第二節 性病病原體實驗室檢測

一、梅毒螺旋體及血清抗體檢測

梅毒（syphilis）是由梅毒螺旋體（treponema pallidum）引起的一種慢性經典性病。梅毒螺旋體是一種小而纖細的螺旋體狀微生物，長度為5～20μm，平均8～10μm，直徑＜0.2μm，有6～12個螺旋，因其透明不易染色，故稱為蒼白螺旋體。

梅毒的實驗室方法主要有病原體檢查和梅毒血清學檢查。

（一）病原體檢查

目前常用的有暗視野顯微鏡檢查、鍍銀染色顯微鏡檢查、濃鹽酸蒸汽顯示法和免疫熒光染色檢查。其中暗視野顯微鏡檢查是對早期現癥梅毒檢測的最好方法。診斷一期梅毒、二期梅毒，可取病人損害的滲出物或淋巴結穿刺術得到組織液，在暗視野顯微鏡下觀察螺旋體的特征性形態和運動方式；孕婦羊水作暗視野顯微鏡檢查對先天梅毒具有診斷價值。

1．暗視野顯微鏡檢查

（1）取材

1）皮膚黏膜損害的取材：首先準備好一張干凈的載玻片加1滴等滲鹽水，用生理鹽水棉簽（不能用消毒液）清潔病損，如有結痂可用消毒的鈍刀片刮去，要避免出血，輕輕擠壓至出現滲液，用蓋玻片蘸取少許滲出液，蓋于先準備好的載玻片上，暗視野鏡檢。

2）淋巴結取材：先消毒淋巴結表面，再用1ml無菌注射器配12號針頭，吸取0.2ml的生理鹽水，注入消毒后淋巴結，反復抽吸數次后，吸出少量淋巴液直接滴加在載玻片上，加上蓋玻片，暗視野鏡檢。

3）羊膜穿刺術：梅毒孕婦的羊膜穿刺術應由專業人員操作，將獲得的羊水直接滴于載玻片上，暗視野。

（2）結果判定：根據其典型形態、大小和運動方式加以鑒別，鏡下可見到折光性較強，有特征性運動方式的梅毒螺旋體即為陽性。一次陰性結果應重復檢驗。此方法由于取材不當或用藥等都可出現陰性結果，所以如果是陰性，也不能完全排除梅毒。

2．馮泰納（Fontana）螺旋體鍍銀染色法

（1）染液的配制

1）羅吉（Ruge）固定液：冰醋酸1.0ml，甲醛溶液2.0ml，蒸餾水100ml。

2）鞣酸媒染劑：鞣酸5g，苯酚（石炭酸）1g，蒸餾水100ml。

3）馮泰納銀溶液：硝酸銀5g，蒸餾水100ml。

將硝酸銀溶液20ml逐滴加到10%氨溶液中，產生的棕色沉淀物經搖動后可再被溶解。如溶液很澄清，可再加入硝酸銀數滴，直到溶液搖勻后有輕度渾濁為止。此液應在臨用前配制，不可預制。

（2）染色法

1）將標本制成徐片，宜稍薄。空氣中干燥，不可用火焰固定。

2）滴加羅吉固定液，固定2～3min。

3）用無水乙醇洗滌。

4）加媒染劑2～3滴，用酒精燈火焰加熱至產生蒸氣，染30s，水洗。

5）滴加已經過氨液處理的銀溶液，并加熱使產生蒸氣。染30s，水洗，空氣中干燥。加蓋玻片以加拿大膠封閉固定（如直接加油鏡易使標本脫色），油鏡檢查。

（3）結果判定：螺旋體染成棕黑色，背景為淡棕色。

3．免疫熒光染色檢查

（1）直接法：①將受檢標本涂于載玻片上，直徑不超過1cm，自然干燥，用丙酮固定10min。②已知抗梅毒螺旋體血清（人或免），用非致病性螺旋體（如Reiter株）培養物進行吸收，再用異硫氰酸鹽熒光素（FITC）標記，然后涂在有標本的載玻片上，孵育30min。③徹底清洗，用緩沖甘油封固、待檢。

（2）間接法：①取材固定同上。②加經吸收的已知抗梅毒血清，孵育30min，徹底清洗。③加FITC標記的抗人（或免）血清，孵育30min，徹底清洗，用緩沖甘油封固，待檢。

（3）結果：在熒光顯微鏡下見到亮綠色螺旋體，熒光強度判為++～++++，以完整的螺旋體為陽性。

4．臨床意義

（1）暗視野顯微鏡檢查法、鍍銀染色法，直接鏡檢到梅毒螺旋體，在臨床上可確診梅毒，且具有快速、方便、易操作等特點。暗視野顯微鏡檢查法已被WHO指定為性病實驗室必備項目之一。

（2）螺旋體檢查是檢測最早期現癥梅毒的最好方法，對病人早期診斷、及時治療、預后和盡早切斷傳染源具有十分重要的意義。對梅毒感染者，能在血清抗體出現前進行抗梅毒治療，是最好的治療時機。

5．注意事項

（1）取材前，應用無菌等滲鹽水清潔皮損表面。

（2）鈍刀要消毒，取材時應取到組織滲出液，以提高陽性率，并盡量避免出血。

（3）取材后應立即置暗視野顯微鏡下觀察。

（4）暗視野檢查要觀察梅毒螺旋體的特征性形態和運動方式，對口腔潰瘍標本，應與其他螺旋體相區別。鍍銀染色法和濃鹽酸蒸汽顯示法要觀察到梅毒螺旋體的典型形態。

（5）如未觀察到梅毒螺旋體，并不能排除梅毒的可能性，這可能是由于取材不當或皮損處螺旋體數量不足，病人近期用過抗生素，損害已接近自然消退等原因引起。可讓病人復查及進行血清學追蹤觀察。

（二）梅毒的血清學檢查

梅毒血清學檢查分兩大類：非梅毒螺旋體抗原試驗和梅毒螺旋體抗原試驗。

1．非梅毒螺旋體抗原實驗 目前常用的有性病研究實驗室試驗，快速血漿反應素環狀卡片實驗和血清不需加熱的反應素試驗。這些試驗一般用來做初篩試驗，由于這些試驗設備簡單，操作比較方便，報告快速，易于推廣，所以主要用于作為常規試驗及適用于大量人群中進行篩查；可作定量（滴度）試驗，用于觀察療效、復發及再感染；鑒別早期與晚期潛伏梅毒（早期治療后滴度下降快，晚期下降慢或不變）。

（1）性病研究實驗室試驗（簡稱VDRL）：VDRL實驗所用的抗原是從牛心中提取出來的有效成分：心磷脂、卵磷脂及膽固醇。梅毒螺旋體在破壞組織的過程中，體內放出一種抗原性心磷脂，它能刺激機體產生反應素。這種反應素與從牛心提取的心磷脂在體外有抗原-抗體反應。可作定量及定性試驗。由于VDRL抗原的配制時混懸的技術較高，只可使用1日，而且待測血清需在試驗前滅活，給實驗室帶來許多不便，所以主要用于梅毒病人的腦脊液檢查。

（2）快速血漿反應素環狀卡片實驗（簡稱RPR）：RPR試驗所用的抗原為改良的VDRL加膠體炭為指示物，試驗在特制的白色紙卡上進行，在白色底板上出現黑色凝集顆粒或絮片為陽性反應。該試驗結果容易判斷，肉眼即可觀察，血清不需滅活，也可用血漿進行檢測。方法如下。

1）RPR定性試驗：在卡片圓圈中加人50μl待檢血清，并擴大到整個圓圈。用滴管和專用針頭，加1滴RPR抗原懸液。在手或機械轉動器（180r/min）轉動卡片8min。

2）RPR定量試驗：待測血清用等滲鹽水在卡片上作數個稀釋度：原血清、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等。按定性試驗步驟操作，以出現陽性反應的最高稀釋度報告結果。

3）結果判定：試驗結束立即按下述標準判斷結果。

陽性反應：在圓圈中可見不規則大小黑色凝集顆粒或絮片。

陰性反應：在圓圈中無黑色凝集顆粒，僅見均勻的不凝集現象（呈亮灰色）。

該試驗僅報告“陽性”或“陰性”，任何程度的陽性反應都需作定量試驗。

（3）注意事項：前帶現象：RPR試驗有時出現弱陽性或陰性結果，而臨床上又像二期梅毒，此時應將此血清稀釋后做定量試驗，如出現陽性結果，此現象稱為前帶現象。其原因是血清中抗心磷脂抗體量過多，或因封閉抗體，或有非特異性抑制物所致。1%～2%二期梅毒病人可出現此現象而發生梅毒血清假陰性反應。

1）血清固定性反應（也叫耐血清性）：是指梅毒病人經過抗梅治療后，非螺旋體抗原血清試驗（RPR等）大多數可轉為陰性，但有少數病人，血清反應滴度逐漸降低到一定程度即不在下降，而長期維持在低滴度，此種現象稱為血清固定性反應。血清固定性反應的標準：一般認為早期梅毒治療后2年，晚期梅毒治療后2年以上血清反應仍保持低滴度陽性者。

2）梅毒血清反應的假陽性反應：就是指非梅毒病人的梅毒血清反應呈陽性。可分兩大類：①非生物學假陽性反應，由于標本的保存（如細菌污染或溶血）、試劑的質量差或過期、實驗室操作的技術所造成。②生物學假陽性反應，又分急性和慢性，引起急性生物學假陽性反應的疾病很多像麻疹、病毒性肝炎、瘧疾等，但這些疾病梅毒血清反應滴度都很低，一般不超過1∶8，多在6個月內轉為陰性，但TPHA試驗陰性。另一個是慢性生物學梅毒假陽性反應，多見于結締組織病、自身免疫系統疾病（紅斑狼瘡等）、麻醉劑止痛、孕婦等滴度也有1∶8以上，甚至1∶64，這種情況就要參考臨床來診斷或確認試驗。

如果病人為HIV感染者，其梅毒血清反應有時會出現難于解釋的現象，艾滋病病人合并感染梅毒者，其梅毒血清試驗均呈陰性。可能是由于HIV感染導致免疫功能低下，導致的無免疫應答，因此對于懷疑梅毒者，建議同時進行HIV抗體檢查。

（4）甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）：甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）的檢測原理和RPR相同，只是用甲苯胺紅代替了炭顆粒，其檢測方法、結果判讀及臨床意義等均同RPR試驗。

2．梅毒螺旋體抗原試驗 這些實驗所用的抗原是梅毒螺旋體，檢測血清中的抗梅毒螺旋體抗體，其敏感性與特異性均高。目前常用的有熒光螺旋體抗體吸收試驗、梅毒螺旋體血球凝集試驗及梅毒螺旋體明膠凝集試驗等。這些試驗一般用來作證實試驗。這類試驗檢測的是抗梅毒螺旋體IgG抗體，即使病人經足量的抗梅治療，血清反應仍長期保持陽性，因此不用于觀察療效、判定復發及再感染。有報道在一期梅毒階段接受正規治療者，15%～25%在2～3年后可轉為陰性。

（1）梅毒螺旋體血球凝集試驗（簡稱TPHA）：TPHA試驗是用超聲裂解的梅毒螺旋體為抗原，致敏經醛化、鞣化的羊或禽類紅細胞，這種致敏的紅細胞一旦與抗梅毒抗體或免疫血清相遇時，在適宜的條件下，產生肉眼可見的凝集。最早進入我國的TPHA試劑盒是日本生產的，由羊紅細胞配成，致敏細胞和非致敏細胞為凍干品，配成細胞應用液，有效期短，反應時間長，目前已被TPPA等代替。

一般認為，TPHA試驗陽性病人，由于記憶細胞抗體復制能力強，特異性試驗敏感性高，即使經過抗梅毒治療也終身陽性，因此不能作為治療效果觀察的指標。但根據臨床觀察，早期梅毒病人血清如TPHA試驗為弱陽性反應，有可能陰轉。

特異性試驗對一期梅毒可比非特異性試驗早1周出現。梅毒過程中最初出現的是IgM抗體，梅毒感染后第2周即可從血清測出，而IgG抗體則需在感染后第4周方可測出。因此檢測195-IgM抗體可作為梅毒早期診斷或胎傳梅毒的確診。19SIgM治療后陰轉較快，在梅毒螺旋體抗原消失后不久，此抗體也隨之消失。據文獻報道經有效治療后，一期梅毒3個月，二期梅毒9個月IgM抗體達到100%陰轉。

梅毒確證試驗，一般定性試驗陽性，則可作梅毒診斷依據，必要時做定量試驗。經有效治療后特異性抗體滴度也可不同程度下降，可降至1∶160或1∶80。

此類試驗特異性強，很少出現假陽性。據統計，也可有1%生物學假陽性存在如紅斑狼瘡（SLE）可使FTA-ABS呈假陽性；而傳染性單核細胞增多癥，可能由于嗜異性抗體所致，可使TPHA呈假陽性；麻風病病人的非特異性試驗假陽性可高達40%，特異性試驗有的也可呈陽性。

（2）梅毒螺旋體明膠凝集試驗（簡稱TPPA）：TPPA試驗與TPHA基本相同。TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒代替TPHA試驗中致敏的紅細胞，此致敏顆粒與人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體結合，產生可見凝集反應，具有較高的敏感性。明膠粒子為洋紅色，在操作步驟上也較為方便，出結果較快。

（3）熒光螺旋體抗體吸收試驗（簡稱FTA-ABS）：FTA-ABS試驗是指將完整的梅毒螺旋體作為抗原，加上經吸收劑（用Reiter株螺旋體制備而成）吸收過的梅毒血清或免疫血清，形成抗原抗體復合物，再加入熒光素（FITC）標記的抗人免疫球蛋白（IgM、IgG）與抗梅毒螺旋體抗體結合，形成發光的抗原抗體復合物。在熒光顯微鏡下，螺旋體顯出蘋果綠色的熒光即為陽性反應。

熒光梅毒螺旋體吸收試驗被認為是“金標準”試驗，具有特異性高、敏感性強的特點。對一期、二期、潛伏期梅毒的敏感性分別是84%（70～100%）、100%和100%。特異性為97%（94%～100%）。但試驗需有質量優良的熒光顯微鏡和技術熟練的操作人員，才能得到較為準確的試驗報告。

（4）先天梅毒的實驗室診斷：19S-IgM-FTA-ABS試驗系檢測抗梅毒螺旋體IgM型抗體。為避免血清受7S（IgG）的抑制而出現假陰性結果，故待檢血清首先用IgM/IgG分離系統進行分離，采用間接免疫熒光法，其步驟與FTA-ABS試驗大體相似，但應用熒光標記μ鏈抗人IgM抗體滴加于載玻片的抗原抗體復合物上，用落射式熒光顯微鏡觀察。另外，19S-IgM還可作TPHA和ELISA。此試驗可作為梅毒早期診斷、判定治愈及再感染的檢測，并可與來自母體的抗梅毒螺旋體IgG型抗體區別，有助于診斷先天梅毒。

對于先天梅毒，不推薦用臍帶血作梅毒檢查，因為母親血液中的反應素及螺旋體IgG抗體可經胎盤及臍靜脈傳遞給胎兒，而出現假陽性反應；也不能用嬰兒血清作梅毒螺旋體抗原試驗（如TPHA、TPPA、FTA-ABS試驗）。據研究，由母親傳遞給胎兒的梅毒螺旋體IgG抗體，可在嬰兒體內存留至生后15個月。有條件地區，可進行19S-IgM-FTA-ABS試驗，對診斷先天梅毒有價值。

先天梅毒診斷的確證根據下列4個指標之一：暗視野查出梅毒螺旋體，患兒非梅毒螺旋體抗體滴度持續上升，非梅毒螺旋體抗體滴度高于其母親，患兒檢出抗梅毒19S-IgM抗體。

19S-Igm試驗方法，是指通過檢測沉降系數195的梅毒螺旋體單一成分的特異性IgM抗體來確診梅毒的。IgM抗體是梅毒感染最早期產生的抗體，并能隨疾病的治療而逐漸消失。另外，IgM聚合體不能通過胎盤，因此，對先天梅毒確診有特殊意義。另外，對一期梅毒非特異性血清反應陰性時的早期診斷，以及梅毒的再次感染和晚期梅毒的檢測也有作用。一旦在胎盤血中檢測到高滴度的抗梅毒螺旋體特異性抗體19SIgM，說明已感染梅毒。19SIgM還可作FTA-ABS和ELISA等項試驗。

母親是梅毒病人，患兒有早期或晚期先天梅毒的典型臨床表現，或有早期先天皮膚黏膜損害，查到梅毒螺旋體，或梅毒血清學試驗陽性，可作出先天梅毒診斷。

早期先天潛伏梅毒的實驗診斷：母親應肯定是梅毒病人，如患兒梅毒血清陽性，應排除被動抗體陽性的可能；如患兒非特異性試驗滴度比母親高，可能性大，以后按月檢查，3～4個月內不轉陰、滴度不下降或升高，則可診斷為早期先天潛伏梅毒。

母親在妊娠晚期才感染梅毒，新生兒在4～12周內血清試驗可為陰性，這不能排除先天梅毒的可能。如已感染，4個月后便可呈陽性。

為防止發生先天梅毒，應在婚前和產前作梅毒血清學檢查。在梅毒高流行區，還需在妊娠期第九個月重復進行血清學篩查。產前發現梅毒不論以往是否經過治療，都要在妊娠初期3個月內接受青霉素1個療程的治療；妊娠末期再治1個療程，以治愈可能被感染的胎兒。對梅毒孕婦所生的嬰兒均應進行血清學檢查和追蹤觀察。

二、淋球菌檢測

淋病（gonorrhea）的病原體是淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae），又稱淋病雙球菌，簡稱淋球菌或淋菌。淋球菌無鞭毛，無芽胞，無莢膜，容易侵犯人類泌尿生殖道的柱狀上皮細胞。與淋球菌同屬的有腦膜炎球菌、黏膜炎球菌和黃色球菌等，它們多寄居于人的鼻咽腔，在形態上和淋球菌相似，在檢測時應該加以鑒別。

（一）標本的采集和運送

在取材作涂片時，應先用滅菌等滲鹽水洗凈尿道口，然后用手指由后向前擠出膿液，用棉拭子或白金耳蘸取膿液輕輕涂在載玻片上，待自然干燥后作染色。如從男性病人前尿道取材作培養，應用白金耳或棉拭子深入尿道2～4cm，取出的分泌物應略帶黏膜。從女性病人的宮頸取材時，應將棉拭子插入宮頸口1.5cm，稍轉動并停留10～30s，讓棉拭子充分吸附分泌物。從肛門取材時，應將棉拭子插入肛門2.5cm以上，從緊靠肛環邊的隱窩中取材。檢查淋球菌性咽炎時應從扁桃體或扁桃體窩或咽后壁取材。取材的拭子應對病原體的生活力無影響，可用棉拭子或藻酸鈣拭子。此外，從女性病人宮頸取材時，應用滅菌鹽水濕潤窺器，而不要用潤滑油等以防止抑制淋球菌生長，拭子插入宮頸管前，應先將堆在宮頸口的分泌物揩去，以免過多雜菌干擾淋球菌的生長；取出拭子時不要碰到陰道壁，標本離體后應立即接種到培養基上。如取材處離實驗室較遠，應將標本放在合適的運送培養基中。

（二）檢測方法

1．分泌物的徐片檢查 急性淋球菌性尿道炎病人常有大量黃色膿性分泌物。在有些膿細胞內可有許多淋球菌。淋球菌革蘭染色呈陰性反應，具有特殊的菌體形態。因此，取病人尿道分泌物制成涂片作革蘭染色，檢查有無典型細胞內革蘭陰性雙球菌，可作初步診斷的依據。

（1）方法：先用滅菌拭子揩洗尿道口，然后用手指由后向前擠出膿液，蘸取膿液后輕輕涂于載玻片上。待自然干燥后加熱固定，染色，鏡檢。

（2）結果：在急性病人的尿道膿性分泌物革蘭染色涂片中，常可見到大量紅色多形核白細胞。在有些細胞中吞噬有淋球菌。淋球菌為革蘭陰性，呈卵圓形或圓形，常成對排列，接觸面扁平或稍凹。菌體長約0.7μm、寬約0.5μm。但兩菌大小可有差異。多數多形核細胞中并不含淋球菌，但不少膿細胞中常含有1至數對，甚至20～30對淋球菌，淋球菌通常存在于細胞質內。

在病期較長的淋病病人的徐片中淋球菌比較少，有時呈單個、四聯和八疊狀，且常位于細胞外。對有些菌有時難以下結論，需要進行培養和鑒定。

（3）注意事項

1）涂片時不要用力涂擦，應將棉拭子在玻片上輕輕滾動。由于急性病人診斷標準為見到“細胞內革蘭陰性雙球菌”。所以徐擦過勁，細胞破裂或變形，細菌從細胞內逸出，會造成診斷上的混淆。

2）涂片厚薄要合適。涂片過厚，加上染色過程中脫色時間不足，革蘭陰性菌會呈現紫色而成了陽性菌。因此，脫色時間要視涂片厚薄而定。在大量染片時，最好用一已知的革蘭陽性菌（如葡萄球菌）和陰性菌（如大腸埃希菌）作對照，以免造成結果錯誤。

3）固定涂片，只需將徐片迅速通過火焰2～3次，避免加熱過度使細胞變形扭曲。當把加熱的片放到手背上時應不感到太燙為宜。

4）涂片檢查方法簡便，價格低廉。對有癥狀的男性病人，敏感性和特異性均在95%以上，徐片檢查對這類病人的診斷是很好的方法；但涂片檢查對女性宮頸標本，敏感性僅40%～60%。特異性從80%～90%不等。因女性宮頸分泌物中雜菌很多，有的菌如不動桿菌在形態上很像淋球菌。因此，WHO不推薦用徐片法來檢查女性病人。可是當典型革蘭陰性細胞內雙球菌被訓練有素的檢驗人員在宮頸分泌物徐片中找到時，也可作出初步診斷并進行治療。但僅用涂片檢查女性病人時，會有不少病人被漏診。

5）不推薦用涂片檢查來診斷淋球菌性直腸和咽部的感染，也不推薦用來作判愈。

2．淋球菌的分離培養 如果標本中有淋球菌，則在合適的培養基上經培養后可長成菌落。各種細菌在培養基上生長成的菌落形態各不相同。根據菌落的大小、表面高起或扁平、光澤、色素和邊緣的情況等，作為細菌鑒定的標準。

（1）培養基：由于淋球菌的營養要求較復雜，所用的培養基中應含有動物蛋白及細菌生長所需的各種因子。目前國內常用的是血液瓊脂或巧克力瓊脂。為抑制雜菌，在培養基中可加入少量抗菌物質如多黏菌素B（25μg/ml）和萬古霉素（3.3μg/ml）等。所用血液如羊血、兔血和人血均可，濃度為8%～10%。但避免血液中加入抗凝劑等藥物。培養基的pH以7.4為好。目前，國外常用的培養基有Thayer-Martin（T-M）培養基、New York City（NYC）培養基和Martin-Lewis（ML）培養基等。T-M培養基是在GC基礎培養基中，加入血紅蛋白（1%）、抗生素（萬古霉素3μg/ml、黏菌素7.5μg/ml和制霉菌素12.5μg/ml）和淋球菌增菌劑，使絕大多數雜菌被抑制而淋球菌菌落長得較大，在平皿中幾乎呈純培養，從而大大提高了由子宮頸、尿道，尤其是咽和直腸部位分離出淋球菌的陽性率。

（2）培養條件：淋球菌對外環境變化頗為敏感，對寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，為了保證培養有足夠的成功率，取材后應立即接種，標本離體時間越短越好。取材處離實驗室距離較遠時，應將標本接種于Stuart或Amies運送培養基或1%葡萄糖肉浸液中，并注意在運送過程中保溫。接種的血平皿應先放在37℃溫箱中預溫。

培養的最適溫度為35～36℃，＞38.5℃或＜30℃便生長不良。因此，孵育的溫度要恒定。

淋球菌為需氧菌，但最初從人體分離時動促進其生長，需用5%二氧化碳環境培養。為保持一定的相對濕度，可在培養缸中放些浸水棉球。

（3）培養結果：淋球菌在血平皿上經24～48h的培養后，可形成圓形、凸起、濕潤、光滑、半透明或灰白色菌落。邊緣呈花瓣狀，直徑為0.5～1.0mm，用白金耳觸之有黏性。如繼續培養，菌落面積增大，表面變得粗糙，邊緣出現皺縮。若從菌落上取材作徐片，可見到菌的大小及染色的深度有差異用排列也不一致，約有25%的菌為典型的雙球菌，其他75%為單球菌、四聯形或八疊形。

據報道，把淋球菌培養在控制的條件下可見到4種形態的菌落，分別為T1、T2、T3、T4。T1和T2是從新采集的標本中分離出來的并與感染力有關，而T3和T4不能感染人。

淋球菌在液體培養基中生長于液體表面，或稍有輕度混濁和顆粒沉淀。

（4）注意事項

1）培養要獲得成功，取材的部位和方法一定要準確。

2）對癥狀不典型的男性病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后2～3h之后。

3）對女性病人的檢查主張用淋球菌培養。國內目前使用的血液瓊脂或巧克力瓊脂中加人多黏菌素和萬古霉素以分別抑制革蘭陰性和革蘭陽性雜菌。但由于部分淋球菌（某些地區可高達5%）對萬古霉素也敏感，因此，最好不用萬古霉素。

4）淋球菌在血平皿上培養24h，菌落形態很小，肉眼難以辨認其特點。24～36h，菌落迅速長大。所以觀看菌落特征最好在36h左右。超過36h，菌落特征也會有較大的改變。

（三）初步鑒定試驗

1．革蘭染色 淋球菌有特定形態。用白金耳從培養基上挑取可疑菌落在玻片上制成鹽水涂片，經革蘭染色，若見到具有淋球菌特征形態的雙球菌，可做出初步診斷。

在載玻片上加鹽水1滴，取可疑菌落制成涂片，干燥固定后作革蘭染色。鏡下可見革蘭陰性球菌。菌體為0.7μm×0.5μm大小，呈腎形或卵圓形。約1/4為雙球菌，多數為單球菌，個別呈四聯或八疊狀。與分泌物涂片所見不同，此徐片中無白細胞。

2．氧化酶試驗 淋球菌在生長過程中產生氧化酶。往培養基上生長了24～48h的菌落上加氧化酶試劑（0.5%～1%新配制的鹽酸四甲基對苯二胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液），淋球菌菌落的顏色可變成紅紫乃至黑色。其反應式如下：

（1）方法與結果：①在混有雜菌的淋球菌分離平皿上滴加氧化酶試劑后變成紫紅色的菌落為氧化酶試驗陽性。②也可先挑取可疑菌落涂于一干濾紙條上，滴加試劑，涂菌處變成紅色者為陽性。③或先滴一滴試劑于濾紙條上（勿太濕），再涂菌落，觀察顏色變化，變成紅色者為陽性。

（2）注意事項

1）為了保證有良好的反應，所用氧化酶試劑不應過分陳舊。正常的氧化酶試劑（鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸四甲基對苯二胺）應為淡紅色。如果試劑買來時已成灰色或黑色，說明已失效而不應使用。試劑溶液配好后應放在棕色玻璃瓶中避光保存可使用1周。

2）氧化酶試劑遇鐵也會出現紅色而造成假陽性，所以操作用的接種環應避免用舊鐵絲或電爐絲等制成，并在每次試驗前先檢查是否未挑菌的接種環接觸試劑就有紅色出現。

3）鹽酸四甲基對苯二胺比鹽酸二甲基對苯二胺敏感，將一滴鹽酸四甲基對苯二胺溶液滴在菌落上，如菌落很快變為深紫色并保留0.5min以上則為陽性。

4）如需保留菌種，在菌落未完全變黑時可挑少許轉種。菌落一旦變黑，多數菌即告死亡。

（四）鑒定試驗

糖發酵試驗：用作糖發酵試驗的培養基中除供淋球菌生長所需的營養物質之外，還加有各種糖類和指示劑。淋球菌有分解葡萄糖的酶類，當它分解葡萄糖時產酸，使培養基的pH降低。因此，培養基中的指示劑顏色改變，如酚紅由紅變黃，溴甲酚紫由紫變黃。

幾種奈瑟菌的糖發酵反應情況可見表4-1。

（五）淋球菌對藥物敏感性測定方法

當前，由于不規則用藥和細菌變異的結果，我國已出現淋球菌的耐藥菌株。檢測淋球菌對抗生素的敏感性可用來檢測是否產生了耐藥株及其比率，為修訂淋病治療方案和對策提供重要流行病學資料。

測定淋球菌對藥物的敏感性的方法很多，常用的有以下幾種。

1．紙片擴散法 將含藥紙片貼到涂有淋球菌的培養基上，藥物即擴散到瓊脂中。如果淋球菌對此藥物敏感，則生長被抑制，在紙片周圍形成一個透明的抑菌圈。瓊脂中藥物濃度與紙片距離成反比，距紙片越遠藥物濃度越小。因而，可根據抑菌圈的大小判定細菌對該藥的敏感程度。

檢查平皿并測量抑菌圈直徑。參照標準報告結果。

2．瓊脂稀釋法 將待檢菌株種于含有不同抗菌藥物的瓊脂平皿上，藥物濃度小時細菌生長，藥物濃度高時細菌生長被抑制，據此可測出藥物對該菌的最小抑菌濃度，依標準判定菌是否為耐藥菌株。

淋球菌對藥物的敏感度是指淋球菌不生長的藥物最高稀釋度。常用μg/ml或mg/L表示。此數值也即該藥對此菌的最小抑菌濃度（MIC）。

3．產青霉素酶淋球菌菌株（PPNG）測定——青霉素瓊脂法 某些淋球菌菌株獲得耐藥質粒后產生β-內酰胺酶。該酶能分解青霉素，使培養基的pH降低，培養基顏色發生改變。產酶菌株分解青霉素產生青霉酶噻唑酸使培養基pH降低，顏色由紅變黃。

三、生殖道沙眼衣原體感染檢測

生殖道沙眼衣原體感染的實驗室檢測包括細胞培養、抗原檢測和核酸擴增法等。

1．生殖道沙眼衣原體培養法 生殖道沙眼衣原體是專性細胞內寄生物，它只有在活細胞中方能增殖。將標本處理后接種于實驗室培養的活細胞中，如標本中有生殖道沙眼衣原體，則經培養后細胞中可出現生殖道沙眼衣原體的包涵體。目前，實驗室常用的細胞為McCoy細胞及HeLa229細胞。培養要獲得成功，取材是關鍵。所取材中必須含有活細胞。因此，取材的棉拭一定要插到柱狀上皮部位，旋轉且放置20s，以便拭子吸附更多的細胞。細胞培養是診斷和鑒定生殖道沙眼衣原體的“金標準”方法，敏感性和特異性均高。但操作比較復雜，需一定的條件與設備，且較費時。

2．抗原檢測法 抗原檢測法包括快速免疫層析法、酶聯免疫法和直接免疫熒光法。快速免疫層析法試驗是指將生殖道沙眼衣原體單克隆抗體的帶色乳膠復合物吸附于濾紙上，將濾紙夾在2塊塑料板中間。若加入的標本為陽性，則標本中的抗原與結合有乳膠的單抗結合，復合物因毛細作用向前擴散移動到結果窗，可被該處含有的未標記的鼠抗衣原體單抗所捕捉，在結果窗中出現一條黑線，標本即為陽性。過剩的未結合的帶色乳膠標記的鼠抗衣原體單抗可移動到質控窗，與該處的免抗鼠抗體結合，顯現一條黑線。

3．核酸擴增法 聚合酶鏈反應（PCR）的基本原理是一種酶促合成反應。在膜板DNA、引物和脫氧核糖核苷酸的存在下，在DNA聚合酶的作用下，使DNA鏈擴增延伸。試驗通過加熱變性使DNA雙螺旋的氫鏈斷裂，解離成單鏈DNA，然后通過退火，突然降溫使引物與其互補的模板在局部形成雜交鏈，然后在DNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸三磷酸底物和鎂離子存在的條件下，在聚合酶的催化下，以引物為始點，使DNA鏈延伸。通過數十次循環擴增，使DNA片段得到大量復制，數量可達數百萬倍。由于各種微生物的DNA千差萬別，使試驗具有高度特異性；由于試驗中DNA片段能成對數地擴增，使方法具有高度敏感性；加之現代分子生物學技術迅速發展，已有了諸如測序儀、合成儀等儀器，使試驗相對簡易化。但開展PCR應具有一定的主客觀條件。試驗需有精密的溫度控制儀和準確的微量移液管等基本設備，技術操作需有嚴格的防污染措施，嚴防極微量的微生物DNA污染試劑和實驗用品，試驗者應具有一定的分子生物學理論和操作經驗，能夠及時發現和糾正操作過程中的錯誤。連接酶鏈反應（LCR）是1989年才出現的一種核酸擴增試驗，它與PCR不同之處是采用了兩對寡核苷酸引物，它們與靶DNA堿基配對，結合于其上，然后連接酶將它們連接起來。此連接產物的順序與靶NDA順序相同。連接產物變性后，可作為引物的模板，通過變性-復性-連接20～30個循環，將連接產物擴增幾十萬倍以上。用生物素和堿性磷酸酶標記物后可直接對擴增產物進行檢測。

4．血清學試驗 人體感染生殖道沙眼衣原體后，產生相對應的抗體，但血清學試驗的診斷價值有限。

四、人乳頭瘤病毒檢測

尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒（HPV）所引起的性傳播疾病。傳統上，HPV引起的疣被認為是一種良性增生性損害，但是，人們漸漸認識到它有可能向惡性腫瘤轉化。因此，對于該病毒及其檢測方法引起了極大的興趣。

診斷試驗包括臨床和實驗室方法。在臨床上，認真仔細的體格檢查常能發現具有特征的疣損害，醋酸白試驗有助于檢查臨床表現不明顯的疣。實驗室方法有細胞學檢查和病理檢查。近年來，隨著分子生物學技術的迅速發展，利用核酸印跡技術、原位雜交試驗和PCR等方法檢測HPV DNA。

（一）醋酸白試驗

醋酸白試驗的作用原理尚未明了。一種認為是HPV感染所產生的異常角蛋白被脫色；而另一種看法則認為是蛋白質凝固的結果。

1．方法

（1）用棉拭子蘸5%醋酸于有可疑損害的皮膚上。

（2）1min后觀察結果，肛周皮損需要觀察15min，借助放大鏡能更清楚地觀察結果。

2．結果 可疑損害處局部變白為醋酸白試驗陽性。

3．意義 本試驗有助于檢測臨床表現不明顯或不典型的HPV感染，十分敏感。

4．注意事項 在某些情況下，如慢性炎癥（尿道炎和包皮龜頭炎）、表皮增厚或外傷等，會出現假陽性反應。假陽性反應時的變白現象界限不清，也不規則。

（二）細胞學檢查

常用來檢測無癥狀宮頸人乳頭瘤病毒感染，但常不敏感。細胞學特點是病毒所致的異形性表現凹空細胞。

（三）病理學檢查

1．方法 在疣組織部位常規病理取材，制成切片，經HE染色后鏡檢觀察。

2．結果 在HE染色中，細胞核染成鮮明的藍色，細胞質染成桃紅色。

診斷要點為角化不全，特別是有核異態的角化不全；表皮疣或棘層不同程度增生肥厚；空泡化細胞（特別是較典型較大量的空泡化細胞）；基底細胞增生。

五、皰疹病毒檢測

生殖器皰疹（genital herpes）的病原體是單純皰疹病毒（herpes simplex virus, HSV）。HSV有兩個血清型，即HSV-I和HSV-2，大多數的生殖器皰疹是由HSV-2引起的。生殖器皰疹的實驗室檢測包括病毒分離、細胞學檢查、單純皰疹病毒抗原檢查和血清學檢測。其中病毒分離和鑒定可作為確診，其他方法的診斷價值有限。

（一）單純皰疹病毒的分離和鑒定

1．標本的收集

（1）皰液：用結核菌素注射器從成熟的小瘡中抽取液體，注入有2.0ml病毒運送液的小瓶中（每ml含100mg慶大霉素和10mg兩性霉素B的0.5%牛血清白蛋白Hanks平衡鹽水）。也可只刺破小瘡后用無菌棉拭取材，并將棉拭頭剪斷放入2.0ml病毒運送液的小瓶中。

（2）潰瘍：先將表面物質去除，再用滅菌棉拭用力擦拭或刮取潰瘍的基底部，并將棉拭頭剪入2.0ml病毒運送培養液中。

如果使用藻酸鈣拭子，則它不應保留在培養基中，因藻酸鈣對病毒有毒性，而應將標本洗于培養液中而將拭子丟棄。

2．試驗方法 雖然標本可以冷凍，但在收集24～48h內就接種較為有利。所用細胞為原代人胚腎細胞、人胚肺成纖維細胞、HeLa細胞、Vero細胞和HEP-2培養物。標本在送達實驗之后先將病毒輸送液搖勻，取2.0ml處理過的標本接種于細胞培養基中，放在37℃孵箱中培養。每日觀察有無出現病毒對細胞的致病作用。典型的病變可在24h或幾天內出現，取決于接種液中病毒的含量和毒力。

3．皰疹病毒的鑒定 常用免疫熒光法，方法如下。

（1）如細胞出現典型的病變時，可初步報告為“單純皰疹病毒分離可疑”。

（2）在至少50%人胚腎細胞出現皰疹病毒的病變之后，將培養物反復凍融3次，吸取0.2ml接種到新的HEP-2細胞管中。這種細胞至少有50%能產生病變，因而適合于做免疫熒光試驗。

（3）再經培養后，將HEP-2細胞用吸管吹打下來，以200g離心10min使沉淀，去上清后，將細胞混懸到100μl pH7.2的磷酸緩沖液（PBS）中。

（4）取25μl的細胞懸液滴到載玻片兩端標記好的位置上。

（5）每個涂點用小棒涂成直徑為1cm的圓膜，經空氣干燥后用丙酮固定10min，再在空氣中干燥。

（6）涂片用直接或間接熒光法染色。試劑可用商品化的結合熒光素的多克隆抗血清和特異性單克隆抗血清。

（7）一旦一個皰疹病毒完成了分型鑒定則可報告為“初步的皰疹病毒分離物已鑒定為Ⅱ型（或Ⅰ型）單純皰疹病毒”。

（二）單純皰疹病毒的細胞學檢查

用滅菌棉試使勁擦試水皰或潰瘍的基底，在載玻片兩端作直徑為1cm的2個圓膜。放在空氣中干燥。用丙酮固定10min，待干。用熒光抗體與其結合。當檢出特異的病毒感染細胞時，涂片報告為“免疫熒光法檢查單純皰疹病毒陽性”。細胞也可以用Wright或Giemsa及PaPanicolaou法染色，用光學顯微鏡觀察，在多核巨細胞的胞核內找到嗜伊紅包涵體有助診斷。但此法敏感性僅50%～80%，且不具有特異性。陽性結果常在病初和從水皰或小膿皰損害中獲得，從潰瘍性損害或從多次發作的病人取材時陽性率低，而恢復期損害（結痂的）中，病毒的發現率更低。

（三）單純皰疹病毒抗原檢查

近年來，直接檢查臨床標本的單純皰疹病毒（HSV）抗原的診斷方法發展較快，如酶聯免疫吸附測定（ELISA）、免疫熒光法（IFA）、乳膠凝集（LA）等。DNA雜交與PCR檢測技術也已在我國應用。這些方法有快速、特異、敏感及無損害性等優點。因此，HSV抗原直接檢測是今后HSV檢測的發展方向。

1．酶聯免疫吸附測定（ELISA） ELISA由于具有方法簡單、靈敏和特異性高等優點，已經在許多領域得到應用。一般認為此法的標本檢出率在52.5%～96.1%。試驗的原理是用特異性抗體致敏載體，與含有抗原的溶液共同孵育，洗去過量的抗原，再加入酶標記的特異性抗體。孵育后，洗去過量的酶-抗體結合物，然后加入酶底物，底物顏色的改變與抗原量呈正比。ELISA法又分為間接法、雙抗體夾心法和競爭法。

2．免疫熒光法（IFA） 先將異硫氰基熒光素（FITC）和羅丹明等熒光素與特異性抗體結合，在一定條件下，再與標本中的相應抗原產生結合反應，形成有熒光的抗體-抗原復合物，通過熒光顯微鏡觀察，可看到復合物發出的熒光，即表示標本中存在相應的抗原。

3．DNA雜交 核酸分子雜交技術以其特異和敏感為主要特點。目前，核酸分子雜交技術已經成為病毒基因工程領域中的主要研究手段之一，它被廣泛應用于研究和臨床工作。

試驗原理是各種生物的DNA中堿基對是互補的，在適當的條件下，互補的單鏈DNA能形成雙鏈結構。反應體系中如果以放射性核素或生物素標記的DNA作為探針，它與待檢核酸中的相同序列可形成雙鏈結構，通過放射自顯影或免疫手段可檢查待檢核酸中的共同序列。但該方法試驗條件要求較高、費時、費事，且標記放射性核素不僅有損害性，也不易保存，使常規使用受到限制。

4．聚合酶鏈反應（PCR） 聚合酶鏈反應是20世紀80年代中期迅速發展起來的高生物技術，也是基因擴增技術的一次重大革命。此項新技術被廣泛應用于分子生物學、醫學及遺傳學等各個領域。

利用DNA聚合酶依賴DNA模板的特性，模仿體內的DNA復制過程。在附加的一對引物之間誘發聚合反應，經過DNA變性、退火、延伸三大步驟的多次循環，可以得到大量介于這對引物之間的序列，用電泳或核酸雜交技術進行檢測。PCR技術具有敏感、特異、快速等特點。

PCR作為一種新型診斷方法，特別是它的靈敏性高，可檢測到小至3pfu HSV。PCR的敏感性較細胞培養高，已初步在臨床病毒檢驗工作中顯示出了較大的優越性。但該方法由于高靈敏度，易產生污染而導致假陽性。對實驗室設置要有3～4個各自封閉的工作區間，室內用品嚴格專用及一次性使用，實驗過程要有嚴格的質檢和內對照等；工作人員素質要求高，對臨床標本的采集和處理要求也高，否則都會影響結果的準確性。目前市售的國產試劑盒，在質量上是有一定差異的，在選擇時，一定要選用質量可靠的試劑盒，否則會影響結果的可靠性。

一般認為PCR基因擴增技術和DNA雜交技術不能單獨作為確證指標，只有在PCR擴增和DNA雜交陽性并且檢出該病原體相應的抗體時才能作出病原學診斷。目前，檢測HSV病原體技術主要采用酶聯免疫技術（ELISA）。它具有敏感度高、特異性強、準確率高、應用面廣、不需高檔實驗儀器和操作簡便等優點。

（四）單純皰疾病毒的血清學檢測

血清學診斷目前常用的是中和試驗。它可用于診斷單純皰疹病毒的原發感染，但對恢復期或復發的生殖器皰疹的診斷沒有用處。

中和試驗是指特異性抗體能中和相應的病毒活力（或細菌外毒素）的一種特異的抗原抗體反應。自從能用組織培養和雞胚來代替動物做中和試驗之后，該法已變得較為簡便和實用。