第二節 均相免疫測定

均相免疫檢測法只需將待測樣本和免疫化學試劑混合，然后進行檢測。樣本和免疫試劑發生免疫化學結合產生一種物理上可檢測的信號，無須將游離標記物與結合標記物進行分離。由于均相免疫檢測法的結合反應速率不受表面緩慢擴散的限制，所以孵育時間較短，通常只有幾秒鐘到幾分鐘；同時，均相免疫檢測法的非分離檢測方案最大限度地減少了對自動化的要求。至少從理論上來說，均相免疫檢測法比非均相免疫檢測法更為靈敏，這是因為非均相方法的分離和清洗步驟本身就更容易出錯，并且往往會逆轉弱結合反應，從而使靈敏度降低。然而，由于均相免疫檢測法的樣本成分沒有通過清洗步驟被去除掉，由樣本基質的非特異性影響而造成的檢測信號的變化，使得其高靈敏度的優勢往往無法實現。近期均相免疫檢測相關的研究集中于避免樣本干擾問題和提供與最好的非均相方法靈敏度相近或者更高的方法。

利用競爭性和非競爭性的方案，均相免疫檢測已被開發應用于某些大分子和小分子物質的檢測。免疫化學結合可以動態地進行，也可以在結合達到平衡后進行。每種均相免疫檢測法獨特的和共同的特點是，它們提供了一種機制來修飾由標簽產生的、作為免疫化學結合事件函數的信號。均相免疫檢測法這一特點與非均相免疫檢測法形成對比，后者依賴于在分離步驟之后識別固相標簽的位置。因此，大多數標簽是環境敏感的傳感器，對局部環境的pH、溶質濃度、電場、空間限制、輻射強度、溶劑化等變化做出響應。

首例報道的免疫檢測法是均相的，但并沒有使用標簽。該方法的提出歸功于Kraus，他在1897年創造了沉淀素（precipitin）這一術語，用來描述抗原和抗體混合后形成的沉淀物（Kraus，1897）。同樣，最早使用標簽的免疫檢測法也是均相的（Meyer，1922）。該檢測法采用綿羊紅細胞作為標簽，包被有人免疫球蛋白，類風濕性關節炎患者體內出現的抗免疫球蛋白抗體導致細胞形成明顯可見的凝集，從而展現抗體的存在，這種方法被稱為血凝反應。而后隨著分光光度法的出現，人們發現Kraus沉淀素反應中的可見散射光可以使用比濁法來測量，從而對沉淀素的形成進行定量（Boyden 等，1947）。然而，該方法并不適合常規使用。它不僅對樣本中的其他成分非常敏感，而且生成的信號是雙相性的——向固定數量的抗體中加入抗原時，信號先升高后降低（通常稱為前帶現象或鉤狀效應）。這是因為只有當抗體和抗原接近等摩爾濃度時，抗體才能在抗原間形成橋梁，產生多聚復合物。在低抗原濃度下，過剩的抗體包裹每個抗原分子；在高抗原濃度下，過剩的抗原占據每個抗體結合位點。

一、顆粒凝集法

顆粒凝集法（particle agglutination）中常見的顆粒形式包括：

（一）紅細胞與膠乳

均相免疫檢測法發展過程中的一個重大進步是用可控的膠乳顆粒代替Meyer法中的紅細胞（Singer，Plotz，1956）。通常，抗體與膠乳顆粒或紅細胞表面結合，當存在多價抗原時，這些顆粒或紅細胞形成聚集體。另一種方法是，顆粒表面可以包被抗原用于檢測抗體。競爭法和夾心法檢測體系均可以使用。非競爭性夾心法檢測的建立可以采用兩個抗體包被的、能結合多價抗原的膠乳顆粒。存在的抗原越多，凝集反應越多。凝集反應雖然不像沉淀素反應那么煩瑣，但足夠過量的抗原會產生雙相反應。此外，添加的抗原可以抑制抗體誘導的抗原包被顆粒的聚集，這種“凝集抑制”方法避免了雙相反應，但通常不太靈敏。無論哪種情況，我們只需要將樣本和試劑混合，并用光學方法測量凝集。Agen公司推出了該方法的一個創新模式，即使用患者自身的紅細胞作為檢測法中顆粒來檢測HIV抗體。該檢測法將HIV抗原偶聯到能夠與紅細胞表面的抗原結合的抗體上，添加到全血樣本中，抗原會立即結合到紅細胞表面，如果樣本中存在HIV抗體，紅細胞隨后會發生凝集（圖2-2-1；Wilson等，1991）。

雖然對凝集進行目視觀察具有一定的靈敏度，但無法定量。大多數儀器測量依賴于透射光比濁法（turbidimetry）或散射光比濁法（nephelometry）。透射光比濁法測量的是穿過樣本的透色光強度，散射光比濁法測量的是與光束成一定角度的散射光強度。散射光比濁法更靈敏，但也更容易受到樣本中顆粒物的干擾。由于光散射強度與顆粒濃度不呈線性關系，因此無法簡單地減去樣本本底。

如今已有各種策略來避免樣本本底問題。通過監測比濁信號的變化率，可以有效地減少用于藥物濫用的標準尿液檢測法（Abuscreen?，Roche Diagnostics）的問題，以及可以定量測量普通血清蛋白（ICS-Ⅱ?，Beckman）。另一種方法是檢測流動相中的單個顆粒，這些“顆粒計數免疫檢測法”（particle counting immunoassays，PACIAs）評估免疫化學反應中未聚集顆粒數量的變化（Masson 等，1981），此方法在測量低濃度分析物時最為可靠。

通過測量從懸浮顆粒散射的激光的角度各向異性（激光散射比濁法，laser nephelometry）可以獲得高靈敏度。光散射是顆粒大小的敏感函數，特別是當光的波長與顆粒大小相似時。與簡單的比濁法相比，該方法具有更高的靈敏度，但來自于樣本和試劑中顆粒物質的干擾也會增加（Von Schulthess 等，1976）。

（二）金納米顆粒

另一個用于檢測凝集反應的相關方法是使用比膠乳或者紅細胞具有更大增強光散射的顆粒。膠體金屬具有較高的折射率，并可以產生極強的光散射，散射光強度與顆粒大小密切相關。對于金溶膠來說，當金顆粒大小從50nm增加到120nm，可以觀察到相對清晰的明顯的吸收和散射光最大值從520nm增加到620nm。金納米顆粒濃度在低的飛摩爾范圍內可以被檢測到。Yguerabide和Yguerabide已于1998年描述了這一現象的理論基礎（Yguerabide &Yguerabide，1998）。

金納米顆粒的凝集改變了有效顆粒的大小，這一變化反映在懸浮液顏色的變化上。雖然目前對金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）應用的探索正在復興，但基于這一現象的多種“溶膠顆粒免疫檢測法”（sol particle immunoassays，SPIAs）早在30多年前就已經開發出來。例如，一種夾心法SPIAs通過將樣本與結合了抗人胎盤催乳素（human placental lactogen，HPL）抗體的金納米顆粒混合，并用比色計測量其顏色變化，可以檢測到5.4pM的HPL。此外，包括用于檢測激素的競爭性免疫檢測法在內的其他檢測也得到了證明（Leuvering等，1980）。目前，雖然納米技術的興起使人們對該方法的研究更加深入，但在靈敏度方面幾乎沒有改進。Liu 等人（2008）提出使用動態光散射（dynamic light scattering，DNS）代替光吸收來監測球形金納米顆粒標記的抗體和金納米棒標記的另一種抗體的凝集程度。盡管該方法對顆粒大小和形狀的控制有所改善，且使用了更先進的檢測方法，但游離前列腺特異抗原（prostatespecific antigen，PSA）的最低檢測限（0.1ng/mL（4pM））沒有本質上的變化。然而，通過將金納米顆粒附著在磁性顆粒上，聚集的磁場增強，可使DNS檢測到低至140fM的甲胎蛋白（Chun 等，2011）。

另一種檢測金納米顆粒凝集的方法是利用其在不發生光漂白的情況下吸收光的能力。基于光熱束偏轉原理（photothermal beam deflection，PBD），這種性質被用于甲胎蛋白的檢測。抗體被結合到20nm的金納米顆粒和較大的50μm的玻璃顆粒，在多價抗原存在的情況下，每個玻璃顆粒周圍會聚集很多金納米顆粒。用強光束照射懸浮液時，每個聚集體附近會產生高度局部化的加熱，聚集體附近溶液折射率的改變導致光束可測量角度的偏轉。雖然較大的玻璃顆粒的快速沉降降低了該方法的便利性，但是相比膠乳顆粒的凝集反應，該檢測法在靈敏度方面提高了一個數量級（Sakashita等，1995）。

（三）磁性納米顆粒

除了金納米顆粒的應用外，檢測磁性納米顆粒的免疫化學誘導的聚集也是檢測病毒和細胞分析物的一種極具前景的方法。具有超順磁性氧化鐵核的納米顆粒具有單磁疇，在磁場作用下會對齊。當納米顆粒以這種方式被磁化時，它們會形成能影響水的核自旋弛豫時間的簇，這與傳統的磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）測量的參數相同。在一項研究中，使用具有親水表面涂層并與抗HSV-1抗體偶聯的磁性顆粒，通過臺式磁共振成像儀監測弛豫時間，可以檢測到100μL血清中低至50個的HSV-1病毒顆粒（0.8aM）（Perez等，2003）。利用小分子抗原可以干擾抗體包被和抗原包被的磁性納米顆粒結合的能力，類似方法同樣可以用來檢測小分子抗原，隨著MRI儀器在縮小體積和降低成本等方面取得進展，該方法的臨床應用可能會取得進展。Lowery（2009）最近對該方法進行了綜述。

Ranzoni等人（2012）描述了一種創新的方法來監測免疫化學誘導的磁性顆粒聚集，從而避免使用昂貴的儀器。向300nm或500nm抗體包被的磁性顆粒施加磁場可誘導聚集并加速抗原夾心顆粒對的形成。用旋轉磁場代替靜止場會使未附著的顆粒分散并誘導顆粒對的受控旋轉。通過同時用激光照射樣本，旋轉粒子對的光散射被轉換成粒子對方向改變的函數。信號可以作為分析物濃度的函數來進行分析。采用該方法，在3min之內，可以檢測出緩沖液中0.4pM和血漿中5pM的BSA。

二、裂解免疫檢測法

由免疫球蛋白與細胞抗原結合引發的細胞裂解是機體防御機制的基本部分。該過程依賴于補體的作用，補體是一種復雜的蛋白質混合物，通過與細胞表面的抗體結合，觸發一系列級聯反應，并最終導致細胞裂解。該過程是一種被深入研究但很少使用的均相免疫檢測法——溶血免疫檢測法（hemolysis immunoassay）的基礎。在待分析樣本存在的情況下，與紅細胞共價結合的抗原可與抗體結合。可用于與細胞結合的抗體量受樣本中存在的游離抗原競爭性結合的影響。結合后，加入含有補體的血清，進一步孵育并完成裂解后，剩余的完整細胞被除去，通過血紅蛋白的光吸收，來測量釋放到溶液中的血紅蛋白濃度（圖2-2-2）。由于相對較少的結合事件即可導致許多血紅蛋白分子被釋放，因此該方法的檢測靈敏度接近于放射免疫檢測法（Arquilla&Stavitsky，1956）。

盡管溶血免疫檢測法在早期有所成就，但現在已經成為歷史。紅細胞難以儲存，操作方法很復雜，補體不穩定，并且必須采取措施使樣本中可能存在的補體失活。許多克服這些問題并提高檢測靈敏度的嘗試已經取得了一定程度的成功。一個更簡單的方法是測量釋放的血紅蛋白的過氧化物酶活性而不是它的光吸收。由于熒光或化學發光底物不進入細胞，因此使用此類底物可以避免細胞去除的步驟。然而，試劑穩定性和樣本組分的干擾問題仍然存在（Tatsu&Yoshikawa，1990；Tatsu等，1992）。

裂解免疫檢測（lysis immunoassays）的一個重大進展是，當人們發現在抗體與表面抗原結合時，比紅細胞更穩定的脂質體（liposomes） 也可以被補體裂解（Kataoka等，1971；Kinsky，1972），釋放的物質不再局限于血紅蛋白。在脂質體形成的過程中，幾乎所有的溶液中的化合物原則上都可以被包裹。蛋白質和其他大分子幾乎可以被無限期地保留，而足夠親水的較小分子只能緩慢地滲漏出來。研究已經發現了許多能被包裹的標簽。被包裹的熒光化合物在足夠高的濃度下通常會被淬滅，僅在被釋放時才會產生熒光（Yasuda等，1988），而表現出濃度依賴性的染料也有類似的表現（Frost等，1994）。穩定的氮氧自由基被捕獲后，其溶液在稀釋時顯示出電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）光譜的變化（Chan等，1978）。被包裹的螯合劑釋放后，可與稀土元素離子結合形成熒光復合物（Ius等，1996）。被包裹的酶底物在釋放時可被本體溶液中存在的酶轉化為可檢測的產物（Thompson&Gaber，1985），且釋放的輔酶也可以與相應的脫輔酶反應（Haga等，1990）。

基于包裹化酶（encapsulated enzymes）的使用，商業化脂質體裂解免疫檢測法的開發已經引起了廣泛的關注（Canova-Davis等，1986；Yu等，1987）。酶不僅能夠抵抗滲漏，還提供了無限放大的機會，因為每個脂質體都可以釋放許多酶分子，而每個分子可以產生許多可檢測的產物分子。遺憾的是，這種潛在的強大方法的實際應用難以發展。用于穩定標準化補體溶液的方法尚不明確，并且血清樣本中補體活性和抑制劑的存在也未被成功克服。

三、自旋免疫檢測法

Coons首次提出免疫檢測中可以利用除顆粒之外的其他分子報告基團，他使用熒光素標記的抗體來使抗體與組織切片的結合可視化（Coons等，1942）。盡管熒光標簽最后變得非常有用，但穩定的氮氧自由基是均相免疫檢測法中第一個常用的報告基團。氮氧自由基具有一個未配對的電子，用EPR光譜（EPR spectroscopy）可以檢測到。電子具有1/2的自旋，在磁場中有兩個（2S + 1）取向。這些電子狀態之間在依賴于場強的精確微波頻率激發下可以發生躍遷。緊密相關的氮核具有S = 1，提供了3個可能的局部磁場，因此存在3個獨立的共振頻率。當涉及磁場中氮氧化物基團的取向時，這種超精細耦合是各向異性的。當分子相對穩定時，氮氧化物溶液中許多可能的取向產生寬的光譜。然而，如果分子足夠小，由于分子的快速轉動而導致超精細耦合的平均化，則產生清晰的三線光譜。

小的氮氧化物標記的藥物，如嗎啡與抗嗎啡抗體的結合會大幅度降低其轉動的速率，從而導致譜線變寬（圖2-2-3）。在游離嗎啡存在的情況下，氮氧化物標記的藥物的結合會被抑制，譜線變窄，這是“自旋免疫檢測法（spin immunoassay）”的基礎，自旋免疫檢測法是第一種被廣泛應用的商業化均相和非均相免疫檢測法（Leute等，1972）。它以商品名FRAT出售，在越南戰爭期間，美國陸軍用它篩查濫用藥物的人員。該方法是完全手動的，但非常簡單快速，使用毛細管吸入固定體積的尿液，然后將毛細管的內容物注入由標記藥物和抗體混合物組成的試劑中，再將溶液吸回毛細管中，塞住毛細管的一端并放入EPR腔中。整個過程大約在30s內手動完成，幾乎不需要任何培訓。戰爭結束后，該方法因其靈敏度差（約10-7M）和儀器昂貴而被放棄使用。

四、熒光免疫檢測法

熒光免疫檢測法（fluorescence immunoassays）通常有以下幾種：

（一）熒光偏振

另一種監測轉動速率變化的方法是熒光偏振免疫檢測法（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）。光被分子吸收的差異取決于它們相對于激發光的方向和偏振是如何取向的。隨后，由每個被電子激發的分子所發出的作為熒光的光一般會發生偏振。然而，自由轉動的分子在它們持續被激發的期間旋轉，從而使它們的取向隨熒光偏振的凈減少而隨機化。轉動越快，觀察到的偏振熒光越少（圖2-2-4）。這種現象首先應用于Dandliker的均相免疫檢測法中（Dandliker&Feigen，1961；Dandliker等，1973）。與自旋免疫檢測法一樣，抗體與標記抗原結合，如與青霉素結合的熒光素，會影響標簽的轉動速率。游離抗原的存在抑制了結合，導致自由轉動標簽增加，從而減弱了發射光的偏振。最初，該方法只是實驗室的一時新奇而已，這是因為商業化的熒光分光光度計還處于原始的發展階段，并且需要進行兩次差別在于偏振鏡需要進行90°旋轉的單獨測量。

FPIA與自旋免疫檢測法一樣，也得到了廣泛的應用，盡管主要用于小分子分析物的檢測。將待測樣本與抗體混合，樣本中的抗原與熒光標記的抗原競爭結合抗體，抗原濃度越高，產生的偏振越少。雅培公司（Abbott Laboratories）主要使用FPIA在其免疫化學系統上進行治療藥物監測和藥物濫用測試。該方法被棄用多年之后又取得成功，很大程度上源于改進后的分析偏振光固態方法的發展。

FPIA難以分析高分子量分析物，有以下兩個原因：第一，大抗原與可能具有相似質量抗體的結合產生的轉動率變化相對更小，從而導致偏振的變化更小；其次，大多數熒光標簽的激發態壽命在10-9～10-7s范圍內，壽命太短不能使較大的生物聚合物發生旋轉重定向。基于錸的熒光團顯示出的偏振熒光壽命為3ms，雖然擴展了理論上可行的特殊應用的分子量范圍（Guo等，1998），但由于淬滅影響偏振的測量，所以在長時間存在的激發態下，淬滅雜質的干擾問題越來越大。

來自外來熒光團的干擾和標簽與生物樣本中蛋白質的非特異性結合，在歷史上限制了FPIA的檢出限約為100pM的濃度。通過使用高親水的長波長染料以及可區分本底和標簽發射的延時測量，FPIA已被證實可以在緩沖液中檢測低至10pM的寡核苷酸（Devlin等，1993）。2010年發表了一篇關于熒光偏振免疫在檢測中應用的更詳細的報道（Jameson和Ross，2010）。

（二）熒光共振能量轉移

熒光（或弗斯特，Fo¨rster）共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是指能量從電子激發的供體分子轉移到附近具有能量可達激發態的受體分子。供體和受體之一或兩者的激發態會隨熒光發射而衰減。當兩者都為熒光時，能量轉移可以通過供體的發射強度的減少和同時發生的受體較長波長發射強度的增加來觀測到。與免疫檢測法最相關的能量轉移機制取決于電子躍遷偶極子的通空耦合（F?rster，1948）。能量轉移速率與供體和受體之間距離的六次方成反比，并且與供體熒光發射和受體吸收光譜的重疊直接相關。根據所使用的染料不同，供體熒光降低50%的距離，即FRET距離R_o，可以接近10nm。

FRET免疫檢測法最初是為了避免使用當時可用的原始方法測量熒光偏振而發展起來的（Ullman等，1976；Ullman&Khanna，1981）。該方法只需要一個簡單的熒光計，且適用于小分子和大分子檢測。通過將熒光供體偶聯到抗原上、受體分子偶聯到抗體上，可以很容易地構建競爭性免疫檢測法。通常，抗體與多個受體分子連接，以確保在有效的能量轉移距離處免疫復合物中至少有一個受體。在免疫（夾心）檢測法中，每個抗體上可能需要多個供體和受體（圖2-2-5）。通常，檢測法是通過在免疫化學結合初始階段的期間內，跟蹤熒光的變化速率來進行，這減少了樣本對熒光的干擾，因為通常樣本的干擾在整個檢測過程中是不變的。在競爭性免疫檢測法中，抗原通過競爭抗體結合位點導致供體熒光減少的速率降低。在夾心免疫檢測法中，由于兩種抗體與抗原的加速結合，抗原濃度的增加加速了供體發射光的淬滅。與沉淀素和膠乳凝集法一樣，FRET免疫檢測法必須使用足夠的抗體濃度，以避免在抗原過量時發生前帶現象，此時只有單個抗體分子可用于與結合抗原。

FRET免疫檢測法的首個商業化應用是在Syva的Advance?免疫化學系統中。在該系統中，監測的是供體熒光的減少，而不是理論上更敏感的受體熒光的出現。這一環節很必要，因為難以找到一種不被用來激發供體而直接激發的熒光受體的光。然而，通過使用消光系數接近2×106/（M·cm）的高熒光蛋白——藻紅蛋白作為供體，均相血清地高辛檢測法可以獲得足夠的靈敏度，并可以定量測量血清中500pM的藥物（在檢測介質中25pM）。

通過開發專門的受體和替代的能量供體，后續的FRET免疫檢測法規避了這個問題。例如，已發現金納米顆粒（AuNPs）是高效的FRET受體，它可在不干擾受體自發熒光的條件下直接監測供體熒光。均相肌鈣蛋白夾心免疫檢測法證明了這種類型淬滅劑的優點，該檢測法使用與AuNP結合的抗肌鈣蛋白抗體和用高熒光Cy3標簽標記的第二個抗肌鈣蛋白抗體。兩種抗體與肌鈣蛋白結合后，可導致高達95%的熒光淬滅，并可檢測濃度低至20pM的肌鈣蛋白（Mayilo et al，2009）。類似地，石墨烯已經被證實是一種高效的受體，以熒光量子點作為供體。F?rster能量轉移距離超過10nm，并可以構建一種能夠檢測甲胎蛋白的靈敏的FRET免疫檢測法（Liu et al，2010）。

量子點（quantum dots，QD）作為能量受體的使用近來受到了相當多的關注。常用的CdSe/ZnS核/殼QD可以在2～10nm的范圍內制備成各種尺寸。它們具有相似但不相同的吸收光譜，并且根據其尺寸大小，在不同波長下能有效地發出窄帶光譜。因此，QD非常適合在多重免疫檢測法中作為共用熒光供體的能量受體，在多重免疫檢測法中，每種分析物可以通過對組合的發射光譜去卷積來進行獨立分析。Geissler等人（2010）在一個模型系統中，利用時間、激發波長和發射波長分辨率的組合，使用不同的鋱供體和5個不同的量子點作為熒光受體，進行了五重檢測。有文獻近期對量子點在FRET檢測法中的使用進行了綜述（Algar和Krull，2010）。

時間分辨FRET免疫檢測法，TR-FRET（timeresolved FRET immunoassay，TR-FRET）的發展為熒光免疫檢測法提供了重大改進。作為供體的稀土螯合物特別適用于此目的（參見第三部分“信號產生及檢測系統”一節）。這些標簽具有毫秒數量級的長壽命熒光，而大多數熒光物質的熒光發射都在一微秒內衰減。在短暫的光脈沖之后，來自樣本雜質和已經被直接激發的受體分子的發射光迅速衰減。供體的共振能量轉移激活受體分子，隨之測量的延長熒光只與來自供體發射以及那些被供體共振能量轉移而激發的受體分子的發射相關。與穩定狀態的熒光測量相比較，本底發射的降低提供了更高的靈敏度，并且可以通過測量受體和供體發射光的比例來降低樣本基質的淬滅效應。Cisbio在TRACETM時間分辨放大穴合物發射（time-resolved amplified cryptate emission）的方法中使用了該方法，并使用了銪螯合物供體以及從紅藻中獲得的能接受能量的熒光基團——別藻藍蛋白（Mathis，1993）。利用Cisbio的KryptorTM時間分辨熒光分析儀，進行了藥物發現均相結合檢測法。目前，時間分辨、量子點、金屬顆粒以及石墨烯受體的各種附加組合形式是研究熱點，它們也可以幫助進一步提高FRET免疫檢測法的敏感性和多重復用。

上轉換磷光體（up-converting phosphors）代表熒光供體的另一種類型，可以避免不必要的受體和熒光樣本組分的直接激發。在通常的照射條件下，與用于激發的光相比較，熒光分子發出的光波長更長。這是因為熒光分子的起初激發態在重新發光之前以發熱的形式失去振動能量。在足夠強度的更長波長的光激發下，通過同時或者逐步地吸收兩個或者更多較低能量的光子，可以達到相同的激發態。來自激發態的熒光發射波長雖沒有實質上的改變，但是卻比激發光的波長更短，因為激發光是近紅外的，來自受體和樣本中熒光分子的本底發射是最低的。即使本底熒光強度很大，由于如1，4-雙-（4-二氨基苯乙烯）苯衍生物這樣的熒光分子在800nm處具有較大的雙光子吸收截面，所以可與非熒光受體一起用于檢測低至50pM的抗BSA抗體（Liu et al.，2008）。

基于上轉換顆粒（UCPs）的使用是一種更穩健的上轉換方法。UCPs是在晶狀基質中嵌入稀土元素的陶瓷材料，這些稀土元素通常吸收970～1 000nm波長的光。該方法可制備亞微米至小于10nm大小的顆粒。由于上轉換到可見光譜區域是在相對長壽命激發態的連續激發下發生的，因此并不需要很高強度的激發光（Austin and Lim，2008）。使用UCP結合的抗體和 Alexa Fluor680標記的17-β雌二醇，可以對20%的全血中低至0.5nM的雌二醇進行定量檢測（Kuningas et al.，2007）。980nm的近紅外激發光經磷光體上轉換到660nm，繼而將能量轉移到發射波長為740nm無樣本本底熒光的Alexa染料上。

（三）熒光保護檢測法

在免疫檢測法中用于調節熒光的另一種方法是對系統進行排列，使那些在免疫復合物中未被結合的熒光標簽淬滅。這是一種直接的方式，無須從結合的標簽中分離游離標簽，且可用于將非均相熒光免疫檢測法轉換為均相模式。例如，競爭性免疫檢測首先孵育分析物、抗體和熒光標記的抗原。抗體可以存在于溶液中或者結合在物質表面。隨后加入只選擇與未結合標簽反應的淬滅試劑，并測量與結合標簽相關的剩余熒光。

最普遍的熒光保護檢測策略是用抗熒光抗體作為淬滅試劑。一些熒光團比如熒光素，只要與抗熒光抗體結合就會被淬滅。當這種結合產生不完全的淬滅作用時，非熒光能量受體就會結合到抗體上。假如熒光標簽通過短鏈與低分子量半抗原結合，抗體與半抗原和標簽的同時結合會在空間上受到阻礙。因此，半抗原結合的熒光標簽會被抗熒光抗體淬滅，除非它們與抗半抗原抗體結合以受到保護（圖2-2-6）。蛋白質抗原上的熒光標簽受抗體結合保護的效果較差，這一問題可以通過提供一種在空間上阻礙抗熒光抗體與抗原免疫復合物結合的方法來克服。實現空間位阻的一種有效的方式是通過使用增加尺寸的抗熒光素抗體，可以通過將抗熒光素抗體與抗免疫球蛋白形成免疫復合物或者與右旋糖酐形成偶聯物來實現（Zuk et al.，1979）。

熒光保護同樣也可以應用于使用了熒光標記抗體的檢測法，前提是結合的組分有充足的空間。當熒光標記的蛋白質抗體與固定在懸浮瓊脂糖顆粒上的抗原結合時，熒光標簽被隔離，不能與隨后加入的抗熒光素抗體結合。游離抗原越多，標記的抗體與瓊脂糖抗原結合越少，則被淬滅的熒光標簽越多。通過添加包被了抗熒光素抗體的碳顆粒懸浮液可以更好地區分結合和游離的抗體。碳顆粒不僅可以增強淬滅，而且可以抑制殘余的抗熒光劑抗體與瓊脂上的熒光標簽的緩慢結合（圖2-2-7；Ullman，1981）。最近發現，高效的AuNPs和石墨烯淬滅有望取代碳顆粒淬滅，從而明顯地改進熒光保護免疫檢測法。

特別是對于小分子分析物的競爭性免疫檢測，熒光保護檢測法比FRET更有優勢，因為只需要一個標簽，故可以使用不同的熒光標簽來進行多重檢測。此外，熒光保護檢測法可調節高達98%的熒光信號，相比之下，FRET只能調節30%～80%。這兩種方法的靈敏度都受到樣本熒光背景干擾的限制，除非使用了時間分辨熒光。如在FRET中，這一問題可以通過測量淬滅速率而不是測量加入最后一個試劑后的反應終點來最小化。這樣有效地減去了靜態樣本的本底，雖然對脂血的樣本來說，稀釋后脂質的溶解而引起的光散射變化可能也是一個問題。

令人驚訝的是，熒光保護免疫檢測法雖然比FRET更有優勢，卻很少受到關注，主要被應用于配體和細胞受體結合的非免疫化學檢測。熒光標記的配體和非標記的待測化合物可以競爭細胞表面受體的結合。加入抗熒光素抗體只會淬滅未結合的偶聯物，因此待測化合物的有效競爭越少，熒光強度越高（Sklar et al.，1982）。

（四）熒光波動分析

目前已經發展出很多不同的基于通過檢測熒光強度的時間變化來檢測免疫化學結合的方法用于均相免疫檢測法。抗原-熒光劑結合物與包被著抗體的膠乳顆粒的結合，當然會導致這些顆粒具有熒光性。假如顆粒上抗體的數量和親和力足夠高，則由顆粒所定義的體積內結合物濃度會比在本體溶液中更高。通過用激光掃描這些顆粒懸浮的小體積來檢測結合。使用熒光波動關聯方法，結合發生的時候可以觀測到增強的波動，這是由于熒光顆粒在某些體積中存在，而在其他體積中不存在（Elings 等，1983）。

這種方法已被應用于均相血型鑒定系統。全血細胞用膜溶性熒光染料染色，血型特異性抗體導致的熒光紅細胞的聚集可以通過熒光波動分析法檢測到。為此，探針伸入到有兩根光纖的溶液中，其中一根光纖向溶液中輸送窄束光線，另一根光纖從光路的一小段收集熒光發射并將其發送到光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）。通過使用大約1nl的掃描體積，就可以將單個細胞產生的波動與二聚體產生的區分開來，而無須等待更大的聚集物形成（圖2-2-8；Ghazarossian et al.，1988）。

一種相關的方法被用于來進行高通量篩選的配體與細胞或膠乳顆粒結合的均相檢測中。Applied Biosystems的FMAT?系統中，表面有受體或抗體的細胞或顆粒、熒光標記的配體以及待測化合物在微量滴定孔中混合。用激光掃描孔底表面，每次只激活一小部分體積。熒光波動的大小可以用來估計標簽結合的程度，這與待測化合物結合的能力呈負相關。這種方法允許標記兩種發射不同波長的染料來實現多路復用。

從足夠小的體積測量熒光的能力使熒光相關光譜（fluorescence correlation spectroscopy，FCS）能夠取代熒光標簽聚集體的簡單檢測。FCS可以在足夠低的熒光濃度和足夠小的掃描體積下（通常大約1fL）觀察到單個分子的熒光。待檢測分子可以通過它們在檢測體積中擴散的特征速率來與其他的熒光物質區分開來，而這種特征擴散速率受分子的數量和形狀影響。該方法可用于藥物的高通量篩選，篩選條件確保游離和結合的熒光顆粒具有不同的擴散速率，可以實現靈敏的均相免疫檢測。例如，Tang et al.（2010）使用熒光分子標記的抗體和結合到更大的14nm銀納米顆粒的第二抗體進行夾心免疫檢測，可以檢測到濃度低至1.4pM的血清甲胎蛋白。更高的靈敏度可以通過使用不同的人IgG抗體分別與40nm的金顆粒結合來獲得（Chen et al.，2009）。這種顆粒具有熒光性和光穩定性（He et al.，2008），且它們的擴散特征可以被免疫化學性誘導的聚集極大的改變。在20%犬的血清中，可以檢測到濃度低至5pg/mL（30fM）的人IgG。

通過使兩個不同的熒光分子變得在免疫化學上相互關聯，可以避免區分其不同擴散速率的要求（Winkler et al.，1999）。來自成對熒光劑的共焦發射可以很容易與非成對分子區分開。該方法被稱為共焦熒光一致分析，后更名為熒光交叉相關光譜（fluorescence cross-correlation spectroscopy，FCCS），通過在光譜波動分析中包括FRET的相互作用，這種方法被進一步增強。Eggeling 等人于2005年描述了各種額外的分子組合。

五、化學和生物發光免疫檢測法

化學和生物發光免疫檢測法（chemi-and bioluminescent immunoassay）作為均相免疫測定的方法被深入研究。

用可能更靈敏的化學發光共振能量轉移（chemiluminescence resonance energy transfer，CRET）取代FRET的努力目前還不樂觀。CRET不同于FRET之處只是用化學激發FRFT供體而不是用光激發。早期試驗中，為了獲得更高的靈敏度，使用異魯米諾標記的多種半抗原和蛋白質抗原可以在其與熒光素標記的抗體結合時，使熒光發射更靈敏（Patel 和Campbell，1983）。盡管該檢測法在靈敏度上與放射免疫檢測法相當，但化學發光反應對樣本組成差異的高度敏感性導致其部分性能無法接受，至少對臨床應用來說是這樣的。最近，高效的微分子能量受體，例如石墨烯（Lee等，2012）已被用來淬滅過氧化物酶催化的魯米諾氧化的化學發光。使用石墨烯和過氧化物酶分別偶聯兩種不同抗體的均相C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）夾心免疫檢測法，可在臨床相關水平（nM）檢測血清CRP。在類似的用于檢測甲胎蛋白的夾心免疫檢測法中，使用AuNPs取代石墨烯進行淬滅，在較低pM范圍具有更高靈敏度（Huang 和Ren，2011）。

天然生物發光酶在免疫檢測法中的使用具有潛在的優勢，因為發色團通常會被隔離，受樣本中可能存在的干擾物質的影響最小。生物發光共振能量轉移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）作為監測蛋白結合相互作用的方法已經被深入地研究，但是令人驚訝的是BRET免疫檢測法卻很少受到的關注。在一個值得關注的例子中，生物發光的海腎熒光素酶被用作供體，增強的黃色熒光蛋白被用作受體；抗溶菌酶抗體的V_H和V_L片段分別以每種標簽的嵌合蛋白形式表達；溶菌酶的存在引起兩種抗體片段的結合和重組，導致在底物腔腸素存在的情況下，受體蛋白的發射光增加（Arai等，2001）。同一組研發人員論證了一種用于檢測十肽的競爭性BRET免疫檢測法，該檢測法使用螢火蟲熒光素和十肽抗原的融合蛋白以及熒光（Cy3.5）受體標記的抗體（Yamakawa等，2002），這兩種方法都沒有很高的靈敏度。

六、表面增強拉曼散射

拉曼光譜測量的是化學物質在輻照過程中以偏移頻率散射的極小部分光。頻率偏移是由電子振動耦合引起的，與激發波長無關。分子在接近金屬表面時會顯示出表面增強拉曼散射（surfaceenhanced Raman scattering，SERS），可產生1011倍的拉曼信號增強。AuNPs 和銀納米粒子可以產生較大的增強功能，具體取決其大小和形狀以及與其他增強子的接近程度。粗糙金屬表面增強的磁場可使吸附在金屬表面的分子拉曼散射信號被放大。通過免疫化學誘導的顆粒與粗糙金屬表面的結合，可構建高靈敏度的異相免疫檢測法。近年來，人們對開發SERS均相免疫檢測法表現出相當大的關注，但該方法的潛在高靈敏度尚未被認識到。Chen等人在2008年報道了使用SERS的人IgG均相免疫檢測法。該方法在AuNPs上標記抗人IgG抗體和另一個增強子；粒子與IgG結合后的聚集增強了拉曼散射，但該方法的靈敏度限制在約0.7nM IgG。Li等人在2008年使用蛋白A標記的金顆粒和熒光素（增強子）標記的生物素，將生物素化IgG的模型檢測系統的檢測限值降低了一個數量級。相比之下，在IgG的異相夾心免疫檢測法中，標記特制立方金顆粒的抗體與金表面結合，其靈敏度可達到1pM（Narayanan等，2008）。

七、酶免疫測定法

酶免疫測定法（enzyme immunoassays）包括以下幾種技術：

（一）酶放大免疫測定技術

均相酶免疫測定法于1972年被首次提出，次年以EMIT?（Rubenstein等，1972）作為商品名應用于尿液中藥物濫用的商業化檢測法，又稱為酶倍增免疫檢測技術（enzyme-multiplied immunoassay technique）。該檢測法使用一種簡單的“混合-讀數（mix-and-read）”方法，其優點是可使用通用標準實驗室分光光度計。該方法是基于抗藥物抗體抑制溶菌酶-藥物偶聯物酶活性的能力，酶可催化細菌細胞壁水解，通過清除混濁的細菌懸液進行監測。在游離藥物存在的情況下，與偶聯物結合的抗體減少，從而導致清除率增加。之所以選擇溶菌酶，是因為其與大的底物反應似乎容易受到抗體的空間抑制（圖2-2-9，左箭頭）。然而，光散射檢測并不非常靈敏，且由于血清引起的細菌凝集，該方法并不適用于血清檢測。

理想的酶不應存在于待測樣本中，低濃度狀態下也可被通用的光譜儀檢出，且酶活性不受樣本基質影響；此外，酶在偶聯后必須保持活性和穩定性，最重要的是，產生的偶聯物活性必須由抗體調節。葡糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）來自于腸膜樣明串珠菌中，可滿足大多數這些要求。G6PDH的相對分子質量為109kDa，包含兩個相同的亞基，可將NAD轉化為NADH，在340nm波長處可測量吸光度；血清中的內源性G6PDH與NADP反應，因此不會干擾測量。當半抗原與G6PDH上賴氨酸的氨基結合時，所形成的半抗原和G6PDH偶聯物會受到抗半抗原抗體的抑制；盡管抗體不大可能對小底物產生空間位阻，但結合的抗體與酶之間的分子接觸通過改變酶的構象產生抑制作用（圖2-2-9，右箭頭）；觀察到的抗體抑制率可高達80%，但其抑制率的大小主要取決于半抗原的結構和抗體的特異性。增加每個酶分子的半抗原數量可提高抑制能力，但同時也會降低酶的活性。將半抗原僅靶向定位于那些具有抑制作用的賴氨酸是很困難的，因為不同位點針對不同的半抗原具有活性，因此該方法需要經常進行廣泛篩選，以確定連接偶聯物的合適方法和確定有效的抗體。

盡管存在這些局限性，但針對大量治療藥物的血清EMIT G6PDH檢測法和針對濫用藥物的尿液檢測法已經被成功開發出來。目前已報道了幾種利用大分子底物的替代酶，如淀粉酶、磷脂酶C、線粒體蘋果酸脫氫酶和葡聚糖酶等，但這些酶要么對血清成分過于敏感，要么在低濃度時難以測量。

當前的EMIT法使用轉基因的G6PDH以實現使用更少的半抗原進行更大調節，其偶聯物更穩定并提供更大的檢測響應。半抗原連接到每個亞基的單個半胱氨酸（沒有天然的半胱氨酸）上，半抗原結合在一個位點上，使得抗體誘導的調節最大化；合適的位點可通過繪制酶表位圖來確定，該表位由一個可誘導酶構象變化的抑制型抗G6PDH單克隆抗體來識別；然后利用半胱氨酸系統地一次替換該表位中的氨基酸（Ullman，1999年）；藥物與半胱氨酸巰基結合制備的偶聯物的活性未受影響。目前，西門子醫療公司（Siemens Healthcare）使用重組的G6PDH構建的EMIT檢測正在銷售，用于地高辛的檢測，該檢測必須對低至500pM的地高辛進行精確定量。

基于酶偶聯物活性的簡單調節免疫檢測法的主要局限性在于針對大分子設計檢測法的難度。該問題的根源是需要使抗體與酶緊密結合，從而對酶的活性產生強烈的影響。目前一種基于抗體與蛋白質類抗原形成聚合物能力的方法取得了些許成效。已經發現，辣根過氧化物酶（HRP）可被高濃度過氧化氫抑制，但當其作為一個大聚合物的一部分時，酶活性則可以得以保存（Hoshino等，1987）。利用該原理，已經報道了用于蛋白C（protein C）、甲胎蛋白和多形核白細胞彈性蛋白酶的均相酶免疫測定法。在這些檢測中，抗體-HRP偶聯物與抗原結合形成聚合物（沉淀素）后，當使用高濃度的過氧化氫時，其酶活性仍然能保持。該方法必須使用足夠的抗體來避免前帶現象，且檢測的靈敏度受到系統對血清干擾敏感性的限制。

蛋白質檢測的另一種方法是基于抗體-酶偶聯物復合物針對大的酶底物的空間阻斷潛力。這一點在β-半乳糖苷酶偶聯物上得到了很好的證明。β-半乳糖苷酶偶聯物通常不受抗體調節，即使當抗原很小時；然而，當底物鄰硝基苯-β-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-galactoside）連接到大的葡聚糖聚合物上時，小抗原和大抗原酶結合物的抗體誘導調節作用被觀測到（Gibbons等，1980）。該底物已應用于人IgG和CRP的EMIT檢測法中。使用葡聚糖連接的熒光底物，建立了競爭性鐵蛋白檢測法，其檢出限約為4pM（Armenta 等，1985）。遺憾的是，血清中偶有存在的低水平抗β-半乳糖苷酶抗體阻礙了該方法在高靈敏度血清檢測中的應用。

（二）電荷誘導的酶活化

酶活性免疫化學調節的另一種方法是在酶與免疫復合物結合時改變酶的微環境。一種免疫復合物高度帶電的CRP檢測法可作為例證，該檢測法又稱為電荷誘導的酶活化（charge-induced enzyme activation）。在該方法中，CRP與抗CRP抗體-β-半乳糖苷酶偶聯物結合時不會顯著影響酶活性；隨后加入過量的未結合的抗CRP抗體，會增加免疫復合物內的擁擠程度，并在使用大分子底物時降低酶活性；然而，如果未結合的抗體是琥珀酰化的，且大分子底物帶正電荷，則由于底物對免疫復合物的庫侖吸引作用，酶活性會增加（圖2-2-10）。基于這一原理的蛋白質抗原和抗體的酶激活免疫檢測法已經得到證實（Gibbons等，1981）。通過簡單地添加大量過量的琥珀酰化抗體就可以避免前帶現象。

盡管這種方法具有明顯的吸引力，但也存在一些缺陷。檢測混合物中濃度低至60fM的抗原可被檢出，但使用超過0.1%的血清便會影響定量。因此，其實際檢測限僅為60pM左右。此外，因為高靈敏度檢測法的響應曲線不是單調遞增的，所以雖然檢測法沒有前帶效應，但數據處理比較困難。

（三）酶連傳

酶連傳（enzyme channeling）提供了一種檢測免疫復合物中兩種酶接近度的方法。第一種酶可催化中間底物的形成，第二種酶再將中間底物轉化為可檢測的產物；當兩種酶在同一溶液中獨立分散時，產物的形成速度一開始較緩慢，但隨著中間底物濃度的增加而加快。當兩種酶在同一表面緊密結合時，這一動力學行為會發生變化；中間產物在第一種酶分子附近的局部濃度是由中間產物的生成速率和擴散速率決定的。局部穩態濃度迅速達到高于本體溶液中的濃度；第一種酶的幾個分子在一個表面局部化地增加了中間底物的形成速度，從而增加了它的局部濃度。當第二種酶與這個表面結合時，它會經歷一個相對恒定的中間體濃度升高，從而導致最終產物的生成速率線性增加。

均相酶連傳免疫測定法利用了這一現象（Litman等，1980），包括瓊脂糖顆粒、膠乳珠和微量測試孔的聚苯乙烯表面在內的各種表面均已被使用。一種酶用于標記抗體或抗原，另一種酶則過量結合于表面。通常，第一個酶附著在表面，因為這樣可以獲得了更多的線性動力學，盡管當酶的作用被逆轉時連傳也能發生。目前多種配對酶已被使用，包括堿性磷酸酶/β-半乳糖苷酶、己糖激酶/G6PDH和葡糖氧化酶（GO）/HRP。當天然底物不可用時，如堿性磷酸酶/β-半乳糖苷酶，可以制備允許順序反應發生的合成結構。

HIgG的競爭性檢測法可以使用標記有HIgG和GO的瓊脂糖顆粒來進行（圖2-2-11）。在與葡萄糖反應時，這些顆粒被過氧化氫所包圍；當過氧化氫擴散到本體溶液中時，其被稀釋，且濃度被反應混合物中的過氧化氫酶進一步降低；當HRP標記的抗HIgG抗體在ABTS（一種顯色性HRP底物）存在的情況下與顆粒結合時，顏色形成的速率幾乎是恒定的，且與HIgG的濃度成反比。

酶連傳最靈敏的應用避免使用預制表面，有利于膠體沉淀的原位形成。Ullman等人使用含有GO標記的抗PRP抗體（Ab-GO）、HRP標記的抗PRP抗體（Ab-HRP）和游離GO的試劑，對流感嗜血桿菌細胞壁成分聚核糖磷酸酯（polyribose phosphate，PRP）進行了檢測（Ullman 等，1984）。該試劑與添加有抗GO抗體的臨床樣本相結合產生Ab-GO：PRP：Ab-HRP夾心復合物，并與膠體GO：抗GO抗體免疫復合物（沉淀素）相結合（圖2-2-12）。葡萄糖、ABTS和過氧化氫酶的加入啟動了酶連傳反應；檢測反應幾乎是線性的，其檢測限約為10fM PRP，足以用于細菌性腦膜炎的腦脊液檢測。值得注意的是，盡管均相酶連傳免疫測定法靈敏度高和檢測方法簡便，但在這些初步的研究之后就很少受到關注。

八、酶效應物免疫測定法

均相免疫測定法可以不使用完整的酶，而使用可以與酶或酶片段結合并影響酶活性變化的催化惰性標簽，這種方法被稱為酶效應物免疫測定法（enzyme effector immunoassays）。已被研究的標簽包括酶底物、輔酶和抑制劑，以及酶片段。

（一）底物連接熒光免疫測定

底物標簽已被用于監測血清中藥物濃度相對較高的治療藥物水平。β-半乳糖苷酶傘形酮（β-galactosidylumbelliferone）與茶堿（theophylline）的結合并不影響其作為β-半乳糖苷酶的熒光底物。當抗茶堿抗體存在時，反應受到抑制，因為底物與抗體結合時，其在空間上不易與酶接近；如果茶堿存在，它會競爭抗體結合位點，熒光傘形酮產物的出現速率會增加。

底物連接熒光免疫測定（substrate-linked fluorescence immunoassay）方法的一個主要問題是必須使用低濃度的底物才能使分析物進入有效的競爭性結合。在低濃度時，酶的轉化速度較慢；在非常高的酶濃度下可以顯著提高其速率，但隨后成本就變得難以承受。此外，該方法不具有其他酶免疫檢測法所具有的信號放大的優點，即提供信號的分子數永遠不能大于被分析物的分子數。

克服這些限制的一種方法是使用一種能夠提供非常容易檢測到信號的底物，如ATP可以用作底物。ATP-抗原偶聯物與螢火蟲熒光素酶反應產生一種當抗體存在時會被抑制的化學發光信號。該方法已被應用于HIgG和2，4-二硝基苯丙氨酸（2，4-dinitrophenylalanine）的競爭性檢測（Carrico等，1976）。雖然這克服了靈敏度的一些限制，但由于化學發光反應對基質效應的敏感性，樣本與樣本間的變異大大抵消了靈敏度方面的理論增益。

（二）酶輔因子免疫測定

輔因子或其他輔基是刺激酶活性的更有吸引力的標簽，被應用于酶輔因子免疫測定（enzyme cofactor immunoassay）。與底物標簽不同，這些基團提供了信號放大的機會。最成功的例子是使用FAD-分析物偶聯物，它可以與無活性的脫輔基葡糖氧化酶（apo-glucose oxidase）形成復合物，產生有活性的GO；當這些偶聯物與抗分析物抗體結合時，絡合作用被空間抑制，酶不被激活。樣本中分析物的競爭作用增加了可用的偶聯物濃度，從而增加了酶的活性（圖2-2-13）。Miles Laboratories公司將該方法商業化用于蛋白質分析物，如甲狀腺結合球蛋白。試劑也被制備成干燥試劑條，用于一步測量血清中的藥物；被稱為ARIS?的脫輔酶再激活免疫檢測系統，條帶浸漬有干燥的FAD偶聯物、抗體、脫輔酶、葡萄糖和檢測過氧化氫的試劑，過氧化氫是酶反應的產物；當條帶與樣本接觸時，如抗體與被分析物結合而不是偶聯物結合，脫輔酶和FAD偶聯物的組裝會增強；形成的顏色的強度被用來確定苯妥英（phenytoin）和茶堿等藥物的濃度。這是一種該類型檢測的理想形式，因為它允許不穩定的脫輔酶以干燥的形式儲存。

（三）酶抑制劑免疫測定法

酶抑制劑可像輔酶一樣用作標簽（圖2-2-13）。酶抑制劑免疫測定法（enzyme inhibitor immunoassay）的關鍵是選擇合適的酶抑制劑。硫代乙氧基甲基膦酸酯（S-substituted ethoxymethylphosphonothioates）是乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase）的不可逆抑制劑；甲狀腺素（thyroxine）、茶堿等半抗原與硫結合不影響其抑制作用。然而，當偶聯物與抗半抗原抗體結合后，酶抑制率降低；游離半抗原競爭抗體結合位點，增加有效抑制劑的濃度，造成相應的抑制加速和酶活性下降；反應之后是二硫硝基苯甲酸與乙酰硫膽堿酶解后形成的硫膽堿反應產生的顏色形成的速率（Blecka等，1983）。通過使用茶堿和甲氨蝶呤（一種酶的可逆抑制劑）的偶聯物，二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase）也以類似的方式被用于茶堿的檢測（Place等，1983）。

膽堿酯酶抑制檢測主要由雅培（Abbott）公司銷售并在其雙色分析儀上進行，但該方法的適用范圍和局限性目前尚不明確。很明顯，足夠的靈敏度需要抑制劑與酶的結合作用非常強，且最好是不可逆的，同時需要一種靈敏的酶活性檢測手段。由于難以找到更好的抑制劑/酶組合，該方法的進一步研究可能受到阻礙。

（四）酶互補免疫測定

有些酶可以被分解成無酶活性的片段，只有當它們與原始全酶結合時才會變得有活性。來自于核糖核酸酶A（ribonuclease A）的無活性S蛋白與其20個氨基酸的N末端S肽互補，可使其酶活性恢復正常。甲狀腺素與S肽的偶聯可以在不阻斷與較大的S蛋白片段互補作用的情況下實現；然而，重新組裝的酶活性降低。抗甲狀腺素抗體與重新組裝酶的結合產生酶活性的恢復作用，這是均相免疫檢測的基礎（Gonnelli等，1981）。相反，當抗甲狀腺素抗體添加到游離的S肽偶聯物中時，互補作用被阻斷，酶活性受到抑制。該方法同樣可用于甲狀腺素的均相檢測（Farina 和Gohlke，1983）。前者是一種簡單的EMIT類型的檢測，其中抗體提供活性增強作用而不是抑制作用；后者是基于一個相關但不同的現象，概念上類似于酶輔因子免疫測定。在這兩種情況下，游離甲狀腺素對抗體的競爭導致酶活性的變化。

雖然核糖核酸酶沒有被證明是有吸引力的，可能是因為沒有高靈敏度的方法來檢測核糖核酸酶的活性，但使用另一種酶——β-半乳糖苷酶的酶互補免疫測定法（enzyme complementation immunoassay）已經被商業化，商品名為CEDIA?（cloned enzyme donor immunoassay，克隆酶供體免疫測定）。這種天然酶有4個相同的亞基，但對于必須組裝多少個亞基才能產生活性，目前還沒有達成共識。然而，人們很早就認識到，兩個共同組成一個亞基的多肽可以結合，具有幾乎完全恢復的酶活性，這一過程被稱為α-互補作用（Ullmann等，1967）。這些片段包括較小的“供體”肽和較大的“受體”蛋白；多個供體-受體對具有此屬性；每一對的成員一起包含了天然酶的整個氨基酸序列。在CEDIA中，供體多肽通常來自N端，受體缺失了包括供體一部分的氨基酸；供體經過修飾后可以在特定位點與抗原偶聯，并通過基因工程提供良好的酶活性恢復（Engel 和 Khanna，1992；Henderson等，1986）。

在CEDIA檢測法中，首先分析物和供體偶聯物競爭抗體結合位點，然后加入底物和過量的受體；分析物濃度越高，能夠結合該偶聯物的抗體就越少，產物的組裝速率和最終催化生成速率也越快（圖2-2-14）。CEDIA法已被應用于各種小分子以及一些蛋白質的檢測。與EMIT檢測一樣，CEDIA法需要大量的篩選來確定不僅具有所需的特異性和親和力，而且也能抑制互補作用的抗體。大分子抗原的供體偶聯物很難設計，因為龐大的取代基會干擾互補作用，但對供體進行基因工程改造的能力提供了比EMIT更大的靈活性。由于β-半乳糖苷酶的高轉化率和良好的檢測能力，這些檢測比EMIT提供了稍高一些的靈敏度，它們的主要缺點是需要重新構建相對不穩定的受體酶片段，而這些片段必須干燥保存，并且互補反應需要額外的時間。與EMIT一樣，構建實用的非競爭性夾心免疫檢測法的便捷方法尚未見報道。

基于β-半乳糖苷酶互補作用，目前Discoverx公司在出售對細胞內蛋白-蛋白結合進行定量的相關檢測方法（Wehrman等，2005）。與CEDIA的不同之處在于，蛋白質的結合將兩個酶片段結合在一起，并在酶活性出現的情況下啟動互補作用。其中一個片段以融合蛋白形式表達，定位于特定的亞細胞區域，如細胞膜或細胞核；另一個片段融合到正在進行易位和結合的蛋白上。該方法的成功關鍵在于選擇不影響易位和結合過程的酶片段。該方法通常用于通過測量藥物誘導的β-抑制蛋白（β-arrestin）與G蛋白偶聯受體（G-protein coupled receptors，GPCRs）結合的高通量篩選。該技術在體外蛋白免疫檢測法中的應用尚未展開研究。

九、鄰位誘導雜交

許多細胞過程的一個特點是通過兩個或兩個以上反應物在細胞間隔內結合位點的定位來實現化學反應。定位導致反應組分的有效濃度增加，從而產生更高的反應速率，增強結合事件。鄰位誘導雜交（proximity-induced hybridization），如上述連傳和電荷誘導酶免疫測定法一樣，都是基于這一原理。免疫復合物通常占0.01仄升量級的球形體積。在這個體積中，單個自由擴散分子的有效濃度約為200mM。因此，附著在復合物不同成員上的寡核苷酸之間的速率和復合物內的平衡可以提高許多數量級。基于這一原則的兩項應用已受到關注。

（一）鄰位連接免疫測定

鄰位連接測定法（proximity ligation assays，PLAs），又稱鄰位連接免疫測定（proximity ligation immunoassay），使用兩到三種“鄰近探針”，每一種探針都能被整合到一個包含分析物的復合物中，每個探針都包含不同的寡核苷酸。PLA最簡單的配置之一是使用兩種標記的多克隆或單克隆抗體制劑的免疫檢測（Gullberg等，2004）。第一步，將標記抗體的混合物與樣本混合，然后形成包括兩種寡核苷酸的免疫復合物。第二步，加入包括連接酶和連接模板寡核苷酸的試劑組合，該模板與免疫復合物中的兩個鄰近的寡核苷酸結合，從而使它們能夠相互連接。免疫復合物外探針序列濃度較低，因而大大降低了非特異性連接的速度；PCR所需的所有元素也包括在組合試劑中。第三步，只需要通過熱循環對連接探針進行PCR擴增，不需要對反應混合物進行額外處理。使用這種方法，在低至1μL的樣本中可檢測低fM濃度的IL2、IL4和VEGF（Gullberg等，2004）。

該方法的一個改良（稱為3PLA），使用了3個鄰近探針（Schallmeiner等，2007）。探針可以是任何結合物質，如抗體、適配體、寡核苷酸等。結合物質可以直接作用于同一分子上的不同位點，或者使用直接作用于復合物中不同分子的結合劑來檢測分子復合物。在3PLA中，兩個鄰近探針用上述不同的寡核苷酸進行標記，第三個鄰近探針用上述模板寡核苷酸進行標記。由于這三種寡核苷酸必須非常接近才能發生連接，因此該方法有望具有更高的特異性，并且應該能夠耐受更高濃度的未結合抗體，而不會發生不適當的非特異性連接。此外，該方法還提供了一種提高靈敏度的方法，通過包括只有在靠近模板時才能被置換的互補寡核苷酸，來保護寡核苷酸不受非特異性連接的影響（圖2-2-15）。該方法已被證明在1μL（約200aM）中可檢測低至100個分子的VEGF、PSA和肌鈣蛋白。雖然與其他非常高靈敏度的均相免疫測定法，如發光氧連傳免疫測定（LOCI）相比，PLA更耗時，但它很可能成為研究單細胞水平或接近單細胞水平的分子相互作用的有力工具。

（二）鄰位雜交免疫測定

在均相檢測中，鄰位誘導雜交的一個相關方法是使用FRET檢測（Heyduk等，2008）。與PLA類似，在夾心免疫測定中使用了兩種不同寡核苷酸標記的抗體制劑。在該方法中，寡核苷酸分別用一個FRET受體（如Cy5）和一個FRET供體（如熒光素或銪螯合物）標記。寡核苷酸具有短的（6-7bp）互補部分，這樣設計的目的是使與游離抗體結合的探針雜交最小化，而不干擾免疫復合物內的雜交。該方法稱為鄰位雜交免疫測定（proximity hybridization immunoassay），是一種很有吸引力的替代FRET免疫檢測法的方法，FRET免疫檢測法使用多種染料標記的抗體，其中一些抗體距離太遠，無法實現有效的能量轉移。復合物內寡核苷酸結合也有望通過穩定三分子夾心復合物而提高靈敏度。肌鈣蛋白和CRP的模型檢測法已經進行了研究，得到的肌鈣蛋白檢測限約為30pM。

十、同位素標簽

閃爍親近測定

同位素標簽（isotopic labels）的一個優點是可以構建與自由配體在化學上完全相同的標記配體。這對于配體的化學標記可能干擾與天然受體結合的檢測具有特別的價值。然而，這種優勢必須與放射性同位素的生物危害、穩定性和處理問題，以及標準放射結合檢測法的分離和清洗步驟的不便進行權衡。

閃爍親近測定法（scintillation proximity assay）（SPAs）是一種避免分離和清洗的放射性同位素檢測法。SPA需要一種可以發射出只在濃縮介質中短距離傳播的α或弱β粒子的放射標簽。受體或抗體與熒光基團溶解的聚合物表面（如膠乳珠）結合。如果放射標記與表面結合，標記的輻射就會穿過聚合物并產生光脈沖，這些光脈沖可以通過閃爍計數檢測到。大多數未結合的標記距離太遠，輻射無法到達活動表面（圖2-2-16）。除了熒光膠乳珠，熒光孔也可以被使用，抗體或受體可與孔表面結合。無論哪種形式，只需要將標記的抗原和樣品與包被了抗體的表面一起孵育，然后測量光發射（Hart和Greenwald，1979）。

Perkin Elmer公司銷售SPA試劑可用于高通量藥物篩選。在這一應用中，除了使用抗體外，還使用天然受體，可以進行競爭性和夾心法免疫檢測。抗體、抗原或受體可攜帶放射性標記。

SPA的一個重要的考慮因素是標簽的選擇。每一分解事件產生的光最多的是α粒子，它們有很高的能量和很短的電離軌道，電子密度很高。此外，短路徑長度提供了結合和非結合標簽之間的最佳區分。然而，與α發射相關的高能量使它們在被攝入時特別危險，不能作為常規標簽使用。弱β粒子也有較短的路徑長度，但每次衰變事件產生的發射較弱。β衰變同位素如3H、33P、35S和125I，每一種都發出能量低于300keV的β粒子，是最實用的（Udenfriend等，1987）。

十一、電活性標簽

使用電活性標簽（electroactive labels）的均相免疫檢測有以下幾種：

（一）安培檢測

二茂鐵（ferrocene）在不影響大多數血清成分的電壓下易于被氧化（340mV與飽和甘汞電極（SCE））。由于電子轉移到電極上需要非常近的距離，所以電流隨著二茂鐵體積的增大而減小；利用該原理設計了均相電化學免疫檢測法，稱為安培檢測（amperometric detection）。二茂鐵與甲狀腺素等半抗原偶聯，偶聯物的電解氧化是在一種電化學惰性試劑的存在下進行的，這種惰性試劑旨在快速地將二茂鐵離子還原回中性標簽。葡萄糖和GO可用于此目的。當甲狀腺素抗體存在時，由于偶聯物與電極的可及性降低，電流降低（圖2-2-17）。游離甲狀腺素與抗體競爭，導致電流增加（Robinson等，1986）。

（二）電化學發光

電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）的測量使高靈敏度的免疫檢測法的發展成為可能。該方法最初是通過使用一個在電極上可以被氧化的芘標簽，然后通過循環伏安法快速還原來得以證明；在適當的電壓下，后一過程充分放熱，使芘最終處于激發態，隨后發射光子。與安培檢測一樣，當標簽與體積較大的復合物相關聯時，這個過程會受到阻礙。因此，抗白蛋白抗體的結合減少了芘標記的白蛋白的發射，而游離白蛋白的競爭性結合導致信號的恢復（Ikariyama等，1985）。

使用強熒光釕（Ⅱ）螯合物代替芘可大幅提高靈敏度（Blackburn 等，1991）。與芘一樣，釕在電極上被氧化，但在反應混合物中加入三丙胺后，在不改變電極極性的情況下被還原。胺的電化學氧化與釕氧化同時發生，生成的自由基陽離子經過去質子化形成胺自由基；這種物質本身就是一種強還原劑，能把一個電子轉移回釕。該過程充分放熱，使釕處于電子激發態，隨后發射光子（圖2-2-18）。

免疫檢測法是通過使釕標簽與懸浮珠子上的抗體結合來進行的。根據檢測法是競爭性的還是夾心（免疫測定法）免疫檢測，確定標記分析物類似物還是第二抗體。這些珠子可以減少釕對電極的可及性。在競爭性檢測中，標記的抗原被抑制與珠子結合，因此信號隨抗原濃度的增加而增加；在夾心法檢測中，標記的抗體會隨著抗原濃度的增加而與珠子結合，導致信號下降。

一些用于逆轉珠子保護作用的方法也被研究，以便當標簽結合到珠子上時信號會增加。這是通過使用磁珠來實現的，磁珠被集中在電極，在讀取之前進行清洗。該非均相方案提供了更高的靈敏度，且該方法被擴展到非常低濃度的分析物，如血清TSH。這種類型的ECL檢測已被設計用于許多臨床上重要的分析物，并被用于羅氏（Roche）公司的Elecsys?免疫檢測系統。

十二、氧通道免疫檢測法

發光氧通道免疫檢測

為了在均相免疫檢測中獲得超高靈敏度而不需要耗時的擴增步驟，必須確定標簽不僅可以在非常低的濃度下檢測到，而且能夠產生可以調節的信號。除了只提供中等靈敏度的同位素標簽外，所有可調節的標簽都在一定程度上受到樣本基質的影響。高量子產率的熒光化合物具有高消光系數，光散射金屬納米顆粒與單分子檢測技術具有良好的靈敏度，但微弱的信號可以被來自大量樣品的本底發射所掩蓋。化學發光檢測對單分子檢測的靈敏度本來就低得多，因為每個分子最多只能產生一個光子。但是，化學發光本底在大多數類型的樣本中是不可測量的，因此化學發光標簽是測量非常低濃度的最佳選擇，這有別于非常低的絕對數量。不幸的是，化學發光反應對介質效應的高度敏感性阻礙了許多設計實用的均相化學發光免疫檢測法的嘗試。

發光氧通道免疫檢測法（luminescent oxygenchanneling immunoassay，LOCI）是目前唯一一種能夠充分利用化學發光精細靈敏度優勢的均相免疫檢測法（Ullman等，1996年）。該方法是通過在膠乳珠內部誘導化學發光反應來實現的，此時它是完全從樣本基質中分離出來的。該方法使用兩種類型的配體或受體包被的膠乳珠，它們足夠小（約250nm）且不會從水懸浮液中沉淀出來。其中一種珠子是化學發光劑珠子，其中溶解的烯烴能與單線態氧（1Δ_gO₂）迅速反應，產生一個電子激發產物；該反應生成一種能在約1s內自發分解的二氧雜環丁烷，并能有效發光；另一種珠子含有一種溶解的感光劑，如酞菁（phthalocyanine），它能使氧分子在光照下處于單線態；感光劑也被從與樣品的接觸中物理分離，從而與非特異性的介質效應絕緣。

LOCI檢測與酶連傳免疫檢測法類似（圖2-2-19）。感光劑珠子被波長足夠長的光激發，化學發光劑很少被激發。珠內形成的單線態氧擴散到水溶液中；因為它在水中只有4μs的壽命，因此它只存在于每一個最鄰近的感光劑珠子上，約300nm以外珠子表面幾乎檢測不到。當化學發光劑珠子與感光劑珠子結合時，暴露在單線態氧中，單線態氧擴散到珠子中，引發化學發光反應；未結合的珠子由于太偏遠而不會受到影響。雖然每個結合事件產生的光子數變化小于FRET免疫檢測法，但該方法每個結合事件產生的光子數比標準的化學發光檢測法多104個以上，后者每個結合事件產生的光子數少于一個。

任何一種特定的檢測模式所需的結合試劑都可以結合到珠子表面，前提是反應導致兩種類型珠子之間依賴分析物的結合。結合反應后，用680nm激光照射珠子懸浮液，持續多個0.1～1s的周期，在550～650nm處產生較短波長的化學發光發射，在相同的時間周期內被積分；只需要一個裝有激光和機械快門的光度計即可。由于信號強度很少受到限制，因而在結合平衡建立之前就可以進行測量。因此，信號是在特定時期內形成的珠子對數量的度量。

該方法的檢測靈敏度至少等于且常常優于最敏感的非均相免疫檢測法。在一種TSH夾心免疫檢測中，在每一個珠子上使用不同的抗TSH抗體，低至120 000個分子（在最終900μL檢測溶液中230aM，或50μL血清樣本中4.1fM）能被檢測到，總孵育時間為14min。適用于pM濃度水平的藥物（如地高辛）的競爭性檢測可以在1min內完成。

夾心免疫檢測的方案已經被開發出來，它可以減少孵育時間并限制化學發光烯烴的長波長激發所產生的非常微弱的本底化學發光。在一個典型的夾心檢測中，首先將樣本與包被有抗體的化學發光劑珠子和針對不同抗原表位的過量生物素化抗體混合孵育；將珠子的濃度保持在低水平以減少本底，但由于每個珠子有1 000個或更多的抗體結合位點，因此可以獲得中等濃度的抗體。這使得夾心結構的有效形成不依賴于緩慢的珠子間結合。在較短的孵育期后，添加包被有鏈霉抗生物素蛋白的珠子，并與結合于化學發光劑珠子的生物素的數量成比例；大量過量的感光劑珠子可以用來加速珠子間的結合，因為其對本底沒有貢獻。在第二個較短的孵育期后測量化學發光發射。利用這些條件，可得到分析物濃度超過5個數量級的檢測范圍。該方法在藥物、蛋白質、抗體、細胞表面抗原、受體和核酸的檢測中都已被證實。

樣本基質對LOCI信號的影響不大。單線態氧在珠子之間的傳輸過程中，原則上可以被樣本組分截留，但單線態氧的壽命太短，只能被反應性強、濃度高的化合物所捕獲。蛋白質是血清中單線態氧的主要淬滅劑（Wagner等，1993）。這對樣本間變異的影響很小，通常使用終濃度不超過10%的血清或血漿來避免這一問題；對于尿液，一個更嚴重的問題是大劑量維生素C治療后尿液中抗壞血酸鹽濃度高，需要相對較高的最終稀釋步驟（尿液＜1%）或加入氧化劑來解決。該方法已在西門子（Siemens）公司的Dimension Vista?分析儀和珀金埃爾默（Perkin Elmer）公司的用于藥物發現的高通量AlphaScreen?和Aphalisa?上商業化使用。

十三、小結

盡管與一些非均相檢測法相比，均相檢測法的靈敏度有限，但由于其自動化的要求較低，且有機會使用常見的實驗室儀器手動進行檢測，因此較老的均相免疫檢測法（如EMIT、CEDIA、FRET和膠乳凝集法）已得到廣泛應用。在過去的十年中，人們開發出了新的方法來實現更高的靈敏度和降低對基質效應的敏感性。最近發展的ECL、磁聚集、LOCI和PLA免疫檢測法在不同程度上保留了早期方法的簡單性。這些方法受樣本基質的影響很小，并且可以在非常小的樣本體積下進行。近年來，針對LOCI的通用均相免疫檢測試劑的商業化應用，可能會加速傳統的非均相免疫檢測法（如RIA和ELISA）在商業化應用和基礎研究中的替代。

均相方法的一個重要的、與非均相方法相比不甚理想的特性就是其有限的多路復用能力。考慮到人們對開發新均相方法的濃厚興趣，這一限制很可能很快就會被克服。多路復用的一種有效方法是基于測量熒光配體與包被不同捕獲抗原或抗體的珠子的結合；每個捕獲配體都由與其珠子相關聯的獨特熒光標記編碼；熒光標記與特定配體的結合可以通過流式細胞術來確定（Lima和Zhang，2007）。可以說，這是一種均相的方法，盡管經常使用分離步驟，而且儀器很復雜。通過用均相波動分析代替流式細胞術，單個編碼的珠子原則上可以用一種簡單得多的方法在本體懸浮液中進行分析。此外，量子點和金屬納米顆粒作為標識碼的使用，為提高靈敏度提供了機會；進一步利用光散射和擴散速率作為附加編碼參數，我們可以有理由地預計，未來高靈敏度的均相方法的發展可以與大規模非均相方法的多路復用水平相媲美。

十四、參考文獻

（關秀茹、劉彥虹　譯，何建文　審）