第三節 側向層流免疫檢測系統：從當前的技術發展水平到下一代高靈敏、定量快速檢測的演變

在診斷技術中，存在著一個傳統的從檢測手段和應用場景上連續演變的特點，即從高度準確的需要基礎設備和集中式的方法，跨越到不那么精確的但可以用于分散的或用于床旁（pointof-care，POC）的幾乎不需要或者很少需要基礎設備的檢測方法。一般認為側向層流免疫檢測（lateral flow immunoassays，LFIAs）在這個連續演變的過程中具有相當重要的地位。換言之，側向層流技術過去被認為是一種解決簡單問題的廉價方法，但目前事實已不再如此。

技術的進步允許LFIA的性能擴展到需要更高準確度和靈敏度的應用中，同時從基礎設備需求和用戶友好性的角度仍保持了該技術的優勢（幾乎不需要或很少需要基礎設備）。這使得該技術在分散的測試環境、醫療和其他方面的應用得到了改善。此外，發達國家把該技術進步應用于臨床檢測，使LFIA模式功能更強大，甚至可以執行復雜實驗室系統的功能。這種LFIA模式利用側向層流試紙條作為高度特異性平臺的一個組成部分，同時利用讀取器、專門設計的樣本處理設備，以及具有機載功能的盒式解決方案等先進的實用性技術——從本質上創建了以側向層流模式為核心的實驗室分析儀。該項技術的其他應用處于這兩端之間，需要高性能和易用性，加上用于高端現場應用的可移動的、實用性的技術。簡言之，LFIA作為一項曾經與基于實驗室條件的測試沒什么關系的技術，現在越來越被視為是一種真正通用的技術，能夠在整體應用場景的所有端都具有足夠的性能。

為了適應這種發展方向，LFIA技術在物料、試劑、開發方法、制造設備、制造工藝技術和引進新一代的實用性技術方面都進行了不斷地改進。本節主要概述側向層流技術的基本原理，并討論設計、開發、制造和支持技術中的關鍵要素，這些要素使這種檢測技術能用于當今高要求的應用中。

一、側向層流概述——當前的市場機會和標準技術

（一）側向層流市場

全球側向層流檢測的市場規模預計在2022年將達到82.40億美元，復合年增長率（CAGR）為8%（表2-3-1）。

依據應用場景分類，側向層流市場可以分為臨床醫學/床旁檢測、獸醫學、食品安全和環境檢測（包括食物、水和環境）、藥物研發和質量控制測試等類型。

在2017年，臨床醫學/床旁檢測部分占據了最大的市場份額。人口的增加、慢性病的流行、醫療保健成本的削減壓力和以患者為中心照料需求的增加驅動了臨床醫學/床旁檢測份額的增長。

世界范圍內傳染性疾病的高度流行、人口的快速老齡化、對床旁測試需求的增加和基于家庭的側向層流設備應用的增加促進了臨床醫學市場的增長。

食品安全部分的檢測包括：食物來源的致病菌、毒物和污染物。

環境測試可以分為：空氣、土壤、水、重金屬、有機物和微生物。

全球化食物供應的增加需要能夠幫助安全分配和保質期的快速解決方案。調節標準需要經濟高效的過程和步驟，這對于食物來源的病原菌的檢測尤其關鍵。

環境和食品安全檢測受到高度的管控，且管控定期進行。因此，生產廠商同樣需要對產品進行更加規律和有效的測試。

從地域上分析，全球側向層流市場分為北美、歐洲、亞太、拉丁美洲和中東、非洲幾大區域。2017年，北美占據了最大的市場份額，其主要原因為人口的快速老齡化和慢性疾病的增加。

這些數據不包括非傳統或者涉及機遇市場增量如消費者健康、生物學、化學或者放射防御等應用，這些領域在某個時間點有非常顯著的增量潛能。

（二）標準側向層流檢測的結構

LFIA的典型配置如圖2-3-1所示。傳統設計的檢測法由多種材料組成，每種材料都有一個或多個用途，它們相互重疊，用壓敏黏合劑嵌在背板卡上。

LFIA檢測由幾個區域組成，通常由用不同材料組成的獨立部分構成，這里將對每個區域進行簡要解釋。當進行一個檢測時，將樣本添加到試紙條近端和點樣板（sample application pad）中。在這里，樣本會被進行處理，使其與測試的其他部分兼容。處理后的樣本通過這個區域移動到偶聯物板（conjugate pad）。

在偶聯物板中被固定的顆粒偶聯物，通常為膠體金或者有色的、熒光的或順磁性的單分散膠乳顆粒。該顆粒已經偶聯到待檢測的特定生物成分之一上。顆粒偶聯物是抗原還是抗體，取決于檢測的模式。樣本使干燥的偶聯物重新活化，當兩者都移動到試紙條的下一部分，即反應基質中，樣本中的分析物與偶聯物相互作用。

該反應基質是一種多孔膜，在其上固定了該檢測的其他特定生物成分。這些生物成分通常是蛋白質，可能是抗原或者抗體，它們被放置在膜特定區域的條帶當中，在那里它們用來捕獲移動到捕獲條帶的分析物和偶聯物。

多余的試劑通過捕獲條帶，并滯留在芯狀結構（wick）或吸收板中。反應基質上的結果可以解讀為捕獲的偶聯物條帶存在或者不存在，可以通過肉眼或者讀取器進行讀取。

免疫檢測的模式可以是非競爭性的（也稱為夾心法或直接免疫檢測法）或者是競爭性的（或競爭性抑制法），檢測模式可以適用于定性的、半定量的，或在某些情況下完全定量的檢測。直接檢測法通常用于檢測具有多個抗原位點的較大的分析物，如hCG、登革抗體或抗原、HIV。在這種情況下，檢測條帶的存在表明測試結果為陽性。需要適當少于過量的樣本分析物，這樣一些偶聯的顆粒就不會在捕獲條帶被捕獲，它們將繼續流向第二條固定抗體的條帶，即質控條帶。這條質控條帶通常包括一種特異性抗免疫球蛋白抗體，該抗體對偶聯物上的偶聯抗體具有特異性。競爭性模式通常用于檢測具有單一抗原決定簇的小分子，這種小分子不能同時與兩種抗體結合。在這種模式中，反應基質上沒有檢測條帶表明陽性檢測結果。不管檢測條帶的結果如何，質控條帶仍然會形成。

（三）制造工藝和方法

圖2-3-2概述了傳統的側向層流測試試紙條的通用制造工藝。通常用于制造這些系統的材料和工藝以及材料的使用方式，幾乎沒有發生過大的變化。

1.工藝和設備

傳統的和改進的制造技術、設備及供應商將在下面進行討論。

快速檢測法的性能要求在不同的細分市場之間存在相當大的差異。然而，一般來說，LFIA的性能一直在兩個主要方面受到挑戰：重現性和靈敏度。缺乏試紙條與試紙條間的重現性一直困擾著LFIA檢測模式的名聲，且限制了這些檢測在許多定量模式中的采用和應用。這種重現性缺乏的主要原因來自檢測試劑中使用的材料。然而，所使用的制造工具和工藝的差異也是這種批內變異的相當大的部分。另一個因市場需求而提升到更高水平的性能是靈敏度。這是診斷市場中所有檢測技術的一個普遍趨勢，在考慮制造工藝和工具的情況下，必須記住的是，提高靈敏度的要求是對制造工藝提出的新要求，而不是對制造工藝功能的單純要求。非典型的工藝，如將偶聯物凍干成珠子，以及使用非標準的、非顆粒的報告分子，反過來要求新的和可控的制造技術，這類非典型的工藝正越來越多地應用于克服側向層流模式的變異性，提高速度和靈敏度。

（1）傳統的生產過程技術：批間和卷到卷

LFIA的制造所需的主要工藝如下：

1）分配。將含有包括蛋白質、表面活性劑和聚合物在內的多種復合物的液體，以一種可控的、可重現的方式添加到LFIA的組分中，是這些檢測產品生產中最具有技術挑戰性的工藝之一。這里主要使用了兩種將試劑應用于材料當中的方法。

對于大體積液體的添加，如膜封閉試劑、樣本板和偶聯物板處理劑，材料的浸注是通過浸漬（dipping）到容器中，然后進行印跡（blotting）和干燥（drying）來完成的。

對于以可控的方式添加定量體積的液體，如檢測條帶和質控條帶分配以及偶聯物沉積，需要更可控的、高度準確的和可復現的工藝。膜測試條帶和質控條帶的沉積已經可以使用多種分配方法來實現，這些方法在實際的生產基礎上具有量值可變性和同樣可變的適用性以及可擴展性。當今在工業上廣泛應用的技術基本上有3種將定量體積的試劑分配到表面的方法。

接觸頭分配器（contact tip dispensers）：BioDot公司的FrontLine滑動頭分配器是接觸頭分配器的一個示例。這種分配方法的其他生產商包括Kinematic Automation和Imagene Technology。該分配器由一個注射器或其他帶有一個可在膜表面拖動的柔性尖端的變容真空泵組成，通過接觸頭系統的液體量是可定量的，這由所使用的泵的精度決定。然而，單位長度材料吸收的液體量卻不一定是可定量的或可量化的。這是因為通常使用的硝化纖維素材料的吸收率取決于材料相關的問題。這些包括：

● 膜的水合作用；

● 膜的孔徑；

● 膜表面特性（光滑度、灰塵）；

● 液體因素，包括黏度和蛋白質濃度；

● 環境因素，如試紙條加工區域的環境相對濕度。

這些因素引入到沉積工藝中的變異性會導致單位長度沉積體積的變化，并可能導致生產出的條帶寬度的變化。這會進而將潛在的關鍵的變異水平引入到定量檢測系統中。此外，由于接觸頭在材料表面的拖拽，可能會對材料，尤其是薄膜造成損傷。然而，這些分配器往往是非常可靠的，除了仔細地清洗之外，幾乎不需要維護，所以從制造的角度來看，它們可以為測試條帶和質控條帶試劑的相對準確的分配要求提供一個很好的解決方案。

非接觸式泵驅動電磁分配器（noncontact，pump-driven solenoid dispensers）：包括BioDot公司的 BioJet Quanti，它使用一個滴液式驅動器，就像一個電磁閥通過液壓泵與一個變容真空系統，如注射泵。該方法的優點是材料與分配器頭之間不接觸，提高了分配時的一致性，同時最大限度地減少了分配器尖端在材料表面拖拽造成材料表面損傷的可能性。這些分配器的優點與對分配器尖端的仔細維護、防止堵塞、流體脫氣以獲得非常準確的分配的要求相抵消，這對制造工藝來說意味著更大的維護負擔。必須充分評估和權衡分配器更準確的性能帶來的好處和在可規模制造性上應用所需的成本。

定量噴槍式分配器（quantitative airbrushtype dispensers）： 顆粒偶聯物在具有可變表面特征的平板上的沉積，如玻璃纖維和聚酯，通常是通過浸漬或噴涂工藝來實現的。大多數顆粒偶聯物，如40nm的膠體金或100～200nm的乳膠顆粒，因為會堵塞或損壞分配器頭，所以不能使用電磁閥或接觸頭分配器進行分配。因此，AirJettype分配器被廣泛地使用。BioDot公司生產的AirJet Quanti是一種用于液體或顆粒定量沉積的獨特技術，它既可以用于浸漬，也可以用于基底層上細線條或斑點的生成。這種技術的另一種產品是由Kinematic Automation公司生產的。這種分配器由一個氣動噴霧發生器和變容真空系統如注射泵組成。典型的發生器是一個氣動驅動的氣溶膠，類似藝術家的噴槍。在這種情況下，分配器/發生器以μL/s為單位提供噴霧定量輸送，當它與移動同步時，可以同時產生單獨的圓點和線條。

2）浸注。浸注是材料與試劑的飽和。這道工藝之后，通常是被嚴格控制的干燥工藝。這可以通過在試劑中浸泡材料的薄板或網狀物或者使用分配器使材料飽和來實現。其中任一過程都可以使用各種樣式的薄板或網狀物來完成。該方法的典型應用方式是用聚合物、表面活性劑和蛋白質的溶液對偶聯物或樣本板進行預處理，以使其更親水、控制流速，或使用樣本處理緩沖液使其飽和。阻斷試劑通常也使用浸注法固化在膜上。

基本工藝包括將材料以平板或成卷的形式浸泡在液體容器中。許多在檢測中使用的材料，由于其極端疏水性（如玻璃纖維或聚酯平板），需要較長的浸潤時間來確保材料與液體完全浸注。這些工藝本質上可以分批，也可以是連續進行。如果分批，將平板或薄片浸入到相關溶液中，用手或通過其他方法如超聲波振動攪拌，以確保液體被均勻吸收。然后將其去除，以印跡或擠壓的方式去除表面水分，并使用凍干或高溫強風進行干燥。

在一個連續的工藝流程中，仍然是成卷形式的材料，以小心控制的速度和接觸角通過水浴槽，然后通常是在干燥道或干燥塔中進行擠壓和干燥。由于多種原因，該浸泡和干燥的工藝，尤其是在分批的模式，是導致變異性的一個主要來源。這些原因包括不均勻的液體吸收和材料在烘箱中批量性的不一致的干燥程度。

3）干燥。干燥是實現LFIA一致性、穩定性和靈敏度的關鍵工藝之一。在一個試紙條的生產過程中，通常需要進行多次干燥過程，每種干燥的目的各不相同。例如，當測試條帶和質控條帶在分配后干燥到膜上時，其目的是獲得穩定的免疫反應蛋白涂層。因此，干燥過程對檢測的最終性能至關重要，必須非常小心地加以控制。干燥的程度、干燥的方法和時間，對于在表面上獲得有活性的、穩定的蛋白質非常關鍵。干燥的控制和一致性是其中的關鍵，因為蛋白質干燥的時間、方法和程度對于干燥后蛋白質重新折疊成有活性的構象至關重要。

一般來說，當蛋白質溶液干燥到膜表面時，由于水分從系統中揮發，蛋白質與膜表面分離。最初的電荷吸引將蛋白質帶到表面，在那里發生疏水結合過程。在此疏水結合過程中，蛋白質將其疏水區域暴露于膜表面。隨著時間的推移，蛋白質會發生一些重新折疊，理想的結果是形成一個有活性的構象。所有這些都是在膜潤濕試劑（即表面活性劑）存在的情況下完成的，這些潤濕試劑可以對過程和蛋白質的最終活性產生影響。為了在干燥過程后產生最佳的活性，干燥的程度、干燥的速度和干燥的方法都可以針對單個蛋白質進行優化。因此，控制溫度、時間和濕度成為影響干燥效果和重現性的關鍵因素。在干燥顆粒偶聯物，如膠體金或偶聯蛋白質的單分散膠乳時，同樣的控制程度是也很關鍵的。合理的水分去除程度獲得均勻的干燥，對于實現干燥后偶聯物的穩定性、促進偶聯物平板的均勻再潤濕和偶聯物顆粒的有效再懸浮至關重要。

兩種基本的干燥工藝已經用于側向層流工業界：高溫強風干燥和凍干。凍干本質上是一種分批的工藝，具有較低的生產能力，因此盡管其具有良好的干燥特性，但并不常用于平板。強風干燥的常用方法是批量烘箱或網格式嵌入烘箱。盡管如此，凍干在其他偶聯物模式的生產中變得越來越普遍，如儲存在樣本采集裝置中或裝載盒中的顆粒化偶聯物。如果設計得當，即使儲存在相對濕度為20%的情況下，偶聯物顆粒也可以非常穩定，并且能非常一致和有效地將偶聯物釋放到檢測系統中。這將在本節的后面進一步討論。

4）縱切。結合本文的使用背景，縱切是一種沿著層壓板網格軸線對材料進行切割的工藝，而切割是指垂直于網格軸線進行切割，以形成單個檢測試紙條或材料卡片長度?？v切主要是用于將樣本的寬幅薄板或網格儲料和偶聯物平板材料切割成更薄的網格來進行層壓。材料可以在處理前和處理后進行預縱切，這取決于整個生產工藝和材料的特性，如拉伸強度和脆性。

5）層壓。層壓工藝是基于使用不同材料的試紙條或網格，將其黏合到塑料背板表面的壓敏黏合劑上。塑料背板帶有一個保護性的釋放襯里，在層壓之前將其移除。通常來說，層壓是使用制造商如BioDot和Kinematic Automation生產的半自動層壓機來進行的，或者使用將處理過的材料卷層壓成背板材料卷的聯機設備來進行，這通常會形成一個符合卡片長度的材料切割過程。這些材料在后續的步驟中會進一步加工成單個的試紙條。

6）切割。切割過程用于從層壓板上切割最終的檢測試紙條，將其裝瓶或組裝到塑料盒中。基本上有三種類型的刀具：鍘刀、單旋轉葉片、旋轉式卡片切割機。

鍘刀式切割機每個切割周期切割一部分，可以用于層壓板的高速切割，也可以用于單個測試試紙條的切割，以進行揀選和放置組件操作。旋轉卡片切割機使用一系列旋轉刀片將層壓板高速地切割成測試試紙條，同時將整個層壓板切割成單個的試紙條。

7）檢測盒組裝。典型的檢測盒的形式是一個帶有塑料包裝的檢測試紙條，也可以包括干燥劑。在這種情況下，檢測試紙條要么手動放置，要么自動放置在組件的底部，頂部通過焊接或者咬合與底部固定在一起。此外，在組件中包含射頻識別（RFID）標簽是當前一個逐漸明顯的趨勢，這對基于讀取器應用的功能來說不可或缺。這些標簽通常是在整體組盒組裝時進行編程并被插入到檢測盒中。檢測盒組裝通常是一個工藝瓶頸，如果該工藝是手動完成的，則需要高勞動力的投入；如果該工藝是機械完成的，則需要使用復雜的、定制的機械以相當高的每分鐘零件組裝率來完成組裝過程。

8）包裝。此操作包括將檢測盒包裝到含有干燥劑的錫箔袋中，并且在某些情況下，還包括與檢測相關的其他材料的包裝。包裝可以手工來完成，操作者將檢測盒和其他部件放置在預先成型的袋子中，然后用旋轉封口機將袋口密封。包裝也可以通過機器自動完成，此時袋子的成型是與其他操作一起完成的。

（2）加工選項

對于上述工藝，兩種基本的方法是可行的且是常用的，即需要大量的手工勞動投入的分批工藝，以及連續（或卷到卷reel-to-reel）方法，它可以減少工藝中的手工勞動部分。

1）分批制造。分批制造技術的基本前提是，長度在150～300mm（通常情況下）的單張卡片是單獨加工的。這種制造工藝允許使用成本較低的設備，但缺點是手工勞動投入高、工藝可重復性差、通常情況下產品變異性高。這種加工方法通常用于產量相對較低的情況。

分批加工通常由多臺式儀器來執行，包括：

● 帶有分配器的XY運動系統；

● 浸漬罐；

● 烘箱；

● 手動或半自動層壓機；

● 切割機。

XY運動系統通常配備至少兩個線式分配器用于測試條帶和質控條帶，以及一個偶聯物分配器。

分批加工方法對于研發和制造基本上是一樣的，且可以通過使用復制的系統來擴大生產規模，實現更高產量的生產。分批加工方法有兩個主要的問題：第一個是質量易受手工操作的影響；第二個是分批工藝不能直接擴展到連續工藝。其主要優點是投資成本較低和使用方便（圖2-3-3）。

2）連續制造。分批加工的替代方法是卷到卷或連續加工。在該方法中，材料被加工成50～100m長的連續卷，直到層壓過程結束。這將產生更好的工藝控制、更高的產量、更低的手工投入和產品變異性。

連續設備通常由試劑加工和干燥模塊、加工網格縱切模塊和將材料層壓到背板卡片上的模塊組成。連續試劑處理單元執行分配和浸漬功能，并具有連續干燥和自動QC的能力。該系統可以安裝不同類型的分配器，這些分配器與分批加工使用的分配器相同，包括接觸式、非接觸式和噴霧式分配器。

該單元還可以容納浸漬罐模塊，該模塊由帶有輥壓機系統的試劑儲存器組成，用于使移動的網格飽和。飽和的或分配的材料網格使用集成的干燥道或干燥塔進行干燥。

連續層壓系統的功能是將所有經過預處理及橫切至適當寬度的材料層壓至帶有預縱切的釋放襯里的塑料背板上（圖2-3-4）。

（3）最終設備組裝。

在LFIA的生產中，最終組裝通常是操作最密集的工藝。這一工藝的自動化的設計和實現被一個現實情況所困擾，即塑料包裝的設計通常是為個別生產商或生產線定制的。這導致需要為每個包裝設計定制工具。不過最近在組裝方法上的創新具有將這種定制需求的影響降到最低的潛力。組裝工藝可以被視為分批的（手工的）或連續的（自動化的）。

分批組裝模式基本上是手動的，需要使用用于切割、組裝和包裝的相關設備。所需要的設備包括切割機、塑料包裝的封口工具和帶有預成型錫箔袋的密封機。使用高速鍘刀或旋轉式卡片切割機切割大批的試紙條。然后操作人員分別將切割后的試紙條放入底部塑料包裝中，放置頂部部件，并使用壓力工具將這兩部分卡在一起。在使用手動密封機進行密封之前，操作者將零件放入帶有干燥劑和其他任何輔助成分的錫箔袋中。這種方法是成本最少和勞動投入最密集的。從質量的角度來看，這也是最糟糕的情況，隨著產量和操作者數量的增加，質量可能會下降。除了最容易受到操作者錯誤的影響之外，工藝中的這一步驟還涉及最大數量的零部件處理操作，這些操作既可能損壞部件，又會由于與操作者相關的錯誤而帶來一定程度的變異性。

對于高質量和/或定量檢測模式的產品來說，在產品組裝和包裝中盡可能多地實現自動化的同時兼顧實用性和成本效益一樣都很重要。環境控制的實施也是很關鍵的，如在20～25℃的舒適的室溫下，將相對濕度控制在20%以下。實現最低資金密集度的自動化方法是使用工作站，將層壓卡片和軋輥料送入切割機，切割機將切好的試紙條放置到塑料零件中。切割系統應該配備瑕疵標記傳感器，用于識別在上游已經被標記瑕疵的層壓板上的零件。此零部件在切割操作中被切割和拒絕。然后，塑料盒零件手工放置并從工作站取出。一旦檢測試紙條受到塑料包裝的保護，該設備更易于手工處理。

下一個自動化級別是實現完全連續或自動化加工。在該方法中，使用的機器集成了所有的裝配操作，從切割到試紙條放置、試紙條的QC、干燥劑的放置、蓋子的放置和關閉、插入到袋子中以及袋子的關閉。打印、標簽以及RFID插入也包括在流水線當中。這可以以很高的速率完成并產生非常高的產能。然而，這些機器往往是高度定制的和高度資本密集型的。

在發達國家，該類試紙條加工步驟的主要供應商是Kinematic Automation和BioDot Inc。最近，已經有一些新進入到裝配市場的公司，如JOT Automation（芬蘭），正采用模塊化的、基于機器人的方法來完成此類裝配工作。這種方法具有減少定制需求數量的潛力，并可能減少資產設備成本，尤其是在組裝多個生產線的時候。

（4）其他工藝

其他關鍵的制造過程包括盒子的成型、盒子的組裝、盒子和緩沖液的包裝以及其他可選的工藝，如凍干，所有這些都是根據檢測設計定制的過程。還必須執行的輔助過程，包括標簽和條碼的打印、RFID標簽的插入、帶有標識、條碼和用于患者識別信息的盒子的標記，或打印、袋子的密封、盒子的組裝及包裝。

2.總結

我們應該從一個基本前提開始，即在LFIA的制造中，要處理的是一個與生俱來的復雜系統，該系統具有大量的可以帶入到產品中的變異源。許多制造步驟設計和控制的目的是盡量減少材料和試劑的變異對整個產品變異性的貢獻。在設計和開發過程中必須非常小心，以確保開發的過程可以適當地擴展和控制，從而使引入到產品性能中的不必要的變異源最小化。

二、未來POC診斷性能的發展

本節介紹影響POC檢測和快速診斷未來的一些更相關的技術問題。其目的是討論改進在現場和實驗室環境中使用的POC快速測試的性能，正在采用的某些開發方法的現狀和關鍵因素，并關注在快速醫學診斷方面尚未滿足的需求。

POC應用的技術設計的一個主要目的是將更準確的技術擴展到分散的檢測場景，在這些場景中，它們通常是最常用到的。這方面的發展正沿著多條路徑進行，但可以大體上分為兩個領域：努力改進現有技術的性能以及以芯片上實驗室的形式開發新技術的更徹底的方法和為了應對POC環境中分子診斷系統應用的挑戰而專門設計的方法。本節的重點是側向層流，因此本次討論的主要內容將放在改進側向層流系統的方法上。本節后面部分也將會提到使用側向層流技術作為分子診斷的檢測組件的內容。

現有技術的改進

為了提高系統的性能，使其既可以有效地應用在應用范圍的低資源端，又可以應用在發達國家環境中的高端應用端，創新是側向層流系統的每一個關鍵組件的需要。在任何應用的POC診斷設備的合理開發中必須解決的關鍵組件技術是：

● 樣本采集和處理（如濃縮和準備）；

● 識別和信號生成技術；

● 讀出和信號轉導技術；

● 設備（盒子）設計。

除了這些系統的設計外，精心控制的制造工藝的設計和實現對于生產具有高度重現性的、定量的或多重系統的能力是很關鍵的。這些系統元素中的每一個都將通過舉例進行討論。

1.樣本采集和處理

對于許多應用來說，傳統的側向層流模式能夠提供足夠的靈敏度。然而，在許多感染性疾病的應用和檢測方法中，對于靈敏度的需求日益增長，如接近核酸擴增的靈敏度（LaBarre，2011）。在側向層流中標記和檢測的標準方法不太可能達到這些應用所需的靈敏度。因此，在許多情況下，樣本準備是提高靈敏度和整體性能的關鍵。應當記住的是，LFIA和其他需要現場檢測系統的一個重要吸引力在于：它們應該在可能的情況下，在單一步驟中提供完整的“從樣本到答案”的解決方案。因此，將整個系統作為一個整體來考慮是至關重要的，包括樣本、采樣方法、樣本預處理方法以及系統中分析物的濃度。當分析物濃度對于檢測過高或過低時，它都可以是一個混淆因素，樣本處理可以而且必須用來克服這些相關的問題。

取樣是指生成非均勻對象的代表性樣本。這種不均勻性對分析方法的成功提出了挑戰。作為應用于高靈敏度快速的診斷，最關鍵的因素不是系統的絕對靈敏度，而是盡可能獲得具有代表性的樣本的能力，并最終在初始樣本中檢測出的分析物濃度才是至關重要的。取樣和預處理的方法，主要是濃縮和去除潛在交叉反應劑和減少本底噪聲，是確定一個檢測法是否可以檢測許多分析物的關鍵。此外，在某些情況下，高濃度分析物可能是免疫檢測法的干擾因素。

樣本操作和/或處理根據樣本類型可以包括多種變異來源，如包括從手指針刺或靜脈全血分離血漿、過濾，以及在唾液或呼吸樣本中分解黏蛋白或改變尿液的pH。

在任何要運用到分散的檢測環境的檢測系統中，樣本收集、處理和運送的方法必須簡單、穩定和可靠，并且最好是檢測設備的集成組件，應該是只需要最少的依賴于用戶的步驟。

側向層流全血處理策略的具體例子將在本節的其余部分進行討論。

（1）手指針刺全血的采集選擇和側向層流應用中用于檢測的血漿分離

為全血檢測設計的集成檢測解決方案的設計需考慮的關鍵因素是從血液樣本是否來自于試管開始的。若是，則需要考慮是哪些抗凝劑，或者樣本是否來自手指針刺。血液樣本的主要處理步驟是：

● 從管子或手指針刺采集來的定量或半定量血液樣本的計量；

● 從無明顯溶血的樣本中分離血漿；

● 樣本傳送到設備，純樣本、帶有追蹤緩沖液的純樣本或者預稀釋的樣本。

創建以一種直觀的、用戶友好的方式實現幾個或者所有這些步驟的解決方案是一個持續的挑戰，況且每個檢測系統的要求都是不同的。

1）樣本采集和轉移。如果樣本要從試管中抽取，那么通過提供用于現場環境的低成本的移液器/滴管，可以相對簡單地將樣本定量轉移到設備，或者如果在實驗室條件下，也可使用定量移液器。然而，即使在這一領域也有可能進行一些創新，使用低成本、不鋒利的定制設備從采血管中采集和傳送固定體積的血液。這樣的裝置已經被設計出來了。

根據用于血漿分離和傳送到設備的策略，手指針刺的應用也需要創新。手指針刺樣本的采集可以使用多種方式。現成的毛細管和低成本的一次性半定量移液器一樣都是常見的。然而，還可以采用一些更新穎的方法，包括使用帶有集成分配移液器的毛細管，該毛細管可以方便地根據體積和重現性進行定制（圖2-3-5）。使用海綿收集也是可能的，這是一種與垂直過濾選項的使用相集成的方法。

2）血漿分離和傳送到檢測。在快速檢測法中，可以通過多種方法實現分離。

① 過濾膜（filtration membranes）：許多側向層流類型的系統利用一個連續的血液分離膜，如Pall Vivid?或Cytosep?膜。這些系統是相對有效的，盡管它們在可處理的樣本體積上受到限制。如果它們負載過重，紅細胞會釋放到檢測中，導致本底噪聲問題。通常，為了將血漿從膜上清洗干凈且提供足夠的體積來使系統完全濕潤，該系統需要對樣本進行預稀釋，或需要使用追蹤/清洗緩沖液（圖2-3-6）。

② 其他方法（other methods）：另外一種方法是使用主動垂直分離，這是一種已經被用在其他應用領域的血漿分離設備的方法，如FABPulous心血管 FABP方法（FABPulous BV荷蘭），如圖2-3-7所示。

2.識別

識別和信號生成元件是構成滿足高性能要求的分析設備的必要組成部分，它可以產生在某種程度上與待檢測分析物的存在和/或濃度有關的信號。

識別元件是檢測的生物識別系統，在免疫檢測中，它們通常是基于抗體-抗原的，盡管一些應用需要其他方法，如親合素-生物素或核酸雜交。仔細篩選和選擇試劑對這些應用的性能至關重要。檢測性能將受變量（如抗體質，包括特異性和親和力）及一些參數（如結合速率常數和抗體類別）的影響。為了追求更高的性能，LFIA系統與ELISA系統有著不同的系統特性要求，如不同的系統結構要求。

（1）側向層流檢測抗體選擇

快速檢測的整體性能受包括抗體質量在內的許多變量的影響。這包括抗原特異性和親和力（由解離常數定義）等顯而易見的參數。然而，更重要的可能是結合速率常數，該常數通常不在抗體篩選和選擇以及抗體分類期間進行測量。有些亞型更容易偶聯或片段化，并且可能導致與純化、溶解性和長期儲存相關的特殊挑戰。例如，IgG3不能與蛋白A很好地結合，并在冷凍過程中容易沉淀。

側向層流系統中涉及的抗體主要考慮因素包括：

● 是否使用單克隆或多克隆抗體；

● 如何選擇和篩選抗體；

● 如何最優化偶聯；

● 如何將抗體固定在膜上；

● 如何優化抗體的特性。

1）單克隆vs多克隆抗體。對于大多數系統來說，單克隆抗體比多克隆抗體更受青睞。然而，在許多情況下，多克隆抗體也可以提供充分的結果。商業問題和抗原相關的問題也在選擇中起作用。多克隆抗體的供應受各種不確定因素的影響，除非能夠在單個抗體庫中獲得足夠的產品更新換代周期所需的抗體。在一段時間內，來自單個動物的重復供血將受到顯著的變異影響，并且如果該動物死亡，來自另外一個動物的抗體特征將會有顯著差異。商業上的問題是，產品更新換代周期總量的需求不能提前預測，并且用另一個多克隆抗體庫來替代的驗證成本很高，還可能需要重新優化LFIA的其他元素來匹配新的抗體庫。多個抗體庫可能需要被評估才能找出最接近的匹配的抗體庫（表2-3-2）。

選擇用于選擇和篩選抗體的方法很重要，這將在下面進行討論。

抗體的特異性本質將在偶聯物制備和膜上的固定化方面具有重要地位。

除非正在開發的檢測是針對濃度高于納摩爾的物質，否則需要具有高親和力的抗體。然而，高“親和力”可能還不夠充分。在側向層流模式中，這種親和力主要由快速的正速率（k_on）來推動。（注意這個常數也被稱為結合速率常數（k_a），但是k_on通常被用來避免混淆k_a和K_a，結合常數也被稱為K_eq、平衡常數。）

如果考慮LFIA的動力學，那么通常會有一個0.5～1.0mm寬、流速約為0.1～0.7mm/s的檢測條帶區域。在大多數系統中，這會為結合到檢測條帶上產生1～6s的潛在時間（Brown，2009）。因此，需要高正速率的抗體。

這種情況對于偶聯物更有利，因為它與分析物接觸的時間更長?！坝行У摹苯Y合始于偶聯物的再溶解，并在偶聯物通過檢測條帶后結束。這一時間通常為10～20s，但是對于從偶聯物平板中釋放出來的最后的顆粒，這個時間可能長達數分鐘。需要注意的是，對于正速率非常低的抗體來說，最先釋放的顆粒（通常代表大多數顆粒）將會與只有少量抗原結合的捕獲條帶親密接觸，導致靈敏度低于偶聯物顆粒被分析物飽和情況。這就是為什么樣本和偶聯物預先混合會有利的一個原因（稍后更詳細討論）。

2）偶聯物上的抗體。膠體金的濃度通常用520nm處的光密度或吸光度來表示。40nm金的“1OD”溶液含有9 900億個顆粒/毫升。能結合到一個金顆粒的最大抗體量取決于金顆粒的表面積。對于膠體金來說，如果使用40nm的金，那么每個顆粒大約有150個IgG分子（表2-3-3）。

使用金顆粒時，通常并不能定位抗體的結合或用共價鍵將兩者結合。這是為什么膠體顆粒可以優于金顆粒的一個原因。這點將在之后的“試劑信號”相關內容中做進一步的討論。

（2）側向層流的抗體篩選方法

采用ELISA進行抗體篩選和選擇是一種常見的方法，通常涉及用感興趣的分子包被平板。

雖然這種方法對于尋找潛在的抗體對和親和力的相對排序很有用，但是它通常不能預測LIFA的性能。檢測條件是非常不同的。通常這些篩選檢測需要較長的孵育時間。因此，反應通常處于平衡狀態，并且ELISA中抗體表面濃度遠低于LFIA。

雖然最初的抗體篩選可以采用ELISA或類似的方法來進行，但是應盡可能早地以能夠預測LIFA檢測性能的模式對抗體進行測試。

這可以很方便地使用點樣法來完成，該方法以實際需要執行的檢測模式來測試抗體和試劑。這是一種非常簡單的方法，適用于篩選大量的抗體和檢測條件。它使用“1/2油標尺”，這是一個沒有樣本和偶聯物平板的側向層流試紙條。捕獲抗體在各種條件下進行點樣，以探索固定條件。抗原在小試管或者微量滴定板中與偶聯物預混合，然后將試紙條浸入到該溶液中。當然，這是一種混合和運行類型，但可以預測帶有干燥偶聯物的標準LFIA的性能。然而，重要的是使用既作為偶聯抗體又作為捕獲抗體的抗體來執行此測試，因為將偶聯物與樣本進行預混合比使用干燥偶聯物提供更長的偶聯物/分析物反應時間，因此在實際系統中成對定位的性能可能會有所不同（圖2-3-8）。

（3）側向層流應用的替代捕獲試劑——適配體技術

在POC快速檢測法的設計和開發中，需要解決的關鍵元素之一就是熱穩定性問題。大多數LFIA要求可控的儲存條件以獲得最佳穩定性。某些檢測法完全不能容忍較高的溫度。這在很大程度上是系統所使用的結合試劑穩定性的一個函數。這種對溫度控制的要求，即使檢測法不一定要保存在低溫條件下，也會增加供應鏈的成本，并且可能妨礙其在高溫現場環境中檢測的使用。這對于發展中國家的診斷應用，或在發達國家中生物戰、農業或獸醫檢測應用來說都是一個主要問題。

適配體的使用可以替代需要高熱穩定性的檢測法的抗體。

適配體（aptamers）是可以結合到靶向分子的寡核苷酸或肽分子。適配體通常是從一個大的隨機序列池中選擇來創建的。更具體地說，適配體可以分為：

● DNA或RNA適配體。它們是由（通常是短的）寡核苷酸鏈組成的。

● 肽適配體。它們由短的可變的肽結構域組成，連接到蛋白質支架的兩端。

核酸適配體是通過體外重復輪次篩選而設計的核酸種類。適配體在生物技術和治療應用中非常有用，因為它們提供能與抗體相媲美的分子識別特性。除了辨別識別外，適配體比抗體更具有優勢，因為它們可以完全在測試試管中設計，很容易通過化學合成來生產，具有理想的儲存特性，以及在治療應用中很少或根本不會引起免疫原性。

1990年，兩個實驗室獨立地開發了選擇技術：Gold實驗室，通過指數富集（SELEX）利用配體的系統性進化這一術語來描述選擇針對T4DNA聚合酶配體的過程；Szostak實驗室，創造了體外選擇這一術語，選擇針對各種有機染料的RNA配體。Szostak實驗室還為這些以核酸為基礎的配體創造了“適配體”（來自拉丁語，aptus，意為“合適”）這一術語。兩年后，Szostak實驗室和Gilead Sciences兩個彼此獨立的機構，利用體外選擇方案分別開發出了針對有機染料和人類促凝劑（凝血酶）的單鏈DNA配體。RNA和DNA適配體之間似乎沒有任何系統性的差異，除了DNA內在的化學穩定性更強。

自從適配體發現以來，許多研究者已經利用適配體選擇作為應用和發現的手段。2001年，位于德克薩斯大學奧斯汀分校和SomaLogic，Inc.（Boulder，CO）的艾靈頓實驗室（Ellington lab）實現了體外適配體選擇過程的自動化，將選擇實驗的時間從6周縮短到了3天。

SELEX過程已經在商業應用中得到了最廣泛的應用。然而，提高了選擇效率的替代選擇方法也正在進入市場。諸如Base Pair Biotechnologies（Houston，TX，USA）和BioAptus（Belo Horizonte，Brazil）等公司已經開發出快速篩選適配體庫和在快速周轉時間內生產高純度、高親和力的適配體的方法，大大降低了試劑的成本。

快速診斷應用中使用適配體的主要優勢包括：

● 高熱穩定性；

● 定制的特異性和親和力；

● 產生針對幾乎任何表位的適配體，甚至非免疫原表位的能力；

● 生產的可擴展性——一旦選定，這些分子就會被簡單地排序和生產。

在撰寫本文的時候，適配體在側向層流技術中的應用正在研究中。雖然基于適配體的檢測方法的商業化到目前為止還很有限，然而基于上述優勢，該技術還是顯示出了如上所述的令人信服的前景。

3.信號生成

信號生成元件包括標記物和讀取器或所使用的結果解讀方法。對于POC免疫檢測來說，大多數檢測仍然是通過肉眼或使用光學讀取器進行的，然而熒光、化學發光和磁場測量系統的使用越來越多。各種信號傳感器也被應用在這里，包括熒光團、顆粒結合或直接標記、光學（膠體金或彩色膠乳顆粒）或順磁顆粒。在全行業中，已經發生的變化是將讀取器系統整合到POC免疫檢測系統中，其中很大一部分是基于熒光的使用來實現的，這主要是考慮靈敏度、可用性和成本的原因。在降低靈敏度方面，非光學標記物如熒光顆粒，可以預期產生比典型的膠體金或彩色光學標記物高1～2個log的靈敏度。

側向層流系統中最常用的顆粒檢測試劑是膠體金和單分散膠乳。其他的選擇如纖維素納米顆粒技術（NanoActTM來自日本的Asahi K asei Fibers公司）代表了一類可以提高靈敏度、重復性和可視化側向層流新技術。膠乳顆粒可以與各種檢測試劑偶聯，包括有色染料、熒光染料和磁性或順磁性組分。特定的側向層流系統中使用的顆粒標簽和檢測試劑的選擇由以下幾個因素決定。

● 共價偶聯的需要。通常是為了穩定性、靈敏度和變異性的控制。共價結合可以在所有這些領域產生益處?；罨z乳顆粒通常是這種偶聯的唯一選擇，因為蛋白質與膠體金的結合通常是通過被動吸收實現的。

● 量化的需求。以側向層流模式開發真正的定量檢測法需要在開發和選擇所使用的基本材料和技術方面做出大量的努力和關注。如果應用需要一種讀取器技術，那么標簽選擇的可用選項將擴展到包括膠體金、彩色或熒光膠乳以及順磁膠乳顆粒。

● 高靈敏度。在光學讀取檢測中，由于金顆粒的尺寸較?。ㄍǔＴ?0～40nm范圍內，對比這些系統中使用的彩色膠乳顆粒，則為100～300μm），從而在測試條帶上可以達到較高的填充密度，因此通?？梢允褂媚z體金而不是彩色膠乳顆粒來提高靈敏度。與典型的彩色膠乳顆粒相比，金也具有更高的顏色強度，這使在檢測中能夠更好地識別低值陽性結果。然而，相比之下，膠乳可以產生多種顏色，并且可以利用較深的顏色，如深藍色染料，這些顏色與側向層流膜的白色背景形成比膠體金更強烈的對比。纖維素納米顆粒有許多不同的顏色，在復雜的應用中也很有用。在以讀取器為基礎的檢測中，使用熒光或順磁顆粒，在某些情況下比使用膠體金或彩色膠乳等光學標簽，通常可以在高幾個數量級的區域產生更高的靈敏度。

有些標記方式盡管并不常用，也可以進行選擇，例如上轉換發光物、酶、膠體碳、鉑、順磁顆粒等。這些物質也可以產生高靈敏的信號，但是由于商務、法規等原因限制，它們并未廣泛使用。

（1）常規顆粒、標記和供應商

表2-3-4列舉了一些LFIA中最常用的熒光染料，以及其對應的激發、發射波長。表2-3-5列舉了常用的熒光信號以及對應的著色顆粒。

（2）下一代側向層流標記物性能的改善

傳統的LFIA方法包括將偶聯物顆粒分配到諸如玻璃纖維或聚酯纖維等纖維性偶聯物平板上。這些玻璃纖維是疏水材料，經過親水性試劑處理，以使其具有足夠的親水性以接受偶聯物。然后用高溫或凍干法在偶聯物平板上進行干燥。偶聯物通常在高濃度的糖或聚合物中干燥和穩定。

這個過程需要多個步驟，每個步驟都包含內在的變異來源，而這些變異來源又相應地導致測試結果的變異性。偶聯物平板的釋放效率通常不高，而且對于偶聯物顆粒來說總是變化很大。這是LFIA中信號強度標準變異系數（CV）的一個主要貢獻因素，試紙條和試紙條之間的變異系數在15%～30%的范圍內。為了克服這些問題，診斷咨詢網絡（DCN）已經開發了一些替代方法。

1）使用直接熒光標記。作為使用顆粒標記物的一種替代方法，熒光染料可以直接標記檢測試劑。普遍認識表明使用熒光顆粒會使靈敏度下降。這背后的原因是，一個直徑在300～400nm范圍內的熒光顆?？梢匀菁{20 000～30 000個熒光團分子。相比之下，一個抗體通常只能標記5～10個分子。然而，實踐表明，如果存在靈敏度損失也是最小的，反而系統中的CV大大減少。這可能是因為在沒有顆粒存在的情況下，檢測條帶上的結合抗體密度會高得多，從而補償了每個結合中熒光團的數量。從偶聯物平板上釋放出來的直接標記的蛋白質也要高很多，因為當在沒有顆粒存在的情況下，材料的纖維中捕獲的機會更少。

2）凍干法。傳統過程包括使用強風烘箱或干燥道將顆粒偶聯物干燥到偶聯物平板上。這一過程本質上是非均勻的，導致標準側向層流設計中偶聯物性能的變化，尤其是穩定性和釋放性。替代的方法是使用凍干法來制備微球，并將這些微球與檢測的其他部分分開儲存。這意味著偶聯物不在試紙條上，而是在檢測中的另外一個元件中干燥，如在將混合的樣本和偶聯物傳送到設備之前，可以將樣本添加到管子中。

從系統中去除微粒帶來了許多好處，包括：

● 提高偶聯物從平板釋放的效率；

● 提高干燥或凍干試劑的穩定性；

● 提高釋放的重現性。

這種方法的另一個優點是：偶聯物和樣本是預混合的，這使得抗原檢測法的性能更好，并且避免了與從偶聯物平板緩慢釋放以及樣本和偶聯物的混合物缺乏活性相關的潛在問題。使用該系統，較高的靈敏度和較低的CV（＜10%）都是可能的。缺點是：這種方法的一個結果是制造工藝不同于傳統的方法，需要優化和操作凍干工藝，其本質上是分批處理工藝，除非精心設計，否則會成為制造的瓶頸。微球的凍干和穩定化是一種特殊的工藝，對于不熟悉該工藝的廠家，相對來說很難將其擴展到生產批量。然而，有一些服務供應商可以優化這些類型的工藝，并根據生產規模提供凍干服務。最后，凍干微球除非精心設計和穩定化，否則對濕度高度敏感。許多凍干工藝需要將最終產品儲存在相對濕度低至3%的環境中。這導致需要在側向層流生產環境中對微球進行特殊處理，并且無法在通常的包裝環境中將微球儲存在盒中，而通常包裝環境中相對濕度通常保持在20%或以下。成功的關鍵是需要一個策略，包括仔細設計微球中使用的穩定劑和輔料，使微球能夠在相對濕度為20%或20%左右的穩定狀態下處理和存儲。

凍干法的另一個缺點是：現在可能需要兩個或多個操作步驟。然而，這可以通過一些創造性的設計和開發策略來克服。例如，DCN診斷公司已經設計了集成側向層流設備，該設備包含了多種附加功能，包括在機試劑儲存和集成的樣本處理功能。可以設計具有在機儲存試劑功能的試劑盒，既可以凍干形式，也可以液體形式。因此，可以為用戶設計操作簡單的設備，仍然可以實現美國CLIA的豁免（CLIA是指1988年的臨床實驗室改進修正法案修正案，見“床旁測試”），但是需要確定什么定義為多用戶步驟，包括樣本傳遞、偶聯物再水化，以及追蹤緩沖液傳遞（圖2-3-9）。

4.信號轉導和分析處理

傳統的POC免疫檢測被設計成定性的、閾值的檢測法，由使用者進行解釋，沒有讀取器的幫助。這種解釋方法導致了主觀性問題，并且幾乎不可能開發出定量的系統 。在臨床和現場環境中，還存在數據丟失、患者信息錯誤記錄以及使用者錯誤的可能性。開發具有集成讀取器系統的檢測法是許多下一代POC檢測系統的關鍵特性，同時代表了一個重要的技術挑戰，尤其是對基于現場的診斷平臺來說。

目前已經開發出了市售的讀取器系統，并且可以在各種環境和應用中使用。讀取器可以是手持式、便攜式臺式（移動）或真正的臺式系統。還可以購買到多種光學模式。以下的討論僅限于比色法（如膠體金或彩色膠乳）或熒光系統。

在開發用于現場應用的儀器時，目的是設計檢測和設計設備，使其具有分析過程的生物學所要求的適當水平的復雜性。這些檢測的自動讀取使得讀取檢測結果相對容易，并且減少人為錯誤的機會。

目前有許多讀取器技術用于側向層流應用，這些技術由不同公司生產，如Qiagen Lake Constance（德國）、Axxin Inc（澳大利亞）、Hamamatsu（日本）和LRE Medical（德國）。這些單元對于許多在“第一世界”的環境中的應用是非常理想的，它們是功能強大的、相對低成本的、經過校準的、高性能的單元，具有相關客戶服務和支持。然而，對于發展中國家來說，這些讀取器通常過于復雜和昂貴，并且用于校準、維護和操作的支持基礎設備不到位。

另一種替代方法是使用智能手機攝像功能將模擬信號格式的檢測結果轉換成數字信號格式。進一步的技術進步是分析應用和算法的開發，然后查詢數字數據，以提供可用的檢測結果，其中還可以包括處理選項。這些產品提供的讀取器解決方案可以應用于現場，并且利用現有的光學和通信技術。然而，這些在現場讀取檢測結果的通用方法面臨一些挑戰，包括平臺淘汰問題、缺乏與開發人員的協調和校準問題。監管問題也將阻礙許多發達國家市場采用這種類型的技術。由于這些問題，在未來一段時間內，讀取器在醫療診斷中的應用可能仍將局限于專門為該應用設計的專用讀取器系統。

（1）側向層流應用可用的光學選項

1）成像系統。成像系統的主要優點是，它們可以產生包含檢測條帶和質控條帶的讀取區域的完整圖像記錄。這在許多方面都很重要，包括醫學或執法應用結果的存檔，以及在試紙條全寬度范圍內條帶強度的平均，如果條帶的開發中存在不均勻性，這一特性可以用來使圖像獲益——在定性應用中特別有用。對于功能強大的、準備在現場有效應用的讀取器，這些系統中移動部件的缺少可能是一個特別的優勢。此外，許多成像系統可以針對特定客戶使用的標記物進行定制和優化，以減少噪聲并提高檢測靈敏度。這種定制允許提供讀取熒光標記物的儀器，包括基于銪的顆粒或熒光分子。

隨著數碼相機技術的發展，圖像生成和圖像處理技術也得到了長足的發展。包括Axxin Inc（維多利亞，澳大利亞）在內的多家公司，已經將低成本、高性能的成像硬件整合到專用設備中。其他公司使用現有的智能手機攝像頭和圖像分析軟件來在側向層流系統中生成高保真的結果。所有這些都將成像能力和高性能成像分析軟件相結合，該軟件可以識別檢測條帶和質控條帶的存在和位置、確定強度、扣除背景噪聲，并將結果與預先編程好的校準曲線和/或陽性/陰性判定的判斷值進行比較。

這些系統的缺點來自于許多方面。舊的基于CCD的技術成本較高，難以小型化。新的基于CMOS的技術雖然比較便宜，但是在圖像保真度方面的性能可能較差。盡管對于所有可用的技術來說都是如此，但成像系統的成本/體積比往往是至關重要的。被認為是使用通用平臺（如智能手機）的系統的主要缺點之一是平臺淘汰的問題。這類平臺的軟件、固件和硬件都在不斷發展，導致定期淘汰，使供應鏈的關鍵元素超出了服務供應商的范圍。某些讀取器供應商已經克服了這一問題，他們囤積其技術所基于的基礎單元，以確保以這種方式向客戶提供服務。其他供應商將淘汰包括在其設計階段，允許他們仔細地選擇具有實用的生命周期的組件，并計劃未來的組件替代（圖2-3-10）。

2）掃描系統。各種供應商，包括Qiagen Lake Constance（施托卡赫，德國）、LRE（慕尼黑，德國）和Hamamatsu（東京，日本），都提供基于掃描光學的側向層流讀取器?；具x項是點掃描系統，掃描區域較小，僅掃描反應后條帶寬的10%～20%，通常與線掃描相比，線掃描是掃描整個條帶寬或非常接近條帶寬的位置來完成的。使用點掃描，使試紙條在整個寬度上非常均勻的反應變得至關重要，這將許多責任推給試紙條開發人員和制造商來確保不會由于試紙條中不適當的流動特性而產生異常結果。這是一個一般通過適當的設計和控制試紙條的制造過程而可以避免的問題。該掃描系統的優點在于其低成本和低復雜性（圖2-3-11、圖2-3-12）。

（2）總結

一般來說，對于側向層流應用中的設計、開發和實現讀取器系統都有解決方案。實現這樣的系統的關鍵在于規格的仔細設置和合作伙伴的選擇。然而，應該記住，讀取器只是性能最佳測試平臺的一部分，連同檢測試紙條和在其中運行的設備，所有這三個元素必須一起進行優化才能獲得最佳效果。

5.對下一代性能的設備設計的考慮

在設計一個具有高水平性能且重要的是在商業化環境中具有操作的自由度的完整LFIA系統時，考慮整個系統的設計是至關重要的。設計中的一些創造性可以帶來巨大的性能收益。相比于標準的試紙條性能，改進的典型區域包括多路復用的能力和產生低CV結果的能力，從而實現量化。以下給出一些可能的設計方法示例，并對每一種方法進行考慮。

（1）量化和讀取器集成。

當考慮在LFIA中進行量化時，檢測盒設計中許多元素發揮作用。

1）樣本添加的控制。在許多系統中，定量地向試紙條傳遞準確的樣本體積變得至關重要。樣本可能已經經過了預處理，如過濾或稀釋。傳遞的體積和濃度的可容忍的誤差應該仔細的計算，還有在可行性驗證過程中所建立的檢測所致的可容忍的誤差，以及檢測公可容忍誤差應決定在樣本處理步驟中做出的許多設計決策。

2）流量控制。在確保試劑盒中適當的和一致的流量方面，有許多工程方面的考慮。要應用的第一條規則是，除非不同試紙條之間的所有材料是相同的，否則跨多條生產線使用相同的盒子需要仔細評估。不應該使用現成的零部件。通常用于側向層流生產的材料和工藝有相對較大的公差，這必須在盒子的設計中加以考慮。主要考慮因素包括：

● 將檢測試紙條安裝到盒子中——材料和層壓的可容忍的誤差；

● 樣本板是否允許充分壓縮以防止泄漏；

● 重疊/層壓的可容忍的誤差是多少；

● 條帶位置的可容忍的誤差是多少。

首先制成實際試紙條的工程圖紙是很重要的，這一步通常會被試紙條開發人員忽略。這給了工程師們一個關于系統可變性和關鍵可容忍的誤差的清晰的概念，他們必須在塑料的設備中考慮到這些（圖2-3-13、圖2-3-14）。

第一個關鍵步驟是確保添加到樣本孔中的整個樣本被吸收到樣本平板中，沒有發生溢流。特別是當讀取器要掃描設備的時候，橫跨試紙條寬度的均勻的條帶反應非常關鍵。平板之間重疊處的壓力點對于確保流動的均勻性至關重要。

3）讀取器集成。對于讀取器集成來說，還有另一組關鍵因素要考慮，包括條帶位置的可容忍的誤差，這些可容忍的誤差由層壓工藝和試紙條在設備中以及設備在讀取器中的定位來控制。試紙條的制造過程必須加以控制，以防止在拆除和層壓過程中在條帶位置上發生嚴重的漂移。檢測盒必須保持試紙條處于正確的位置，并且讀取器上插口內的功能需要將設備保持在相對于讀取器正確的方位。對于大多數光學系統來說，讀取窗口的形狀以及它如何影響試紙條的光照也是至關重要的。檢測盒被光照時不應投下陰影（圖2-3-15）。

（2）多重檢測

如果打算要進行多重檢測，應及早考慮是否在試紙條上嘗試多重（如一個試紙條上有多個分析物），或者是否在單個盒子中放置多個試紙條。是否可以使用單個試紙條完全取決于檢測方法和試劑，以及是否可以使用一個單獨的、允許每個試劑組發揮適當功能的條件組合來將分析物提供給每個檢測。這個決定可以影響讀取器的選擇、檢測盒的設計和加工，以及生產線開發的總體方法（圖2-3-1 6）。

三、總結：側向層流的未來方向

根據過去的性能和趨勢來推斷快速檢測市場的未來需求和方向是有難度的，而且基本上是徒勞的。例如，臨床快速檢測/POC市場正在發生結構性變化，包括產品購買和支付的方式、監管的方式、從傳統診斷市場內外出現的新的和強大的企業，以及全新市場的出現如個體化醫療和輔助診斷。由于所有的這些原因，很難預測在未來5～10年內市場將向何處演變。

然而，從技術角度來看，側向層流向其演變的方向也有一個相對清晰的走向。側向層流技術可能會繼續將重點放在更好的靈敏度、重現性、量化和多重的持續改進上。而它的應用向諸如消費者診斷等領域的演變，將繼續推動向集成設計特性的方向發展，這些特性可以使經過最低程度或未經培訓的用戶能夠直觀地使用。側向層流技術還將會繼續發現其他應用。它跨越各種潛在細分市場的一個主要的例子就是核酸側向層流（nucleic acid lateral flow，NALF）。

下一代檢測方法的目標是實現分子技術的靈敏度，以及側向層流檢測試紙條的穩健性、易用性、簡單性和降低成本。用于診斷應用的特異性DNA或RNA鏈的實驗室檢測的標準方法涉及固有的勞動密集型、復雜工作流程元素的應用，其中許多元素要求有自動化和高水平的質量控制，尤其是在定量檢測的應用中，以產生確認有效的結果。將這個復雜的工作流程簡化為一個簡單的一次性的盒子或一組簡單的易于執行的步驟，對于在POC中實現分子檢測是一個巨大的挑戰。這樣做意味著處理分子診斷檢測的工作流程中每一個被執行的步驟都需要被應用并被集成到一個檢測設備里。

這種簡化方法的一個關鍵元素是檢測不依賴于儀器。NALF是一種已經在許多系統中成功使用的方法。準備和制造NALF設備的方法是相對明確的，并且經過充分的驗證（例如，參見Piepenburg et al.，2006）。然而，在工業規模上的實現已被證明是困難的，有限數量的幾個系統已經接近商業化，包括BioHelix ExpressStrip（BESt）和SAMBA（基于簡單擴增的檢測）來自Diagnostics for the Real World（劍橋，英國）。目前這些研究進展迅速，預計NALF將成為下一代POC核酸檢測的標準工具。

這只是側向層流技術不斷演化的一個領域中的一個例子，然而，這也是這種技術靈活性的一個主要的證明。

世界衛生組織性傳播疾病診斷倡議（SDI）制定了確定的標準，作為確定檢測是否滿足疾病控制需要的基準。此后，這些標準作為預期是用于大多數分散的或快速檢測環境條件下的診斷技術的有益基準，得到了廣泛的應用。這些關鍵標準是可負擔得起的、靈敏的、特異的、用戶友好的、快速和穩健的、無需設備以及可交付給終端用戶的。

側向層流技術仍然是唯一一種廣泛使用的檢測模式，如果不是全部，它也能夠滿足大多數已經認同的標準，并在同時證明其應用的靈活性和性能保真度的能力，這種能力已經可以接近更加復雜的診斷技術。作為這種獨特的特征的集合，這種檢測模式很可能在未來許多年里在快速檢測領域占有一席之地。

四、參考文獻和進一步閱讀

（李士軍、楊薇　譯，何建文　審）