第四章　中藥毒理學(xué)研究

第一節(jié)　急性毒性試驗(yàn)

中藥毒理研究內(nèi)容包括急性毒性、長期毒性、特殊毒性、局部毒性和一般藥理學(xué)研究，見表4-1。

1.急性毒性試驗(yàn)的目的和意義

急性毒性試驗(yàn)是指動物一日內(nèi)單次或多次（中藥或毒性極低的西藥等在24小時(shí)內(nèi)分2～3次給藥）給藥后在7天或14天（如抗炎藥、抗瘧藥或其他死亡時(shí)間拖得較長的藥物）中，連續(xù)觀察動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況。毒性試驗(yàn)的觀察應(yīng)從定性和定量兩方面進(jìn)行。所謂定性觀察就是觀察服藥后動物有哪些中毒表現(xiàn)、毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的速度如何、涉及哪些組織和器官、最主要的可能毒性靶器官是哪個(gè)、損傷的性質(zhì)及可逆程度如何、中毒死亡過程有哪些特征、可能的死亡原因是什么等。所謂定量觀察就是觀察藥物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系，主要指標(biāo)有近似致死劑量（approximate lethal dose，ALD）、LD₅₀和致死劑量（lethal dose，LD），以 LD₅₀為主要定量指標(biāo)（小動物），大動物可用ALD。了解藥物單次或短時(shí)間內(nèi)多次給藥后，動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，急性毒性試驗(yàn)的目的是為臨床安全用藥及監(jiān)測提供一定的參考。

（1）了解新藥急性毒性的強(qiáng)度：

任何物質(zhì)達(dá)到一定劑量都可能致死。在前面章節(jié)里已經(jīng)談及無毒不成藥。雖然沒有人認(rèn)為僅根據(jù)LD₅₀就可決定毒性大小、分級標(biāo)準(zhǔn)，指標(biāo)不應(yīng)是單純一個(gè)LD₅₀或LC₅₀，還應(yīng)考慮不同有毒中藥中毒死亡的起始時(shí)間、最長致死時(shí)間和平均致死時(shí)間，但這些往往被人們所忽略。一般來說，毒性大而快的死亡快，毒性小而慢的則死亡慢，對臨床用藥也有一定的參考價(jià)值。急性毒性還應(yīng)由中毒或發(fā)病及可治愈情況等綜合指標(biāo)作評價(jià)。根據(jù)中藥特點(diǎn)，我國中藥的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)部分參照夏麗英的《現(xiàn)代中藥毒理學(xué)》和楊倉良編著的《毒藥本草》，依照中藥臨床中毒癥狀的程度、LD₅₀的大小、有效量與中毒量的距離、劑量的大小、中毒潛伏期的長短等多項(xiàng)指標(biāo)，對中藥毒性進(jìn)行分級，見第一章的表1-1，被許多中醫(yī)藥專家采用。

（2）計(jì)算新藥相對毒性參數(shù)：

對有毒中藥來講，LD₅₀越小，毒性越大，對人產(chǎn)生危害的可能性就越大。對藥物來說，用相對毒性參數(shù)來衡量更有實(shí)際意義。相對毒性參數(shù)有治療指數(shù)和安全范圍等。相對毒性參數(shù)越大，則產(chǎn)生毒性所需的劑量與產(chǎn)生療效所需劑量的比值越大，當(dāng)然安全范圍就越大。盡管稱為安全系數(shù)或可靠安全系數(shù)，但仍被稱為不滿意的安全界量系數(shù)，這是因?yàn)榫哂型籐D₅₀或ED₅₀的量效曲線，其斜率可能相差很大，有時(shí)一個(gè)藥的基本有效量（median effective dose 50，ED₅₀）或肯定有效量（median effective dose 99，ED₉₉）也可能在致死劑量的范圍內(nèi)，這樣便不能滿意地保證安全。究竟安全系數(shù)多大才認(rèn)為安全性較大，這要對具體藥物進(jìn)行具體分析，而且要根據(jù)動物、病情、藥物等情況來綜合考慮，所以急性毒性試驗(yàn)不只是求出LD₅₀，還應(yīng)觀察動物的整體反應(yīng)情況。

（3）為臨床毒副反應(yīng)的監(jiān)測提供參考依據(jù)：

通過動物急性毒性反應(yīng)可以了解中毒癥狀、起始時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和消失時(shí)間等，對死亡的對抗試驗(yàn)也可為臨床急救措施提供依據(jù)，上述對臨床觀察患者用藥后毒副反應(yīng)的產(chǎn)生有很大幫助。如烏頭類對動物的急性毒性產(chǎn)生的心律紊亂反應(yīng)，臨床應(yīng)用時(shí)患者產(chǎn)生心律失常就是提示要減量或慎用，同樣臨床需采取相應(yīng)的搶救措施，保證患者安全治療?？梢姡敿?xì)觀察記錄動物的急性中毒癥狀，不僅有助于對臨床可能產(chǎn)生的毒副反應(yīng)監(jiān)測提供參考，也為尋找毒性靶器官提供參考方向。盡管詳細(xì)觀察記錄了動物的毒性反應(yīng)，但也只是供作參考，因?yàn)閷λ幬锓磻?yīng)的種屬差異決定了預(yù)測價(jià)值的局限性。毒理學(xué)家對動物毒性反應(yīng)的種屬差異印象深刻，不僅在質(zhì)反應(yīng)方面，在量反應(yīng)方面也很明顯。經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，一個(gè)有毒中藥的毒性在實(shí)驗(yàn)動物中表現(xiàn)出明顯的種屬特異性時(shí)，對人的毒性如何也很難作出判斷；反之，如果藥物的毒性反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動物中種屬差異很小，特別是以體表面積為單位來計(jì)算時(shí)，種屬之間的差別就更小，如一些抗癌中藥成分，臨床也證明人的中毒劑量與實(shí)驗(yàn)動物很接近。又如青蒿素類在各種已觀察的動物中均可引起明顯的骨髓造血抑制，特別是紅系造血抑制，臨床也證明人也會產(chǎn)生同樣的毒性反應(yīng)。

有人認(rèn)為，當(dāng)不同種屬動物對同一種有毒中藥的毒性反應(yīng)接近時(shí)，可以設(shè)想人的反應(yīng)可能也在近似的范圍之內(nèi)。當(dāng)表現(xiàn)出明顯的種屬差異時(shí)，選擇首次臨床人用量應(yīng)特別小心。上述看法有一定道理，但萬萬不能當(dāng)成規(guī)律，藥物千變?nèi)f化，作用環(huán)節(jié)各不相同，對具體藥物只能具體分析，遵循安全第一、循序漸進(jìn)的原則，從最小劑量進(jìn)行人體試驗(yàn)，逐漸增量才是可取的。

（4）為長期毒性、蓄積毒性、特殊毒性及藥效等試驗(yàn)選擇劑量提供依據(jù)：

按藥政管理法規(guī)規(guī)定，長期毒性試驗(yàn)的最高劑量必須既能使毒性充分表現(xiàn)出來，又能使大多數(shù)動物存活，中劑量應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，低劑量則要求不出現(xiàn)毒性反應(yīng)。要選擇好劑量是很不容易的，即使通過預(yù)試，也不是輕而易舉的事。在中藥長期毒性試驗(yàn)中，最高劑量做出毒性反應(yīng)的例子并不多，原因是很多中藥確實(shí)毒副作用小，另外，長期以來在人們認(rèn)識上有“誤區(qū)”，認(rèn)為中藥長期毒性試驗(yàn)?zāi)茏龀龆拘詠聿焕趫?bào)批，所以很多有關(guān)的毒性信息反映不出來，值得警惕。長期毒性劑量設(shè)計(jì)有多種方法，其中有2種是根據(jù)急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果來設(shè)計(jì)的，一種是LD₅₀法，另一種是最大耐受量（maximum tolerated dose，MTD）法，劑量設(shè)計(jì)詳見長期毒性的劑量設(shè)計(jì)部分（見第四章第二節(jié)）。蓄積性毒性劑量設(shè)計(jì)是用1/10 LD₅₀，然后按等比級數(shù)1.5倍逐漸遞增進(jìn)行的。生殖毒性試驗(yàn)高劑量的選擇原則，即母鼠的MTD（可以產(chǎn)生輕度毒性反應(yīng)），可從急性毒性中找出。致突變試驗(yàn)中的嚙齒類動物微核試驗(yàn)高劑量是1/2 LD₅₀；果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)的高、低劑量分別為1/2 LD₅₀和1/4 LD₅₀；嚙齒類動物的顯性致死試驗(yàn)中，高劑量應(yīng)導(dǎo)致毒性癥狀；精原細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)中，高劑量應(yīng)為1/2 LD₅₀。動物短期致癌試驗(yàn)中，高劑量應(yīng)是MTD。此外，主要藥效學(xué)劑量限度、一般藥理學(xué)和藥代動力學(xué)劑量設(shè)計(jì)也要參考急性毒性的LD₅₀。

2.急性毒性試驗(yàn)的技術(shù)要求

中藥急性毒性試驗(yàn)的內(nèi)容和方法已有很多書介紹過，現(xiàn)就有毒中藥急性毒性試驗(yàn)的技術(shù)要求提出幾點(diǎn)意見，供參考。有毒中藥急性毒性試驗(yàn)除了遵循實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的三大原則外，還必須注意以下幾方面的問題：

（1）藥物濃度、給藥容量、給藥途徑：

有毒中藥急性毒性試驗(yàn)一般以不等濃度等容量給藥，特殊情況下可以等濃度不同容量，劑量應(yīng)以折合生藥量（g/kg）表示，這里應(yīng)注意單位浸膏（或干粉）所含的生藥量，然后用千克體重所給的浸膏或干粉量×單位浸膏（或干粉）所含的生藥量來折合生藥量（g/kg）。原則上必須和臨床給藥途徑相同。特殊情況下做不到，則應(yīng)作說明。如肛門栓劑小鼠急性毒性試驗(yàn)，因藥學(xué)原因及生理?xiàng)l件無法進(jìn)行時(shí)，則要交代清楚，以最大濃度、最大允許量單次給予或用別的途徑給予。灌胃一般宜空腹12～16小時(shí)，日本為4～6小時(shí)，也有學(xué)者認(rèn)為禁食1小時(shí)以上，按慣例以空腹12～16小時(shí)居多。禁食時(shí)間對測定LD₅₀影響很大，有研究表明，給大鼠灌胃NaCl的LD₅₀，禁食時(shí)為3.8g/kg，不禁食為6.4g/kg，相差近1倍。中藥或復(fù)方制劑所采用的助溶劑為水溶性或采用0.2%～0.5%羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）混懸液進(jìn)行灌胃給藥，很難制成真溶液，因此限制了給藥量，特別是腹腔注射問題較多，很多人將中藥或復(fù)方的水提物不作任何處理直接腹腔注射測定LD₅₀，這種做法很不科學(xué)，腹腔注射的制劑應(yīng)與靜脈注射制劑要求相似，急性毒性試驗(yàn)不同動物給藥途徑及常用容量和最大容量，詳見表4-2。

（2）中毒癥狀要詳細(xì)記錄：

對中毒癥狀要作詳細(xì)記錄，這在許多有關(guān)急性毒性試驗(yàn)內(nèi)容的書及試驗(yàn)者中往往被忽略。試驗(yàn)中尤其是對中毒和死亡發(fā)生時(shí)間、中毒癥狀、持續(xù)時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間應(yīng)作詳細(xì)記錄，如果注射以后不及時(shí)進(jìn)行觀察，到第2天，甚至更長時(shí)間才觀察，此時(shí)也許動物已全死亡。試驗(yàn)者要有一定的倫理意識，重視每一個(gè)生命個(gè)體在試驗(yàn)中提供的毒性信息及對人類科學(xué)試驗(yàn)所作的貢獻(xiàn)。試驗(yàn)資料僅提供一個(gè)LD₅₀是不夠的，它只是一個(gè)定量的指標(biāo)，還應(yīng)有定性指標(biāo)及可逆性與否等，一個(gè)完整的急性毒性試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)既有LD₅₀，還應(yīng)有定性指標(biāo)的報(bào)告。

（3）嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件：

試驗(yàn)最好在GLP條件下進(jìn)行。若不具備GLP條件，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)觀察室適應(yīng)2～3天，室溫（20±3）℃，相對濕度30%～70%，人工照明12小時(shí)，通風(fēng)應(yīng)良好，籠具應(yīng)清潔，飼料及用水應(yīng)新鮮，否則均會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。如苯丙胺在15.5℃時(shí)測定的LD₅₀為197mg/kg，在27℃時(shí)為90mg/kg，相差約1倍；去氧麻黃堿在15.5℃時(shí)測定的LD₅₀為111mg/kg，在27℃時(shí)為33mg/kg，相差3倍以上。中藥及中藥復(fù)方急性毒性試驗(yàn)條件控制的研究報(bào)告不多，今后應(yīng)加強(qiáng)。群居小鼠和獨(dú)居小鼠對LD₅₀測定也有影響，尤其是興奮藥，在狹小空間群居造成溫度升高引起的相互刺激使毒性增加明顯。動物房氨濃度應(yīng)控制在20ppm以下，或藥理毒理人員進(jìn)去不感到刺鼻，無異常感。若氨濃度 ＞ 200ppm，藥理毒理人員無法進(jìn)去，則肯定易誘發(fā)動物生病，長期毒性試驗(yàn)時(shí)則更明顯。所以鼠籠若以木屑墊底，木屑應(yīng)消毒，最好每天更換，最長不超過3天，飲水每天更換。每天上下午通風(fēng)（抽氣）至少半小時(shí)。

（4）劑量選擇：

劑量設(shè)計(jì)是否合理是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，一般先“撒大網(wǎng)”，即用少量的動物（雌雄各2只）求出不死和全死的劑量或10%死亡及90%死亡的劑量（雌雄各5只），然后根據(jù)有毒中藥的毒性大小決定組距，一般分4～6組。大動物則用6條犬左右，用50%劑量遞增，且間隔一個(gè)劑量用藥，尤其是對毒性大而猛烈的有毒中藥則更容易處理。

（5）試驗(yàn)周期：

給藥后至少觀察2周或更長。時(shí)間太短結(jié)果往往不可靠。進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)時(shí)僅觀察24小時(shí)，這樣短的時(shí)間內(nèi)往往看不到神經(jīng)系統(tǒng)的毒性，有些有毒中藥從得出的LD₅₀看也認(rèn)為毒性不太大，但在做臨床試驗(yàn)時(shí)，往往容易出危險(xiǎn)。

（6）最大給藥量（MTD）：

有些有毒中藥毒性較低，測不出LD₅₀，則可測其最大給藥量。采用擬推薦臨床試驗(yàn)的給藥途徑，以動物能耐受的最大濃度、最大容量，1次或1日內(nèi)連續(xù)給藥2～3次（間隔6～8小時(shí)）。如用小鼠測試，動物數(shù)不得少于20只，雌雄各半，連續(xù)觀察14天，對神經(jīng)系統(tǒng)有毒性的中藥可連續(xù)觀察14天，詳細(xì)記錄動物的反應(yīng)。動物體重變化是主要客觀指標(biāo)，給藥前、后應(yīng)定期測量并記錄，所得結(jié)果應(yīng)列表進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。為此，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)空白對照組，與給藥組進(jìn)行對比分析。還應(yīng)計(jì)算總給藥量（g/kg，按生藥量折算），并推算出相當(dāng)于臨床日用量的倍數(shù)，綜合評價(jià)受試藥物毒性大小。

3.急性毒性試驗(yàn)中的LD₅₀計(jì)算方法及意義

急性毒性試驗(yàn)中的LD₅₀計(jì)算方法有白侖法（又稱累計(jì)法）、米勒和滕特爾二氏法［又稱目測法、概率法（對數(shù)概率單位繪圖法，1944年）］、寇氏法（又稱克貝爾法）、點(diǎn)斜法（孫瑞元改良寇氏法，又稱綜合計(jì)算法）、改良寇氏法（顧漢頤改進(jìn)寇氏法）、韋爾法（又稱概率單位法）、Bliss法、Bliss-Finney法（改進(jìn)Bliss法，又稱概率單位加權(quán)回歸法）、序貫法（又稱上、下法或階梯法）、李其飛爾德和維爾可松法（即圖解法，1947年）、何爾恩法（改良維爾法即簡化概率單位法）、簡單回歸法、加權(quán)近似法、移動平均法［Thompson（1947）及 Weil（1952）法］。

其中比較常用的有Bliss-Finney法、點(diǎn)斜法、改良寇氏法、何爾恩法，前兩種方法較準(zhǔn)確。現(xiàn)在因計(jì)算機(jī)已經(jīng)普及，Bliss-Finney法是目前首推使用的LD₅₀計(jì)算方法。其實(shí)，測定LD₅₀準(zhǔn)確與否關(guān)鍵在于動物選擇、藥物稱量配制、給藥的熟練程度及預(yù)試驗(yàn)，至于用何種方法計(jì)算，不是根本問題。每一種計(jì)算方法在各種藥理學(xué)試驗(yàn)方法中都有介紹，這里不再一一贅述。

隨著對動物毒性試驗(yàn)認(rèn)識的不斷深化，經(jīng)驗(yàn)日益豐富，以及西方國家動物保護(hù)主義者要求減少實(shí)驗(yàn)動物的痛苦及消耗的壓力不斷加強(qiáng)，再加上中藥新藥開發(fā)研究消耗資金的不斷上升，制藥工業(yè)界和毒理學(xué)界對藥政管理法關(guān)于LD₅₀的測定問題提出不同看法。如1981年，國際毒理學(xué)界以LD₅₀和急性毒性試驗(yàn)為專題而召開的學(xué)術(shù)討論至少有兩次，主要傾向是反對把經(jīng)典的LD₅₀測定列為一切新藥安全評價(jià)的常規(guī)，反對把LD₅₀視為藥物的生物學(xué)常數(shù)。1995年在東京召開的國際GLP協(xié)調(diào)會議就提出不測LD₅₀也可以，主張以盡可能少的動物獲得盡可能多的急性毒性信息。理由如下：

（1）消耗大量的動物：

測定一個(gè)藥物一種給藥途徑，一次實(shí)驗(yàn)需消耗100只左右（含預(yù)試）。Rowan 1983年報(bào)告，英國在1977年中，僅測定LD₅₀所用的動物數(shù)為23萬只，占毒性試驗(yàn)動物總消耗量的23%，占全部實(shí)驗(yàn)動物總消耗量的4.26%。他估計(jì)全世界每年單用于測定LD₅₀的動物達(dá)500萬～1 000萬只。我國若按100個(gè)研究單位計(jì)算，每年將消耗40萬～50萬只小鼠。

（2）僅能獲得有限信息：

由于經(jīng)典LD₅₀測定耗用動物多，無法對每只動物做詳細(xì)觀察。實(shí)際上藥物單次劑量急性中毒，動物多死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)功能障礙，并不能很好地顯示出各自的毒性作用特征。再者，急速死亡，各種器質(zhì)性變化尚未來得及發(fā)展，不能顯示出靶器官的病變。如鹵代甲烷對小鼠的急性毒性試驗(yàn)，碘代甲烷（CH₃I）對肝臟毒性很大，比CCl₄和CBr₄均大，但動物死于麻醉和急性循環(huán)衰竭，而肝損害卻表現(xiàn)不出來。相反，毒性較小，致死較慢的CCl₄和CBr₄對肝臟毒性表現(xiàn)明顯。

（3）測得的LD₅₀并不精確：

由于許多因素影響測定LD₅₀，所以實(shí)際上LD₅₀并不很精確，甚至有的藥物因不同國家、不同實(shí)驗(yàn)室測定的結(jié)果波動很大，后雖經(jīng)統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)條件，波動有所縮小，但仍有較大差別?？梢?，用經(jīng)典法測LD₅₀不夠精確，僅供參考。中藥的LD₅₀測定問題也不少，如制劑本身及種類對測定LD₅₀影響很大，由于很多中藥或方劑中含有大量的蒽醌類等物質(zhì)，對腸胃道刺激性很大，動物往往因給藥量大死于腸脹氣，而其他毒性靶器官損傷很難觀察到。