第四節(jié) 游離分析物免疫檢測(cè)

游離激素假說最初由Robbins和Rall在20世紀(jì)50年代末期提出。游離激素假說認(rèn)為，有些激素在體內(nèi)同時(shí)存在結(jié)合形式以及游離形式，但是僅游離激素決定著激素在體內(nèi)的活性。甲狀腺激素（甲狀腺素，即T₄和3，3′5-三碘甲腺原氨酸，即T₃）和一些類固醇激素（如睪酮）廣泛適用于這一假說。這一假說也適用于其他分析物，如維生素和藥物，但受限于缺乏測(cè)量游離維生素和藥物的準(zhǔn)確方法，故鮮有證據(jù)表明此類分析物的游離態(tài)濃度而非其總濃度與之生物活性有更密切的關(guān)系。游離分析物（如游離甲狀腺素，F(xiàn)T₄）測(cè)量方法的開發(fā)始于20世紀(jì)70年代，主要基于Ekins及其同事的開創(chuàng)性工作（如Ekins&Ellis，1975；Ekins等，1980）。在過去的20年中，大量的方法被開發(fā)出來，而其中許多方法最近已經(jīng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化（例如，見第七部分第二節(jié)“甲狀腺”或Demers，1999），這就增強(qiáng)了這類方法在臨床實(shí)踐中應(yīng)用的吸引力。由于關(guān)于某些商業(yè)方法的準(zhǔn)確性和有效性仍存在爭論，因此目前歐洲大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量的是FT₄而非總T₄（TT₄），而美國FT₄測(cè)量在甲狀腺檢測(cè)中所占的比例低于歐洲。

本節(jié)的主要目的是介紹血清中游離分析物濃度計(jì)算的基本機(jī)制，以及這些機(jī)制如何應(yīng)用于開發(fā)有效的游離激素測(cè)定方法。此外，本節(jié)將描述可有效測(cè)量游離分析物的簡單實(shí)驗(yàn)方法。

一、控制游離激素濃度的基本原理

某些激素（如甲狀腺激素和類固醇激素）在內(nèi)源性釋放進(jìn)入血液循環(huán)后與運(yùn)輸?shù)鞍祝╰ransport proteins）結(jié)合。同樣，一些藥物和維生素在外源性給藥后也會(huì)形成結(jié)合蛋白-分析物復(fù)合物，并保留一小部分藥物或維生素處于非結(jié)合態(tài)。分析物與血清蛋白的結(jié)合是可逆的，在達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，分析物與血清蛋白的解離速率等于其結(jié)合速率。血清蛋白結(jié)合的分析物比例取決于每種結(jié)合蛋白的相對(duì)親和力和蛋白質(zhì)濃度。現(xiàn)在普遍認(rèn)為（至少針對(duì)甲狀腺激素和類固醇激素是如此）游離分析物，而非其與血清蛋白結(jié)合的部分，是與受體結(jié)合并發(fā)揮生物活性的部分。這并不意味著激素-結(jié)合蛋白復(fù)合物沒有功能，復(fù)合物的主要作用是通過激素與蛋白質(zhì)結(jié)合的平衡而保證器官組織激素的供應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定。因此，當(dāng)游離激素被組織吸收時(shí)，通過復(fù)合物的解離可獲得足夠的游離激素，以確保向組織提供近乎恒定的游離激素。激素-蛋白質(zhì)復(fù)合物的這一特性（即激素與蛋白質(zhì)的分離，同時(shí)保持接近恒定的游離激素濃度）已被用于開發(fā)測(cè)量游離激素濃度的方法。

由于游離甲狀腺素（FT₄）是被研究最廣泛的激素，因此在本節(jié)的其余部分中，F(xiàn)T₄被用作一個(gè)典型案例來說明游離分析物濃度計(jì)算和其測(cè)量方法開發(fā)中所涉及的原理。本節(jié)所討論的原理適用于所有游離分析物的測(cè)量。

二、游離分析物濃度的計(jì)算

以T₄為例，隨著T₄從甲狀腺釋放到血液循環(huán)中，它會(huì)與三種不同的蛋白質(zhì)結(jié)合，包括甲狀腺素結(jié)合球蛋白（TBG）、人血清白蛋白（HSA）和甲狀腺素視黃質(zhì)運(yùn)載蛋白（transthyretin，TTR）。正常個(gè)體總甲狀腺素和結(jié)合蛋白的典型濃度以及結(jié)合蛋白（與T₄）的平衡常數(shù)（K_eq）如下所示。

TT₄濃度=1×10-7mol/L；

TBG濃度=3.57×10-7mol/L，

K_eq=2.2×1010L/M；

HSA濃度=6.18×10-4mol/L，

K_eq=1.3×106L/M；

TTR濃度=5.56×10-6mol/L，

K_eq=3.9×107L/M。

T₄與蛋白質(zhì)結(jié)合的比例取決于每種蛋白質(zhì)的相對(duì)結(jié)合能力（relative binding capacity），即親和力（K_eq或K）乘以濃度。因此，在平衡時(shí)，

游離T₄的濃度是由結(jié)合的T₄與蛋白質(zhì)未結(jié)合位點(diǎn)之間的平衡所控制的。FT₄的濃度可以通過質(zhì)量作用定律（law of mass action）計(jì)算。如下所示：

式中P_BT4代表蛋白質(zhì)結(jié)合的T₄的濃度；K代表蛋白質(zhì)針對(duì)T₄的凈親和力；［P_free］代表蛋白質(zhì)上未結(jié)合位點(diǎn)的濃度。

基于上述方程、分析物總濃度以及結(jié)合蛋白和T₄間親和力，可以很容易地預(yù)測(cè)體內(nèi)血清FT₄濃度。在下文中，體內(nèi)血清FT₄濃度計(jì)算中的相關(guān)數(shù)據(jù)被歸納為一張表格。該表格也可以擴(kuò)展到免疫檢測(cè)試劑（如抗體和其他化學(xué)物質(zhì)）中，因此可以用來預(yù)測(cè)這些試劑在使用時(shí)對(duì)血清FT₄濃度的影響。

三、游離分析物濃度計(jì)算的電子表格

游離分析物的濃度可以通過電子表格計(jì)算得出。仍然以FT₄為例進(jìn)行說明，相關(guān)程序可由作者提供。該程序能夠被用于計(jì)算體內(nèi)或體外（如通過免疫檢測(cè)）的FT₄濃度。

表2-4-1顯示了體外FT₄濃度的計(jì)算推導(dǎo)過程，表2-4-2以一組數(shù)據(jù)為例展示了計(jì)算的結(jié)果。體內(nèi)FT₄濃度可以用相同程序進(jìn)行計(jì)算，但需去除公式中試劑相關(guān)部分（即輸入“0”作為試劑的濃度和體積）。

計(jì)算步驟簡要概述如下：

在C列（單元格4～6）中輸入血清、抗體和其他試劑的體積，在單元格C7中通過加和得到總反應(yīng)體積。通過總反應(yīng)體積除以血清體積（即C7/C4）可獲得稀釋系數(shù)。如果需要計(jì)算體內(nèi)FT₄濃度，則在抗體體積（單元格C5）和其他試劑（單元格C6）中輸入0。

（1）在C列（單元格C13～C16）中輸入血清中結(jié)合蛋白（TBG、HSA和TTR）、TT₄的濃度以及免疫檢測(cè)中使用的抗體的濃度（以g/L表示）。如果免疫檢測(cè)試劑中引入其他結(jié)合蛋白（如牛血清白蛋白，BSA），則在C20中輸入其濃度。

（2）在D列中，輸入結(jié)合蛋白和TT₄的相對(duì)分子質(zhì)量。

（3）在E列中，通過將C列輸入的質(zhì)量濃度除以D列的相對(duì)分子質(zhì)量來計(jì)算結(jié)合蛋白的摩爾濃度。

（4）在F列中，計(jì)算出免疫檢測(cè)“管”中結(jié)合蛋白和TT₄的摩爾濃度。

（5）在G列中，輸入單個(gè)結(jié)合蛋白（包括模擬免疫檢測(cè)性能相關(guān)程序中的抗體）的親和常數(shù)。

（6）在H列中，通過G列乘以F列計(jì)算出親和力（即K ［P_total］）。

（7）在單元格H25中，計(jì)算出H列總和。

（8）在I列中，通過將F列與H列/單元格H25的結(jié)果相乘獲得每個(gè)蛋白結(jié)合的T₄的濃度。

（9）在單元格H26中，通過單元格F16（TT₄濃度）減去F16/H25得到總蛋白結(jié)合的T₄（PBT₄）濃度。

（10）在J列中，通過F列減去I列獲得每種蛋白質(zhì)上未結(jié)合位點(diǎn)的濃度。

（11）在K列中，通過G列與J列相乘，得出產(chǎn)品K ［P_free］。

（12）在單元格H27，計(jì)算K列之和。

（13）在單元格H28，通過H26除以H27，得出FT₄濃度。

（14）在L列中，通過H列除以H25可獲得每個(gè)蛋白質(zhì)攜帶的T₄比例。

（15）在M19單元格中，通過將J19除以F19可估算出未結(jié)合的抗體比例。

上述電子表格基于結(jié)合蛋白僅與一種底物（本例中為T₄）結(jié)合而進(jìn)行計(jì)算，其可以擴(kuò)展至其他底物同時(shí)競(jìng)爭結(jié)合蛋白的情況（如T₃）。后面章節(jié)中的模擬計(jì)算仍然采用上述表格，在FT₄的例子中，T₃的貢獻(xiàn)未對(duì)FT₄分析結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。然而，當(dāng)血清中存在大量的結(jié)合抑制劑（如非酯化脂肪酸）時(shí)，采用上述計(jì)算表格將嚴(yán)重低估FT₄的濃度。此外，本程序假設(shè)T₄與相關(guān)結(jié)合蛋白之間已達(dá)到完全平衡，但這種情況在某些免疫檢測(cè)方法中可能并非如此。因此，建議以定性角度（如確定激素濃度將上升或下降）對(duì)待上述計(jì)算結(jié)果。

可以通過輸入相關(guān)親和力和結(jié)合蛋白濃度（以及總分析物濃度）等數(shù)據(jù)構(gòu)建為其他游離分析物（如FT₃、皮質(zhì)醇、睪酮等）來構(gòu)建類似的程序。然而需要注意的是，以FT₃為例，由于蛋白質(zhì)對(duì)T₄的親和力遠(yuǎn)強(qiáng)于T₃，計(jì)算FT₃濃度時(shí)T₄將具備顯著貢獻(xiàn)，因此需要構(gòu)建一個(gè)更加復(fù)雜的計(jì)算程序。

四、血清蛋白質(zhì)對(duì)游離分析物濃度的影響

與前文相同，游離甲狀腺素仍然作為示例分析物。

使用電子表格程序，可以模擬預(yù)測(cè)任何情況下的FT₄濃度，如當(dāng)某種結(jié)合蛋白質(zhì)濃度和親和力（K ［P_total］）發(fā)生變化或TT₄濃度改變時(shí)的情況。

圖2-4-1顯示了改變內(nèi)源性蛋白質(zhì)濃度（同時(shí)保持TT₄濃度恒定）對(duì)FT₄的影響。

在本例中，單個(gè)蛋白質(zhì)（TBG、HSA和TTR）的濃度發(fā)生變化（從正常濃度的1/4變?yōu)檎舛鹊?倍），而TT₄的濃度保持在100nmol/L（甲狀腺功能正常濃度）。從圖2-4-1中可以清楚地看出，蛋白質(zhì)濃度的升高將導(dǎo)致FT₄濃度的降低，而蛋白質(zhì)濃度的降低將導(dǎo)致FT₄濃度的升高。同時(shí)，圖2-4-1也表明FT₄濃度主要受TBG濃度（親和力）的影響（控制），而不是其他兩種結(jié)合蛋白。這也是T₄/TBG比值被用于“間接”度量FT₄濃度的原因。

然而，由于T₄/TBG的計(jì)算使用的是總TBG濃度而非未結(jié)合位點(diǎn)的濃度，其結(jié)果與FT₄真實(shí)濃度仍然存在差異。圖2-4-2展示了預(yù)測(cè)的FT₄濃度（使用電子表格程序）和FT₄“指數(shù)”的差異，相關(guān)數(shù)據(jù)通過向甲狀腺功能亢進(jìn)患者血清中添加不同濃度的T₄（并以“FT₄單位”校準(zhǔn)）計(jì)算得出。

結(jié)果表明，T₄/TBG比值與TT₄濃度呈線性關(guān)系，而FT₄與TT₄濃度呈曲線關(guān)系。在高TT₄濃度（當(dāng)TBG上的未占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)濃度降低時(shí)）下，T₄/TBG比值出現(xiàn)負(fù)偏倚（與FT₄相比），而在低TT₄濃度（當(dāng)TBG上的未占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)濃度增加時(shí)）下，T₄/TBG呈正偏倚。這一情況在圖2-4-3中也進(jìn)行了說明（作為偏倚圖）。可以預(yù)測(cè)，在TBG對(duì)T₄親和力降低或血清中含有可與TBG結(jié)合的物質(zhì)時(shí)（從而降低未占據(jù)位點(diǎn)濃度），也會(huì)得到有偏倚的T₄/TBG結(jié)果。如果不考慮結(jié)合位點(diǎn)的減少，電子表格程序估算出的FT₄濃度也將呈現(xiàn)上述規(guī)律。

電子表格的計(jì)算有助于理解在某些臨床條件下可能影響FT₄濃度的機(jī)制。例如，重癥患者的FT₄濃度通常比門診患者的FT₄濃度高約30%，而這些重癥患者中相應(yīng)的TT₄濃度卻比門診患者低約50%。為了解釋TT₄和FT₄之間的不一致性，一些假設(shè)被提出，其中包括：

● 患者血清中含有與白蛋白結(jié)合的物質(zhì)，降低了未被占用的T₄結(jié)合位點(diǎn)的濃度；

● 白蛋白濃度降低；

● 白蛋白對(duì)T₄結(jié)合親和力降低；

● TBG對(duì)T₄結(jié)合親和力降低或TBG濃度降低。

利用電子表格中的公式，人們可以通過計(jì)算不同條件下FT₄的濃度來挑戰(zhàn)上述假設(shè)，并確定TT₄/FT₄不一致的最有可能原因。結(jié)果表明，無論HSA和TTR的親和力以及濃度降低到何種程度，低TT₄濃度（比正常濃度低50%）都不會(huì)引起FT₄濃度的升高。然而，如果TBG的濃度或者親和力降低75%～80%（或當(dāng)濃度和親和力降低50%時(shí)），將導(dǎo)致FT₄濃度上升30%。由此可見，患病人群中FT₄/TT₄的比例特征很可能由于TBG的濃度或親和力降低而形成。而事實(shí)上，上述兩種可能性在非甲狀腺疾病（non-thyroidal illness，NTI）患者中均有發(fā)生（Csako et al.，1989；Wilcox et al.，1994）。

五、游離分析物濃度的體外測(cè)量

有許多不同的方法可用于量化生物體液中的游離分析物濃度。所有的方法都涉及“取樣”，即從血清樣本中獲取一些游離分析物，然后定量分析待測(cè)組分的含量。無論采用何種方法，取樣均要求獲取的游離組分能夠反映出其在體內(nèi)的游離分析物濃度。本小節(jié)將審視不同取樣方法是否滿足上述要求。

（一）直接平衡透析

直接平衡透析（equilibrium dialysis，ED）是許多研究者認(rèn)為的一種測(cè)量游離激素的參考方法。圖2-4-4解釋了本方法的基本原理。

ED腔體由兩個(gè)腔組成，兩個(gè)腔之間用半透膜隔開。半透膜允許小分子自由地從一個(gè)腔擴(kuò)散到另一個(gè)腔，但大分子（如蛋白質(zhì)）無法透過。進(jìn)行透析處理時(shí)，血清樣本和緩沖液被分別放在兩個(gè)腔中。在孵育過程中，T₄和其他小分子從一個(gè)腔擴(kuò)散到另一個(gè)腔。達(dá)到平衡時(shí)（通常在16h），兩個(gè)腔之間FT₄以及其他小分子的濃度相等。然而，如圖2-4-4所示，盡管FT₄在兩腔中濃度（每毫升）是相似的，但存在于緩沖液腔中的FT₄分子的數(shù)量比在血清腔中的分子數(shù)量要多得多。FT₄分子的數(shù)量取決于兩個(gè)腔液體的體積比。例如，在圖2-4-4中，200μL血清與2.4mL緩沖液平衡，因此緩沖液腔中FT₄分子的數(shù)量是血清腔的12倍。這種“額外”的FT₄來源于結(jié)合蛋白，即通常與血清蛋白結(jié)合的T₄解離并擴(kuò)散到緩沖液腔。

FT₄測(cè)定時(shí)的一個(gè)關(guān)鍵要求是采樣所獲取的FT₄（或在ED中，從血清腔擴(kuò)散至緩沖液腔中的T₄量）不會(huì)改變體內(nèi)FT₄的真實(shí)濃度，即在緩沖液腔中測(cè)量的FT₄濃度應(yīng)與其在未透析血清中的濃度保持一致。直接ED方法能否滿足上述要求，取決于以下因素：

● 透析緩沖液的緩沖液組成和pH（其影響結(jié)合蛋白的親和力）；

● 透析過程環(huán)境溫度（蛋白質(zhì)的親和力與溫度相關(guān)）；

● T₄非特異性結(jié)合（nonspecific binding，NSB）的強(qiáng)度（增加NSB會(huì)導(dǎo)致T₄進(jìn)一步從結(jié)合蛋白上解離）；

● 膜的性質(zhì)（即應(yīng)該僅允許小分子透過）；

● 緩沖液體積與血清體積的比例。

這些因素是非常重要的，因?yàn)樗鼈儗Q定從緩沖蛋白中解離出的T₄的濃度，從而決定待測(cè)的FT₄濃度。

最近一種基于直接ED和ID-MS的參考方法被提出（Thienpont et al.，2010），該方法被NCCLS批準(zhǔn)的指南文件C-45A所推薦。

1.降低的蛋白結(jié)合的T₄濃度對(duì)FT₄濃度的影響

去除掉增量T₄后的FT₄濃度可以通過電子表格進(jìn)行估算（圖2-4-5）。當(dāng)從甲狀腺功能亢進(jìn)血清中去除T₄的量逐漸增多時(shí)，血清中FT₄濃度逐漸降低。但是，F(xiàn)T₄濃度的大幅降低僅發(fā)生在非常大量地去除血清中T₄之后。例如，解離（去除）1 000pmol/L的TT₄僅會(huì)使FT₄濃度降低小于2%（或＜0.2pmol/L）。

2.血清稀釋

上述例子考慮了FT₄從血清腔通過透析膜擴(kuò)散至緩沖液腔的情況。在理想情況下，如果將血清用惰性緩沖液稀釋也會(huì)觀察到T₄與其結(jié)合蛋白解離并使FT₄濃度保持近似恒定。就機(jī)制而言，上述現(xiàn)象與透析的存在與否并無關(guān)系。圖2-4-6展示了三種不同血清用相同一種惰性溶液（如 10mmol/L HEPES緩沖液，pH7.4）稀釋后計(jì)算（使用電子表格程序）出的FT₄濃度。其中一份血清具備正常的T₄結(jié)合能力，另兩份血清的T₄結(jié)合能力分別比正常血清高4倍和低4倍（結(jié)合能力由結(jié)合蛋白親和力乘以結(jié)合蛋白的濃度得到）。結(jié)果表明，在正常血清和高結(jié)合能力血清中，僅當(dāng)稀釋倍數(shù)高于1 000時(shí)才會(huì)使FT₄濃度顯著降低（超過10%）。然而，在低結(jié)合能力血清中，稀釋窗口降低，因此比正常血清更易引起FT₄濃度的顯著下降。這些數(shù)據(jù)表明，為了在低結(jié)合力血清中獲得正確的FT₄濃度結(jié)果，檢測(cè)中應(yīng)用的稀釋倍數(shù)應(yīng)保持在最低水平（其同樣適用于其他游離激素檢測(cè)方法）。在檢測(cè)中若進(jìn)行高倍血清稀釋將會(huì)使這些患者產(chǎn)生負(fù)偏倚結(jié)果。

（二）游離分析物免疫檢測(cè)

在所有FT₄（以及其他游離分析物）的免疫檢測(cè)中，無論采用何種檢測(cè)形式，均具備許多通用步驟：血清稀釋步驟；抗體添加步驟；對(duì)抗體上未結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定量分析。

但是，這些檢測(cè)方法在形式（對(duì)抗體上未結(jié)合位點(diǎn)的定量分析方法）上，以及在使用檢測(cè)試劑和方法時(shí)對(duì)T₄/蛋白質(zhì)平衡進(jìn)行擾動(dòng)的水平上均存在顯著差異。

在稀釋血清中加入抗體時(shí)，將會(huì)發(fā)生如下一系列事件。當(dāng)抗體與FT₄結(jié)合，更多的T₄從蛋白質(zhì)-T₄復(fù)合物上解離而形成更多的FT₄。因此，T₄在血清蛋白質(zhì)以及抗體間進(jìn)行重新分配。這種重新分配取決于抗體的濃度、親和力（相對(duì)于血清的結(jié)合能力），以及緩沖液配方中的其他成分（如BSA）是否會(huì)影響T₄與血清蛋白的結(jié)合。上述過程所涉及的反應(yīng)能夠用如下兩個(gè)簡單公式描述：

式（2-4-2）（前文已介紹）描述了體內(nèi)FT₄的血清濃度：

式中PBT₄代表蛋白質(zhì)結(jié)合的T₄濃度；K代表蛋白質(zhì)（針對(duì)T₄）的凈親和力；［P_free］代表蛋白質(zhì)上未結(jié)合（游離）的結(jié)合位點(diǎn)濃度。

式（2-4-3）描述了體外（即在免疫檢測(cè)管中）FT₄的血清濃度：

式中PB_T4和IA_T4分別代表與血清蛋白和與免疫檢測(cè)試劑（包括抗體）結(jié)合的T₄的濃度；K ［P_free］+K ［IA_free］代表血清蛋白質(zhì)與免疫檢測(cè)試劑的結(jié)合能力（即親和力乘以未結(jié)合位點(diǎn)的濃度）。

電子表格程序能夠用于計(jì)算體外（即免疫檢測(cè)管中）和體內(nèi)FT₄的濃度。它也能夠用于分析：

● 添加抗體（具備不同K ［P］）對(duì)血清稀釋FT₄的影響；

● 具備不同結(jié)合能力（K ［Ab］）的抗體對(duì)不同患者人群（即具有不同血清結(jié)合能力（K ［P_free］ ））的偏倚效應(yīng)；

● 外源性結(jié)合物（例如，添加到免疫檢測(cè)試劑中的不同數(shù)量的BSA）的偏倚效應(yīng)（對(duì)FT₄）；

● 免疫分析中抗體的最佳親和常數(shù)（K_eq）要求。

1.抗體添加對(duì)游離分析物樣本稀釋曲線的影響

當(dāng)抗體親和力（K）和抗體濃度（［P_ab］）從0（即未添加抗體）變化到K ［P_ab］為免疫檢測(cè)管中總結(jié)合能力的0.2%、0.5%、1%和15%，即K ［P_ab］/（（K ［P_ab］）+K ［P_total］）比值為0.002、0.005、0.1和0.15時(shí)，血清稀釋曲線的變化情況如圖2-4-7所示。在這些情況下，抗體將截留（或“抽出”）血清總T₄的0.2%～15%。這些用于模擬的甲狀腺功能正常的血清中結(jié)合蛋白和T₄的濃度與本小節(jié)前文假設(shè)相同，免疫檢測(cè)中采用25μL血清樣本，而檢測(cè)反應(yīng)終體積為125μL（試劑中僅抗體可與T₄結(jié)合）。血清的稀釋系數(shù)為1（即血清在反應(yīng)前后為5倍稀釋，而在檢測(cè)過程中未對(duì)血清進(jìn)行額外稀釋）至160。

結(jié)果表明，當(dāng)抗體濃度以及親和力（K ［P_ab］）的聯(lián)合效應(yīng)與天然結(jié)合蛋白的總濃度和親和力相比維持在最低水平時(shí)，如K ［P_ab］ /（（K ［P_ab］） +K ［P_total］ ）比值小于0.5%時(shí)，F(xiàn)T₄濃度在血清稀釋過程中保持相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)K ［P_ab］較高時(shí)，F(xiàn)T₄濃度隨著稀釋因子增大而降低；隨著K ［P_ab］ 的增加，稀釋導(dǎo)致的FT₄濃度下降逐漸增強(qiáng)。血清稀釋曲線的臨床意義將在本節(jié)后文中進(jìn)行討論。

2.抗體對(duì)不同患者群游離分析物濃度的影響

圖2-4-8描述了血清中添加抗體（具備不同K ［P_ab］）時(shí)所造成的偏倚效應(yīng)。圖中抗體的結(jié)合能力覆蓋了進(jìn)行甲狀腺功能測(cè)試的患者的常見情況（Nelson等人提示上述結(jié)合能力存在30倍差異，重癥患者蛋白質(zhì)結(jié)合能力比門診患者低8倍，而妊娠血清或TBG過量患者比門診患者血清結(jié)合能力高4倍）。其他血清T₄結(jié)合能力低下的人群包括TBG缺乏癥患者、甲狀腺功能亢進(jìn)患者和患呼吸窘迫綜合征的新生兒。

結(jié)果表明，使用高K ［P_ab］抗體時(shí)，低結(jié)合能力患者血清會(huì)產(chǎn)生負(fù)偏倚，而高結(jié)合能力患者血清會(huì)產(chǎn)生正偏倚。僅當(dāng)抗體K ［P_ab］較低，如K ［P_ab］/（K ［P_ab］ +K ［P_total］ ）低于1%時(shí)，檢測(cè)結(jié)果會(huì)接近FT₄的真實(shí)濃度，即小于10%差異。

3.免疫檢測(cè)試劑中BSA對(duì)游離分析物濃度的影響

在大多數(shù)免疫檢測(cè)試劑中通常會(huì)包含外源性蛋白（如BSA），用于減少抗體或分析物的NSB。在使用免疫法測(cè)定FT₄和FT₃時(shí)，試劑中引入BSA可以使檢測(cè)對(duì)非酯化脂肪酸（NEFAs）*具有魯棒性。圖2-4-9模擬了免疫檢測(cè)試劑中不同濃度外源性BSA在具備不同T₄結(jié)合能力血清中對(duì)FT₄濃度的影響。免疫檢測(cè)中采用25μL血清樣本，其最終反應(yīng)體積為125μL。結(jié)果表明，在游離激素免疫檢測(cè)試劑中引入BSA會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生不同影響。當(dāng)檢測(cè)試劑中BSA濃度增加時(shí)，低結(jié)合能力血清的負(fù)偏倚會(huì)變大，而高結(jié)合能力血清則產(chǎn)生正偏倚。至于BSA會(huì)防止NEFA干擾的觀點(diǎn)（NEFA會(huì)與BSA結(jié)合），由于接受肝素治療的患者通常血清T₄結(jié)合能力較低，BSA實(shí)際上會(huì)導(dǎo)致FT₄濃度出現(xiàn)負(fù)偏倚。由于NEFA的產(chǎn)生使血清組成改變而導(dǎo)致FT₄體外濃度與體內(nèi)濃度不同，因此不建議對(duì)接受肝素治療的患者進(jìn)行FT₄和FT₃水平的測(cè)定。

4.抗體親和力和濃度的優(yōu)化

截至目前，電子表格程序已被用于當(dāng)分析物/蛋白質(zhì)平衡受外源添加緩沖溶液（血清稀釋）或分析物結(jié)合物（抗體和BSA）的影響而產(chǎn)生干擾時(shí)，或受結(jié)合蛋白濃度和親和力變化影響時(shí)，預(yù)測(cè)游離分析物的濃度。這些模擬的結(jié)果表明，為了開發(fā)一種有效和準(zhǔn)確的游離分析物檢測(cè)方法，對(duì)于分析物/蛋白質(zhì)平衡的干擾應(yīng)降至最低。如果樣本內(nèi)在的精密平衡被破壞，游離分析物測(cè)量對(duì)比總分析物測(cè)量的優(yōu)勢(shì)將會(huì)喪失，因?yàn)榇藭r(shí)游離分析物的檢測(cè)結(jié)果將接近總分析物的結(jié)果。

前文中討論可見，在血清中添加抗體會(huì)導(dǎo)致其FT₄濃度降低，降低的程度取決于抗體的結(jié)合能力（K ［P_antibody］）。因此，為了減少上述偏倚，抗體的結(jié)合能力需要被保持在較低水平。模擬計(jì)算顯示，抗體的最佳結(jié)合能力應(yīng)小于正常血清結(jié)合能力的1%。采用電子表格程序，可以改變抗體的親和力和濃度，從而使K ［P］保持在正常血清結(jié)合能力的1%。如前所述，在這些情況下抗體將截留（或“抽去”）1%的血清TT₄。隨著總T₄（表格中單元格C16）濃度改變，抗體上的未占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)的百分比（單元格M19中的計(jì)算結(jié)果）與FT₄的濃度均會(huì)發(fā)生改變。圖2-4-10展示了上述模擬計(jì)算的結(jié)果。顯然，采用高親和力（1×1011L/mol）抗體（濃度為1.79×10-10mol/L），會(huì)使FT₄檢測(cè)具備優(yōu)異的靈敏度，但其檢測(cè)范圍有限，因此并不適于常規(guī)應(yīng)用。

隨著抗體親和力的降低（通過調(diào)整抗體濃度，并保持K ［P］不變），劑量-響應(yīng)曲線變緩但檢測(cè)范圍增大。當(dāng)親和力低于1×1010L/M時(shí)，曲線將過于緩和而不適于常規(guī)應(yīng)用。令人驚訝的是兩個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的FT₄檢測(cè)采用親和力低于1×1010L/M的抗T₄抗體但卻具備所需特性的曲線（Christofides et al.，1992；Christofides & Sheehan，1995）。這在文獻(xiàn)中引起了一些爭論，如Ekins（1992，1998）指出，上述檢測(cè)中抗體的親和常數(shù)測(cè)定存在錯(cuò)誤，僅當(dāng)抗體親和常數(shù)大于1×1011L/M時(shí)才會(huì)產(chǎn)生必要的曲線形狀。下面的數(shù)據(jù)展示了親和力低于1×1010L/M時(shí)，抗體如何應(yīng)用于FT₄的檢測(cè)。

第一個(gè)實(shí)驗(yàn)采用一種T₄抗體（K為8×109L/M，其采用稱重制備的T₄標(biāo)準(zhǔn)品，并用緩沖液進(jìn)行稀釋，通過經(jīng)典的Scatchard曲線分析獲得）。檢測(cè)基于反滴定形式（見下一小節(jié)）進(jìn)行，具體如下：25μL等分的血清FT₄標(biāo)準(zhǔn)品（通過ED校準(zhǔn)）被加入到包被了驢抗綿羊抗體微孔中。向微孔中加入100μL綿羊抗T₄抗體，在37℃下孵育15min。孵育完成后，將微孔進(jìn)行清洗并加入100μL含T₃偶聯(lián)辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的溶液（T₃-HRP的加入可以減少抗體-T₄的解離）。孵育時(shí)間選擇0.25～6h。此后，繼續(xù)清洗微孔并加入HRP底物。HRP發(fā)光通過光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。上述反應(yīng)的劑量-響應(yīng)曲線如圖2-4-11所示。正如Ekins所預(yù)測(cè)的結(jié)果（如 Ekins，1998），當(dāng)檢測(cè)接近平衡時(shí)（孵育6h），采用親和力小于1×1010L/M的抗體形成的劑量-響應(yīng)曲線過于平緩而難以實(shí)際應(yīng)用。然而，當(dāng)孵育時(shí)間縮短時(shí)，劑量-響應(yīng)曲線斜率顯著變陡，0.25h的孵育時(shí)間可以形成有效的斜率和測(cè)量范圍。

第二個(gè)實(shí)驗(yàn)采用125I標(biāo)記的抗T₄鼠單克隆抗體，其親和常數(shù)為5×109L/M，檢測(cè)采用“標(biāo)記”抗體方法（參見本節(jié)“標(biāo)記抗體方法”部分）。50μL FT₄血清校準(zhǔn)品被加入到聚苯乙烯管中，之后加入100μL示蹤抗體和100μL 含T₃的溶液，其中T₃與磁性纖維素微球連接形成分離懸浮液（separation suspension，SS）。SS的濃度從“純”溶液變化至1 000倍稀釋。聚苯乙烯管在37℃下孵育60min，之后放置于磁性底座上20min進(jìn)行分離。管中上清液被去除，微球通過伽馬計(jì)數(shù)器（NE1600）進(jìn)行測(cè)量。圖2-4-12展示出采用不同濃度SS的檢測(cè)方法所形成的劑量-響應(yīng)曲線（由SS上結(jié)合的總抗體與FT₄濃度相比作圖）。數(shù)據(jù)也以%B/B_o與FT₄濃度相比進(jìn)行作圖（圖2-4-13）。上述數(shù)據(jù)可見，采用高T₃纖維素時(shí)，曲線形狀非常平緩，因此檢測(cè)不利于實(shí)際應(yīng)用。這一結(jié)果與FT₄抗體親和力低于1×1010L/M時(shí)靈敏度過低的預(yù)測(cè)保持一致。但是，隨著T₃纖維素濃度的降低，劑量-響應(yīng)曲線（針對(duì)FT₄檢測(cè)）具備所需特征。圖2-4-13中不同檢測(cè)的ED₅₀（減少50%結(jié)合抗體量所需的FT₄濃度）范圍從＞100pmol/L（采用“純”T₃纖維素溶液）至13pmol/L（采用1/1 000濃度T₃纖維素溶液）。

上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)清晰地表明，如果檢測(cè)達(dá)到（接近）平衡，那么理論預(yù)測(cè)（不可能采用親和力低于1×1010L/M的抗體形成有效的FT₄檢測(cè)）是正確的。然而，使用非平衡條件和/或優(yōu)化檢測(cè)中的反應(yīng)物，如調(diào)整T₃纖維素（用于從游離抗體中分離結(jié)合的抗體）的濃度和親和力，可以開發(fā)出具備必要靈敏度和檢測(cè)范圍的FT₄檢測(cè)方法。

5.返滴定（兩步）法測(cè)試游離分析物

在此方法中，血清與固相載體上固定的抗體進(jìn)行反應(yīng)。在首輪孵育中（應(yīng)在37℃下進(jìn)行），抗體與血清中的分析物結(jié)合。首輪孵育完成后，反應(yīng)混合物被吸走去除，并對(duì)固定抗體進(jìn)行清洗。抗體上未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)通過與標(biāo)記分析物結(jié)合而實(shí)現(xiàn)定量，如圖2-4-14所示。

通常分析物類似物的標(biāo)記物更為常用，與內(nèi)源性激素相比其與抗體的親和力更低，因此更有利于減少測(cè)試過程中已結(jié)合的分析物從抗體上解離。已知量的示蹤劑與抗體結(jié)合并對(duì)比游離分析物濃度可以繪制校準(zhǔn)曲線，因此抗體上結(jié)合的示蹤劑數(shù)量能夠通過校準(zhǔn)曲線被轉(zhuǎn)化為濃度。校準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的游離分析物的濃度則通常由直接ED方法得出。

6.標(biāo)記類似物示蹤劑方法

在該方法中，血清與抗體（通常固定在固相表面）和標(biāo)記的分析物衍生物（標(biāo)記的類似物示蹤劑）同時(shí)孵育。在孵育過程中（37℃），類似物示蹤劑與游離分析物共同競(jìng)爭抗體上有限的結(jié)合位點(diǎn)。抗體上結(jié)合的示蹤劑的數(shù)量與分析物的濃度成反比。在孵育完成時(shí)，抗體與剩余的反應(yīng)物分離，并對(duì)結(jié)合的示蹤劑進(jìn)行定量（測(cè)量基于示蹤劑標(biāo)記特性進(jìn)行，如125I、酶或熒光基團(tuán)），其結(jié)果結(jié)合校準(zhǔn)曲線即可轉(zhuǎn)化為濃度信息。校準(zhǔn)品中對(duì)應(yīng)游離分析物的濃度通常采用直接ED方法作為參考方法得出，如圖2-4-15所示。

該方法以及標(biāo)記抗體方法的一個(gè)重要要求是分析物類似物對(duì)任何血清結(jié)合蛋白均沒有親和力。如果類似物對(duì)血清結(jié)合蛋白具有親和力，那么最終得到的游離分析物濃度將與蛋白質(zhì)的濃度相關(guān)。類似物與蛋白質(zhì)的結(jié)合能夠通過將類似物與大蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)先偶聯(lián)而消除（Georgiou &Christofidis，1996；Tsutsumi et al.，1987）。偶聯(lián)將為類似物引入足夠的空間位阻，從而阻止其與血清蛋白質(zhì)的結(jié)合。

7.標(biāo)記抗體方法

再次以游離甲狀腺激素為例。甲狀腺激素（如T₄或T₄-蛋白結(jié)合物）被固定在固相表面（如微孔表面）。血清樣本以及標(biāo)記的抗T₄抗體被加入固相，混合物在37℃下孵育。在孵育過程中，抗體在液相（包含內(nèi)源性FT₄）和固相上進(jìn)行分配。固相上結(jié)合的標(biāo)記抗體數(shù)量（當(dāng)液相反應(yīng)物從固相上分離后估測(cè)）與血清中FT₄的數(shù)量成反比，并且可以通過已知FT₄濃度的血清（濃度通常通過ED獲得）進(jìn)行定量計(jì)算。

通過固定T₃或T₃偶聯(lián)物以及標(biāo)記的抗T₃抗體示蹤劑可以開發(fā)FT₃檢測(cè)方法。

該方法的一種變體（Christofides et al.，1992，1995，1999a，b）已成功地用于開發(fā)商品化FT₄免疫檢測(cè)方法（圖2-4-16）。該方法借助于標(biāo)記的抗T₄抗體與固定化T₃-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物之間的弱交叉反應(yīng)性（＜1%）。弱交叉反應(yīng)的T₂-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物已被用于FT₃檢測(cè)方法的開發(fā)。

使用這種“異源檢測(cè)”方法有諸多優(yōu)點(diǎn)。首先，與所有的異源檢測(cè)相同，此類方法的劑量-響應(yīng)曲線更加陡峭。其次，該方法還具備包括反應(yīng)動(dòng)力學(xué)更快、信號(hào)強(qiáng)度更高以及針對(duì)內(nèi)源性抗甲狀腺激素抗體的抗干擾能力更強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。值得注意的是，對(duì)固定化抗原具有極高親和力的T₃自身抗體以高濃度存在時(shí)，會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾。這些檢測(cè)類型均包含兩項(xiàng)重要要求，即甲狀腺結(jié)合蛋白應(yīng)避免與固定化抗原間存在結(jié)合力（其通常通過將抗原與大分子連接而滿足），并且與所有游離甲狀腺激素檢測(cè)一致，應(yīng)盡可能降低對(duì)內(nèi)源性T₄/蛋白質(zhì)平衡的影響。

（三）有效性（準(zhǔn)確度）測(cè)試

利用前文所述的質(zhì)量作用定律模型，可以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)任意游離分析物檢測(cè)方法的性能與理論檢測(cè)性能進(jìn)行比較。本文針對(duì)一些可實(shí)操的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行介紹。

1.血清樣本中添加結(jié)合蛋白

當(dāng)加入蛋白質(zhì)增多時(shí)，可以預(yù)見游離分析物濃度逐漸降低。以FT₄為例，在檢測(cè)中不含任何干擾物質(zhì)的情況下，可以預(yù)測(cè)加入TBG所導(dǎo)致的FT₄濃度降低的百分比將大于加入等濃度的TTR或HSA所導(dǎo)致的FT₄濃度降低比例。該實(shí)驗(yàn)的問題在于游離分析物濃度的降低不僅取決于加入蛋白的濃度以及親和力，而且還取決于內(nèi)源性蛋白的濃度和親和力。因此，除非外源性蛋白和內(nèi)源性蛋白的濃度以及親和力是已知的，否則直接比較上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論結(jié)果是不可取的。盡管如此，該實(shí)驗(yàn)在確定檢測(cè)過程中存在嚴(yán)重問題時(shí)是有用的。例如，如果檢測(cè)中使用的示蹤劑針對(duì)任意結(jié)合蛋白具有親和性，那么在血清中加入這種蛋白將導(dǎo)致FT₄濃度的顯著上升（或不變），而非預(yù)期的FT₄濃度降低。

2.血清樣本中添加結(jié)合阻斷劑

隨著結(jié)合阻斷劑的加入，可以預(yù)見游離分析物的濃度呈現(xiàn)劑量依賴性升高。可以用于甲狀腺激素的阻斷劑包括藥物諸如呋塞米、酮洛芬、苯丁氮酮、甲芬那酸、二苯海因、丙磺舒、舒林酸、芬氯酸和水楊酸等，以及其他物質(zhì)包括苯胺-萘磺酸和非酯化脂肪酸（如油酸）。在這種測(cè)試中，由于游離分析物的濃度增加不僅與添加物質(zhì)的濃度以及親和力有關(guān)，而且與內(nèi)源性蛋白質(zhì)的濃度和親和力相關(guān)，所以其與上述蛋白質(zhì)添加實(shí)驗(yàn)類似，可以用于定性分析而非定量分析。

3.稀釋測(cè)試

血清稀釋測(cè)試是一種可以應(yīng)用于任何游離分析物檢測(cè)的定量評(píng)價(jià)方法。如果檢測(cè)方法有效，那么血清稀釋后應(yīng)產(chǎn)生近乎恒定的游離分析物結(jié)果；但是如果檢測(cè)方法無效，那么所得到的游離分析物濃度與稀釋之前比會(huì)降低。在甲狀腺激素檢測(cè)中，該方法被用于預(yù)測(cè)不同患者類別下的檢測(cè)性能（Christofides et al.，1999a；Christofides et al，1999b）。在血清稀釋時(shí)會(huì)產(chǎn)生一組樣本，其血清結(jié)合能力會(huì)反映出患者接受甲狀腺功能測(cè)試時(shí)的結(jié)合能力譜。例如，在接受甲狀腺功能測(cè)試的患者中，甲狀腺激素的結(jié)合能力存在20～30倍跨度的差異；妊娠晚期血清稀釋至20～30倍時(shí)可以重現(xiàn)這種跨度的差異。在血清稀釋后任何FT₄濃度的降低都表明該檢測(cè)方法可能低估了T₄結(jié)合能力較低的患者體內(nèi)的FT₄濃度，例如住院患者。血清稀釋試驗(yàn)中常用的緩沖溶液為10mmol/L HEPES（N- ［2-羥乙基］ 哌嗪-N′- ［2-乙烷］磺酸），（其可以從Sigma獲取，貨號(hào)H7523），pH7.4。這種方法的一個(gè)潛在問題是，當(dāng)血清稀釋至20～30倍時(shí)，會(huì)使檢測(cè)試劑中的蛋白質(zhì)含量過度降低，進(jìn)而引起顯著的非特異性效應(yīng)。因此，稀釋倍數(shù)應(yīng)控制在4～8倍（以反映嚴(yán)重的低蛋白血癥），以確保檢測(cè)試劑中包含足夠的蛋白質(zhì)從而避免非特異性干擾。稀釋依賴性的FT₄濃度降低表明此檢測(cè)方法將產(chǎn)生負(fù)偏倚結(jié)果，而該血清的T₄結(jié)合能力較低。

4.與參考方法進(jìn)行對(duì)比

在該方法中，對(duì)比時(shí)所選擇的患者人群構(gòu)成至關(guān)重要。當(dāng)患者人群中排除了具備高或低結(jié)合力的個(gè)體時(shí)，無效的游離分析物檢測(cè)方法與參考方法之間也會(huì)得到良好的比對(duì)關(guān)系。因此，該方法評(píng)估時(shí)應(yīng)選擇包含重癥患者血清、住院患者血清、妊娠血清（尤其是妊娠晚期血清）。更為重要的是，用于對(duì)照的參考方法本身應(yīng)該被證明是一種有效的游離激素檢測(cè)方法。

六、總結(jié)

在測(cè)量患者樣本中的游離激素或藥物時(shí)，需要盡可能減少對(duì)分析物與結(jié)合蛋白之間平衡的影響。在對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)聚焦于其對(duì)上述平衡的影響而非檢測(cè)方法自身的構(gòu)建形式。基于公認(rèn)的物理-化學(xué)原理（如ED）所構(gòu)建的檢測(cè)方法并不一定有效；相反，當(dāng)一個(gè)檢測(cè)方法無效時(shí)，也并不意味著該方法所依賴的基本構(gòu)架原理無效。

七、參考文獻(xiàn)和進(jìn)一步閱讀

（張軼　譯，何建文　審）