第三節　特殊毒理學試驗

中藥中許多提取成分隨著藥效的增加其毒性也隨著加大，因此，有些藥物要進行特殊毒理試驗。其試驗內容可包括致突變作用、致癌作用和生殖毒性等，即所謂“三致”作用。其實，特殊毒理學的研究范圍尚可包含致敏和依賴性等內容。遺傳毒理學是近20年才逐漸發展起來的一門較為年輕的新興學科，與具有較長歷史經驗和知識積累的一般毒理學相比較，更顯得需要進一步發展完善和提高。對于中藥在特殊毒性試驗中獲得的結果，無論是否定的或是肯定的結果，都應進行科學和冷靜地全面分析，盡量避免作出盲目性與武斷的結論。有關致突變、致癌和生殖毒性試驗的方法本節不做詳細介紹，本節只介紹相關特殊毒理的各國研究內容及方法學進展。

在20世紀60年代發生引人注目的藥物悲劇“反應停”事件以前，國外對新藥臨床前毒理學評價一般僅要求提供新藥的急性、亞急性或慢性毒性試驗資料。此后，美國于1962年首先制定了藥物致畸胎試驗的特別條例，各國也相繼加強了要求與管理。藥物特殊毒性評價，尤其是遺傳毒性試驗，不像一般毒性試驗被人們較早地認識與接受。這主要是由于受某些學科的發展與技術進步所限。隨著50年代以來人們對DNA結構、DNA復制、基因密碼、蛋白質合成機制以及DNA修復過程等的基礎和實驗研究所取得的進展，為遺傳毒理學和致突變物的檢測等提供了可靠的理論和技術基礎。60年代以來，檢測誘變劑或致癌劑的短期試驗方法相繼建立，特別是1975年Ames創立的細菌誘變試驗問世，使得對大量化學物質及一些有毒中藥成分進行誘變性檢測成為可能。研究結果顯示，大量的致癌劑及一些抗癌中藥成分具有誘變性，或者說許多誘變劑具有致癌性。突變性與致癌性之間有良好的相關性。繼之而來的一些研究顯示，某些藥物本身就是誘變劑或致癌劑。例如某些抗腫瘤藥、抗生素、抗癲癇藥、抗精神病藥、解熱鎮痛藥和抗寄生蟲藥等。海恩酮和己烯雌酚以及雷公藤、細辛揮發油、黃樟醚、半夏、板藍根、喜樹、花椒等均可引起染色體畸變就是具體例證。這些事實使得藥物毒理學專家及有關管理部門大為警覺。70年代后期，世衛組織（World Health Organization，WHO）、歐洲經濟共同體（Commission of the European Communities，EEC）及經濟合作與發展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）等制訂了新藥管理法或試驗指南，其中不僅包括一般毒性試驗，更把特殊毒性試驗列入臨床前安全評價內容。由于新藥的研制與開發具有周期長、耗資大、成功率低等特點，各國對新藥臨床前毒理評價的要求（包括試驗項目與時機等）都有所側重或差異。而且隨著時間的推移、經驗的積累、認識的深化及毒理學自身的發展等，各國都在不斷修改和完善新藥安全性評價的要求。就遺傳毒性試驗而言，中國和主要工業化國家都有較為明確和具體的要求。各國對新藥遺傳毒性試驗項目的要求是很相近的。當然，從學術觀點看，無論從試驗戰略、項目要求到試驗程序等都存在著多種觀點與建議。但各國都必須在此基礎上，權衡利弊和考慮諸多因素形成本國的規定或指南。

值得指出的是，美國食品藥品管理局（Food And Drug Administration，FDA）對新藥的致突變性試驗并未提出明確的要求，但不能簡單地理解為FDA不需要對新藥進行致突變性試驗。相反，由于沒有像其他各國一樣規定明確的試驗項目，反而增加了某些不確定因素。

一、關于生殖毒性試驗

通常包括生育力與早期胚胎發育毒性試驗（Ⅰ段）、胚胎-胎仔發育毒性試驗（Ⅱ段）、圍生期毒性試驗（Ⅲ段），視情況還可設計子代的多代觀察。Kirkland（1993）對美國、日本、加拿大和歐共體的新藥生殖毒性試驗要求進行表格化比較^［4］。在各國的要求中存在著不少差異，如給藥的時機、期限以及對母體的剖檢和子代的觀察等，各國都希望能有一個統一協調的指南來規范試驗要求，以節省經費和避免由各國的差異而帶來的重復（適應對方的規定）。有人認為，生殖毒性試驗的基本原理與原則并不存在大的分歧，協調各國的要求恐怕首要的是商業利益上的考慮。雖然各國在某些方面，如動物種類、數量等方面存在一些差異，但試驗原則是大體相近的。然而，在對待進行生殖毒性研究的新藥類型上，不同類型各有所側重。例如美國早在20世紀60年代就發布了生殖毒性試驗指南，并強調兒童用藥必須進行此項試驗，非全身吸收用藥或老人專用藥則不必做此項試驗。日本則認為原則上所有新藥均應進行三段生殖毒性試驗，必要時還有附加要求。例如，測定藥物在母體、胎兒器官組織和血中濃度或乳汁中的代謝等，顯示日本的要求是更為嚴格的。加拿大則指明對老年用藥不需生殖毒性試驗。

二、關于新藥的動物致癌試驗

歐、美和日本各國的指南中均有相應的要求。然而，由于眾所周知的原因，即對傳統的動物致癌試驗人力和物力的投入巨大，故對新藥的致癌試驗都極為謹慎，各國對需進行致癌試驗新藥都提出了相應的前提條件。這些前提條件各國雖有所差異，但歸納起來下列各因素是進行致癌試驗時必須充分考慮和權衡的：化學藥及有毒中藥在化學性質上與已知致癌劑有關，其代謝物與已知致癌劑相似；在重復給藥或長期毒性試驗中具有細胞毒性作用，包括影響細胞有絲分裂或某些臟器、組織細胞異常顯著活躍；需長期使用的藥物（無論連續或間斷使用6個月以上者）；致突變試驗為陽性結果的新藥；能產生某些特殊的生物活性物質等。上述各項考慮的是進行致癌試驗的新藥自身毒理或藥理特點。

事實上各國對致癌試驗也有一些附加的考慮。例如，加拿大的指南就提出，對用于晚期癌癥患者的抗腫瘤藥物不必做致癌試驗。日本亦認為對于僅局限于某些靶器官的疾病，且該新藥對此種疾病有高度療效者亦不拘泥于上述考慮，也可不做致癌試驗。

關于動物致癌試驗的具體要求，各國的指南中均有相應的規定。從要求的主要內容顯示，各國指南中的要求基本一致或相近，不存在原則性的差別。例如，對動物種屬的要求，各國通常首選大、小鼠或倉鼠，其理由是這些動物容易繁殖及飼養，選擇這些動物進行試驗的理由是顯而易見的。僅加拿大提出有時可采用犬、靈長類或其他動物。對動物數量及性別（大、小鼠）均建議每一組用不同性別動物各50只。其他諸如對照組的設置（含賦形劑或溶媒對照）、實驗期限的要求、給藥途徑和劑量水平的設計等雖有一定差異，但原則上大多是一致或相近的。

給藥途徑應與人體擬用途徑一致或盡可能一致。動物管理按GLP要求，實驗因素以外的動物損失小于10%，對動物飼料也有明確要求。值得指出的是，我們在看到各國對新藥特殊毒性試驗要求在總體上的一致性或相似性的同時，也不應忽視各國之間在指導思想和具體試驗要求上的差異。這些差異往往導致本國的新藥進入另一國家市場受阻或不得不花費人力物力重新試驗以適合該國要求，此時這些差異就顯得特別重要和有意義。尤其是我國中藥面臨走向國際市場的新形勢，了解各國對新藥研究特殊毒理學試驗的內容和要求就顯得尤為重要。

三、致突變性試驗

遺傳毒理學試驗長期使用細菌回復突變試驗（recovery mutation test of bacteria）、小鼠睪丸染色體畸變試驗（chromosome aberration test in mouse testis）、小鼠精原細胞或精母細胞染色體畸變（chromosome aberration test of mouse spermatocyte or spermatocyte）、哺乳類細胞培養染色體畸變（mammalian cell culture chromosomal malformation）試驗以及整體動物的微核試驗等。細菌回復突變試驗常用的為鼠傷寒沙門菌營養缺陷型回復突變試驗，通常簡稱為Ames試驗；哺乳類細胞培養染色體畸變試驗用細胞遺傳方法檢測藥物是否影響細胞遺傳結構DNA或改變信息的實現過程，從而判定藥物的遺傳毒性；整體動物（嚙齒動物）的微核試驗是藥物致突變試驗中唯一的一項體內試驗，它是細胞培養染色體畸變試驗的一項補充和驗證。因此，微核試驗雖然技術上并不復雜，但它在評價藥物的致突變時，與體外試驗的細菌誘變和細胞染色體畸變試驗組合成為一套較為科學合理而完整的評價系統。

1.細菌回復突變試驗

通常簡稱為Ames試驗，它是1975年由Ames本人完整地提出用微生物檢測致突變物的方法，是目前檢測基因突變最常用的方法之一。試驗用菌株為鼠傷寒沙門菌不同組氨酸缺陷型突變株，根據致突變物能靈敏而特異地使組氨酸缺陷型突變株回變成野生型的特點，故在缺乏組氨酸的培養基上，只有少數自發回變菌落生長。而能誘發細菌回變的致突變物可使細菌生長增多，從而可判斷被試物是否具有致突變性。但是，試驗用的培養基中，并非真正完全不含組氨酸，它仍含有少量組氨酸。這樣，營養缺陷型的細菌才能繁殖數代成為菌苔，同時使誘變物所產生的DNA損傷在復制過程中轉變為突變，突變又表現為功能基因產物，只有這樣的回變細菌才能進一步生長成菌落。回復突變是某些特定基因座的突變，通常用帶不同基因的一套菌株進行試驗。Ames（1975）最初推薦的一套菌株為TA100、TA98、TA1535、TA1537和TA1538。但實踐表明，上述菌株對某些結構類型的化學物如醛類、過氧化氫及交聯劑等難以檢出。故于其后（1983）又推出另一套菌株，即TA97、TA98、TA100和TA102四株菌作為一套標準測試菌株，我國規定使用的菌株與此相同。

目前有關細菌回復突變試驗研究進展主要是在適合GLP的規范化研究上。適合GLP的試驗與為研究而實施的試驗相比，明顯的不同在于它是在指南的基礎上，根據標準操作規程（standard practice instructions，SOP）規定，從操作程序計劃到最后完成報告書等都要實施管理。適合GLP的試驗實施上最主要考慮的是關于SOP，SOP重點是對設施管理、試驗實施（試驗操作、記錄、結果判定等）的計劃、最終報告書、質量保證的監督檢查、培訓等。試驗因為遵循指南和GLP原則，所以能得到可信度高的資料。該試驗經常出現的問題是：中藥提取物樣品處理不當；除了設陽性物對照組外，應當考慮增設溶劑對照。另外，滅菌也很重要，溫度低了，樣品芽孢桿菌不能殺滅，故容易出現假陽性結果，劑量設計最高劑量為5mg，組距為等比或等差。

2.哺乳類細胞培養染色體畸變試驗

檢測藥物是否影響細胞遺傳結構DNA或改變信息的實現過程，從而判定藥物的遺傳毒性，是比較成熟和可靠的方法之一。可用于染色體分析的細胞包括人類和動物細胞等。可分別用體細胞或生殖細胞進行。前者可用骨髓細胞、外周血淋巴細胞和動物某些器官組織細胞來代表體細胞。后者以雄性動物的精原細胞和初級精母細胞作為生殖細胞的代表。

上述不同類型細胞各有其特點，在研究工作中能為我們提供適應研究目的所需的材料。然而，在新藥的染色體畸變試驗中，要求用哺乳動物培養細胞做染色體畸變試驗，并建議首選中國倉鼠肺細胞（Chinese hamster lung cells，CHL）。這當然不是說其他類型的細胞不能用于藥物的遺傳毒理研究。顯而易見的原因是，以細胞株的單層細胞培養物進行遺傳學分析有其優點。首先，在細胞分裂周期時間、染色體數目和克隆形成率等參數上一致；其次，細胞株可以冷凍長期保存，使用時可以復蘇并傳代，甚為方便。

可用于體外細胞培養染色體畸變分析的細胞系株有多種，但最常用的有中國倉鼠卵巢細胞系（Chinese hamster ovary cell line，CHOCL）、中國倉鼠肺成纖維細胞系（Chinese hamster lung fibroblast cell line V79，V79 和 CHL）和人胚肺二倍體成纖維細胞等。從世界各國情況看，CHL與V79細胞使用頻率最高，這些細胞株具有世代時間短（一個世代為12～14小時）、染色體數目較少（2n=22或25）和核型穩定等特點，均不失為研究工作中的良好材料。另外，1997 年人用藥品注冊技術要求國際協調會（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）提出了用哺乳類動物細胞的基因突變試驗（gene mutation test in mammalian cells，GMC）小鼠淋巴瘤基因突變試驗（lymphoma gene mutation test in mice，LMM）代替染色體畸變試驗，并得到認可。MLA是1978年由Clive和Moore等開發的以小鼠淋巴瘤L5178Y胸苷激酶基因（tk）為目的基因的突變試驗。該試驗法與以往的基因突變檢測法不同，它的最大特征是不僅可以檢出點突變等小的DNA變異，還能檢出染色體水平的較大DNA缺失以及染色體之間重組引起的變異。為此，在理論上可以覆蓋此前的Ames試驗檢測的誘變劑（mutagen）和染色體畸變試驗檢測的斷裂劑（clastogen），即作為廣譜（wide-spectrum）的基因突變檢測法而受到重視。另外，這里可以檢測的所有突變還對應于人的腫瘤組織觀察的腫瘤基因和腫瘤抑制基因的突變，為細胞癌變過程基因變化的模型。MLA法已經在美國和歐盟作為染色體畸變試驗的代替法得以應用，目前在我國和日本還開展得不多。為使我國在中藥的遺傳毒理學評價方面與國際接軌，有必要在國內盡快推廣tk基因突變試驗方法。

3.整體動物的微核試驗

目前體內遺傳毒性試驗最為常用的是嚙齒類動物微核試驗。與其他的體內試驗系統相比，由于該試驗的方法較簡便，積累了較多數據，并且基本上建立了標準的操作規程，因此確立了其作為常規試驗方法的地位。最初，微核試驗使用的是骨髓材料，而最近的研究顯示，使用末梢血也可以進行相同的評價^［3］，因而遺傳毒理學的評價變得愈加簡便。

通常，微核試驗是通過觀察幼紅細胞來檢測骨髓嗜多染紅細胞產生的染色體的變化，因此使得骨髓以外器官為靶器官的物質的檢測受到限制。例如，有名的致肝癌化合物（diethylnitrosamine）在微核試驗中便是陰性。近年雖開發了使用肝臟和皮膚等器官的微核試驗方法，但還處于未普及階段。在這一背景下，國際上相繼開發了具有能夠檢測所有臟器之優點的新方法——轉基因小鼠基因突變檢測系統。該方法是將大腸埃希菌lacI、lacZ等基因連接于噬菌體等載體上，導入小鼠體內，通過噬菌體包裝從所有臟器回收靶基因，再使用大腸埃希菌進行突變檢測。最近由于方法的改進，評價變得更為簡單，因此逐步得到了普及。隨著數據的積累，其適用性也在得到確認，今后可以期待其作為微核試驗的補充方法得到進一步的應用。為此，與微核試驗一樣，須建立標準的試驗操作規程，目前國際上在IWGTP（International Working Group for Technical Protocol）等組織正在進行協調。

近年隨著分子生物學的進步，遺傳毒理學領域新技術方法的研究和開發也非常活躍。過去，在管理體制下基于已經建立的方法及其試驗結果進行遺傳毒性的判斷。但是，隨著人的基因多樣性研究的不斷深入，今后會更進一步發展。