xué)大劑量。

2.半數(shù)致死量法（LD₅₀法）

根據(jù)藥物急性毒性的LD₅₀決定3個(gè)劑量。一般大鼠3個(gè)月長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中高、中、低劑量可分別采用1/10、1/50和1/100左右的LD₅₀；犬可用大鼠試驗(yàn)用的一半左右的劑量。此法比較粗略，差異大，一般只作預(yù)試的參考。當(dāng)急性毒性和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)用的是同一種動(dòng)物，則參考價(jià)值可大些；反之，LD₅₀是小鼠的結(jié)果，則對(duì)大鼠和犬來講，因種屬差異而造成的誤差和風(fēng)險(xiǎn)將更大。一般小鼠的LD₅₀比大鼠和犬的要大，但也有例外，如鈣離子拮抗劑和某些有毒中藥就可能出現(xiàn)小鼠LD₅₀比大鼠小。

3.藥代動(dòng)力學(xué)法（MCD法）

根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)的結(jié)果，參照最大有效安全濃度（effective safe concentration，MCD），如大鼠3個(gè)月長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)時(shí)，低、中、高3個(gè)劑量可分別采用對(duì)大鼠的 1.0 MCD、3.0～6.6 MCD 和 10～20 MCD，犬一般可采用大鼠一半左右劑量。此法有參考價(jià)值，但也要注意動(dòng)物的異同性，尤其是用小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果時(shí)更應(yīng)慎重。此外，有不少藥代動(dòng)力學(xué)和長(zhǎng)期毒性是同期進(jìn)行的，甚至是事后補(bǔ)做的，故國(guó)內(nèi)實(shí)際用此法的不多。

4.最大耐受量法（MTD法）

用大鼠急性毒性的最大給藥劑量，即1個(gè)最大耐受量（MTD）、1/3 MTD和1/10 MTD分別為大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的3個(gè)劑量，對(duì)犬和猴可考慮用大鼠劑量的一半左右，或測(cè)出單次給藥犬或猴的MTD，方法同大鼠。此法對(duì)大部分動(dòng)物有參考價(jià)值，但少數(shù)蓄積性大的則不合適。

5.擬用臨床劑量法（ACD法）

根據(jù)同類型藥物或國(guó)外資料或擬推薦臨床劑量，一般3個(gè)月長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)時(shí)，大鼠可采用50～100倍、25～50倍、10～20倍臨床劑量，犬可分別采用30～50倍、15～25倍、5～10倍，猴也可用略低于犬的劑量進(jìn)行，此法參考價(jià)值較大，也較常用。

6.等效劑量法

根據(jù)人和動(dòng)物的等效劑量比值，再按一定倍數(shù)擴(kuò)大。此法參考價(jià)值較大，尤其是對(duì)抗腫瘤、鎮(zhèn)痛有毒中藥和外用藥等更有意義。

上述幾種方法是前人在一定條件下對(duì)某些藥物的毒性研究中總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，有參考價(jià)值，尤其是藥效學(xué)有效劑量法、MCD法、MTD法和ACD法，受到毒理學(xué)界的重視。但必須認(rèn)識(shí)到有毒中藥千差萬別，對(duì)具體藥物進(jìn)行認(rèn)真而細(xì)心的預(yù)試，才是摸準(zhǔn)劑量的關(guān)鍵。

三、劑量用體表面積和體重表示的換算

體表面積的計(jì)算公式通常有經(jīng)驗(yàn)公式和通用公式2種，2種公式計(jì)算結(jié)果對(duì)有些動(dòng)物是一致的，對(duì)有些動(dòng)物是不一致的，現(xiàn)介紹如下。

1.經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算法

見表4-3，此表從左與表上對(duì)應(yīng)項(xiàng)目計(jì)算^［2］。

舉例：由大鼠換算成犬的劑量。12kg犬與大鼠相交處為17.8（倍），如某藥大鼠劑量為250mg/kg，200g 大鼠給藥 250mg/kg×0.2kg=50mg。

50×17.8÷12=74mg/kg

大鼠約為犬用量的3.4倍（等效劑量）。

2.通用公式計(jì)算法

式中，S為體表面積（cm²）；W 為體重（g）。

這個(gè)公式適用于所有動(dòng)物，人也用此公式計(jì)算，就有可比性，沒有人為誤差，各國(guó)也多數(shù)采用這一公式。同樣以體重為橫坐標(biāo)，體表面積為縱坐標(biāo)，按兩個(gè)公式分別作圖，就可以比較其差異。同一體重時(shí)采用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算，小鼠、犬和猴的體表面積要比通用公式大，而大鼠則幾乎沒有差異。考慮大多數(shù)及上述實(shí)際情況，建議統(tǒng)一采用通用公式，減少人為誤差。

在實(shí)際工作中還發(fā)現(xiàn)有都不用上述2種公式來計(jì)算的，而是按體表面積劑量表示，如將小鼠、大鼠和犬的體質(zhì)量劑量分別擴(kuò)大3倍、6倍和20倍，就分別成為小鼠、大鼠和犬的體表面積劑量。經(jīng)過通用公式的數(shù)學(xué)推導(dǎo)及計(jì)算可知21.5倍、6.6倍和3.3倍，與上述做法基本吻合，但各種動(dòng)物隨體重增長(zhǎng)，其體表面積在增加，其體重與體表面積的比率也在不斷增加。以大鼠為例，如果實(shí)驗(yàn)開始時(shí)其體重為120g，則體重與體表面積的比率約為5.5，而到3個(gè)月停藥時(shí)，大鼠體重可增至400g左右，此時(shí)的比率就增加到8.2，如果從開始到停藥均用每千克給藥量的6倍作為每平方米體表面積的給藥量顯然是不合適的。對(duì)犬也是如此。給藥時(shí)間越長(zhǎng)，動(dòng)物體重變化越大，不合理性也越大。

總之，在以體表面積給藥時(shí)，在長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中可以通用公式計(jì)算體表面積。體表面積隨體重增加而增加，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，按實(shí)際面積給藥，這樣的研究資料才是可靠的，并有可比性和相當(dāng)?shù)膮⒖純r(jià)值。

四、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)所遵循的原則

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要遵循三大原則：重復(fù)、隨機(jī)、對(duì)照。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之前要做文獻(xiàn)及立題依據(jù)的工作，這一工作非常重要。前人、他人的工作情況，借鑒的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)方法及思路都有重要的意義，有毒中藥的實(shí)驗(yàn)同樣也遵循重復(fù)、隨機(jī)、對(duì)照原則。

1.重復(fù)

毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)能穩(wěn)定地重復(fù)出來，要求實(shí)驗(yàn)本身具有足夠例數(shù)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，減少實(shí)驗(yàn)的干擾因素，可能控制的因素設(shè)法控制一致。

（1）動(dòng)物：

記錄動(dòng)物的品系、體重、年齡、性別、飼料、飼養(yǎng)環(huán)境等。國(guó)內(nèi)外目前已有許多研究機(jī)構(gòu)建立了CLP實(shí)驗(yàn)室。GLP實(shí)驗(yàn)室要求恒溫、恒濕、光照自動(dòng)化控制，有很好的通風(fēng)、消毒設(shè)備，進(jìn)去后要更換衣服。

（2）藥物：

記錄藥物批號(hào)、純度、劑量、容量、注射速度、酸堿度、溫度等，中藥研究劑型工藝要穩(wěn)定，原料藥的產(chǎn)地品種要固定。

（3）儀器：

要了解儀器靈敏度、精細(xì)度、零點(diǎn)漂移、使用電壓方面的情況，這些對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有效數(shù)字的報(bào)告以及熟練操作等具有重要意義。

（4）人的因素：

對(duì)儀器掌握的熟練程度，基礎(chǔ)專業(yè)知識(shí)的掌握程度，對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間麻醉動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究，麻醉藥的選擇、用量、給藥途徑，判斷麻醉深淺程度等，均會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。一般毒性試驗(yàn)前，先用小批量的動(dòng)物做預(yù)試后再做正式試驗(yàn)。

2.隨機(jī)

隨機(jī)就是按隨機(jī)遇原則進(jìn)行分組，其目的是使一切干擾因素分配到各組時(shí)只受機(jī)遇抽樣誤差的影響，而減少主觀因素的影響。一般先將主控因素（體重、性別、模型形成的程度）分屬，然后再在每一檔中隨機(jī)取出等量動(dòng)物分配到各組，使較難控制的因素（如誘發(fā)程度、饑飽程度、疲勞程度、雌性周期）得到隨機(jī)化的安排。

3.對(duì)照

（1）意義

1）取得研究指標(biāo)數(shù)據(jù)的差異。

2）消除非被試因素對(duì)結(jié)果的影響。

3）其他作用：①找出綜合因素的主要依據(jù)；②驗(yàn)證方法的可靠性；③修正實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；④找出實(shí)驗(yàn)的最佳條件；⑤分析實(shí)驗(yàn)中錯(cuò)誤的原因。

用溶媒或輔料代替藥液同量注射者稱為陰性對(duì)照，用已知的典型藥物代替者稱為陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照可以隨時(shí)了解實(shí)驗(yàn)條件是否有變化，有利于判斷和對(duì)比所試藥物的作用，有利于對(duì)比統(tǒng)計(jì)；陽(yáng)性對(duì)照可檢查模型形成的情況，也可以與被試藥比較。對(duì)照組所用動(dòng)物數(shù)與實(shí)驗(yàn)組相同或是實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的總和。

（2）種類：

無處理對(duì)照（正常對(duì)照、非正常對(duì)照-模型、處理前后對(duì)照）。