第四章 艾滋病性病實驗室檢測

第一節 艾滋病實驗室檢測

艾滋病檢測是指采用實驗室方法對人體血液、其他體液、組織器官、血液衍生物等進行艾滋病病毒、艾滋病病毒抗體及相關免疫指標檢測，包括HIV抗體、HIV-1抗原、CD4+T細胞和CD8+T細胞檢測、HIV核酸、HIV-1耐藥和HIV-1的分離培養。艾滋病檢測實驗室必須通過技術和條件驗收，經省級衛生行政部門審批合格后方可開展工作。

一、樣品采集和處理

（一）血液

1．抗凝全血 消毒局部皮膚，用含有抗凝劑的真空采血管抽取適量靜脈血，或用一次性注射器抽取靜脈血，移至加有抗凝劑的試管中，輕輕顛倒混勻6～8次。

2．末梢全血 消毒局部皮膚（成人和1歲以上兒童可選擇耳垂、中指、無名指或示指。1歲以下兒童采用足跟部）。用采血針刺破皮膚，用無菌紗布擦掉第1滴血，然后收集滴出的血液。

3．血漿 將采集的抗凝全血1500～3000r/min離心15min，上層即為血漿。

4．血清 用一次性注射器（或真空采血管）抽取5～10ml靜脈血，室溫下自然放置1～2h，待血液凝固、血塊收縮后再用1500～3000r/min離心15min，上層即為血清。

5．淋巴細胞富集液 將采集的抗凝全血1500～3000r/min離心15min，血漿層下即為淋巴細胞富集液。

6．外周血淋巴細胞（PBMC） 使用淋巴細胞分離液，進行密度梯度離心，吸出PBMC層。

（二）濾紙干血斑（DBS）

（1）將采集的各種血液樣品制備成濾紙干血斑，最常用的是用抗凝全血、外周全血和血漿制備濾紙干血斑。

（2）用移液器吸取100μl抗凝全血（或血漿）樣品，對準濾紙印圈的中心處，將樣品滴在濾紙上，或將穿刺后自皮膚傷口流出的外周全血直接滴加在濾紙印圈的中心處。

（3）在室溫下自然干燥至少4h（潮濕氣候下至少干燥24h），不要加熱或堆疊血斑，切勿與其他界面接觸。

（4）血斑充分干燥后，將其放入密封袋中，避免血斑之間的相互污染，同時放入干燥劑及濕度指示卡，密封包裝。

（三）尿液和唾液

1．尿液 使用清潔的容器收集尿液。女性應避開月經期。尿液樣品可以在2～8℃下存放。

2．唾液 使用試劑盒提供的容器收集唾液樣品。

（四）樣品的保存

（1）用于抗體和抗原檢測的血清或血漿樣品，1周內進行檢測的可存放于2～8℃，1周以上應存放于-20℃以下。

（2）用于核酸檢測的血漿和血細胞樣品4日內進行檢測的可存放于4℃，3個月以內應存放于-20℃以下；3個月以上應置于-70℃以下。

（五）樣品運輸要求

（1）應符合生物安全要求，要獲得相應部門批準并由具有資質的人員專程護送。

（2）采用3層容器對樣品進行包裝，隨樣品應附有與樣品唯一性編碼相對應的送檢單。送檢單應標明受檢者姓名、樣品種類等信息，放置在潔凈區域。

1）第1層容器：通常使用試管，試管上應標明樣品的唯一性編碼或受檢者姓名、種類和采集時間。在試管的周圍應墊有緩沖吸水材料，以免碰碎。

2）第2層容器：容納并保護第1層容器，可以裝若干個第1層容器。要求不易破碎、帶蓋、防滲漏、容器的材料要易于消毒。

3）第3層容器：容納并保護第2層容器的運輸用外層包裝箱。

4）用于抗體檢測的血清和血漿樣品應在凍存條件下運送；用于CD4+T細胞和CD8+T細胞測定的樣品應在室溫下（18～25℃）或4℃（特殊要求時）運送；用于HIV-1載量檢測的樣品應在-20℃以下運輸；DBS樣品在室溫下（18～25℃）運送。每一件包裝的體積不宜超過50ml。

5）特殊情況下經有關部門批準可以用特快專遞郵寄樣品，但必須按3層包裝，嚴禁使用玻璃器皿。

（六）樣品的接收

（1）樣品包裹必須在具有處理感染性材料能力的實驗室內，由經過培訓的工作人員在生物安全柜中打開，用后的包裹應及時消毒。

（2）核對樣品與送檢單，如發現試管溢漏應立即將尚存留的樣品移出，對試管和容器消毒，同時報告實驗室負責人。

（3）檢查樣品有無嚴重溶血、微生物污染、血脂過多及黃疸等情況。如果污染過重或者認為樣品不能被接受，應將樣品安全廢棄，并將樣品情況立即通知送樣人。

二、HIV抗體檢測

（一）常規HIV抗體檢測的方法

HIV抗體檢測分為篩查試驗（包括初篩和復檢）和確證試驗。

1．篩查試驗 篩查試劑必須是經國家食品藥品監督管理局注冊批準，其中酶聯免疫試劑應批批檢合格。樣品可采用血清、血漿、濾紙干血斑、唾液和尿液樣品。

2．篩查方法

（1）酶聯免疫吸附測定（ELISA）：可使用血液、唾液、尿液樣品，ELISA多為單純HIV抗體檢測試劑。HIV抗原抗體聯合檢測試劑可同時檢測血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗體。HIV抗原或抗體包被于固相載體，加入待檢樣品和酶標記的HIV抗原或抗體，加底物顯色，用酶標儀測定結果。

（2）化學發光或免疫熒光試驗：這類試劑采用發光或熒光底物，既可檢測抗體，也可聯合檢測抗原抗體。HIV抗原或抗體包被于固相載體，加入待檢樣品和酶或熒光標記的HIV抗原或抗體，加發光或熒光底物，用發光或熒光儀測定結果。

（3）快速檢測（RT）及其他檢測試驗

明膠顆粒凝集試驗（PA）：將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用。當待檢樣品含有HIV抗體時，明膠顆粒與抗體發生凝集反應，根據凝集情況判讀結果。PA試劑有兩種：同時檢測HIV-1和HIV-2抗體及分別檢測HIV-1和HIV-2抗體。

免疫滲濾試驗：斑點ELISA和斑點免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗：均以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原點狀固定在膜上，加待檢樣品。陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。

免疫層析試驗：以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品（血液或唾液）沿著固相載體遷移，陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。

3．篩查試驗結果報告 HIV抗體篩查試驗陰性反應報告為“HIV抗體陰性（-）”；陽性反應報告為“HIV抗體待復檢”。

（二）確證試驗

試劑必須是經國家食品和藥品監督管理局注冊批準。確證樣品可采用血清、血漿、濾紙干血斑樣品。確證方法包括免疫印跡試驗（WB）、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗（RIPA）及免疫熒光試驗（IFA）等。

1．常規試驗為免疫印跡試驗 硝酸纖維試劑膜條上結合了天然滅活HIV-1型蛋白的分離顆粒和特異性的HIV-2型合成多肽。硝酸纖維試劑膜條分別與加入稀釋的血清或血漿樣本和對照孵育。如果樣本中含有HIV-1和HIV-2型的特異性抗體，則抗體會與試劑膜上的HIV-1蛋白和HIV-2多肽結合，通過清洗去除試劑膜上的未結合物，與HIV蛋白特異性結合的抗體再通過與帶有堿性磷酸酶的羊抗人IgG抗體結合，加入BCIP/NBT底物等一系列反應即可顯色。

2．HIV抗體確證試驗結果的判定

（1）HIV-1抗體陽性：同時符合以下2條標準可判為HIV-1抗體陽性。①至少有2條env帶（gp41和gp160/gp120）出現，或至少1條env帶和p24帶同時出現；②符合試劑盒提供的陽性判定標準。

（2）HIV-2抗體陽性：出現HIV-2型特異性指示帶的樣品：如果同時呈HIV-1抗體陽性反應，報告HIV-1抗體陽性，不推薦進一步做HIV-2抗體確證試驗；如果同時呈HIV-1抗體不確定或陰性反應，需用HIV-2型確證試劑再做HIV-2的抗體確證試驗。同時符合以下2條標準，即出現至少2條env帶（gp36和gp140/gp105），和試劑盒提供的陽性判定標準，可判為HIV-2抗體陽性。

（3）HIV抗體不確定：出現HIV抗體特異帶，但不足以判定陽性。①HIV-1抗體特異帶包括：env帶：gp160/gp120、gp41；gag帶：p55、p24、p17（或p18）；pol帶：p66（或p65）、p51、p31。②HIV-2抗體特異條帶包括：env帶：gp140/gp105、gp36；gag帶：p56、p26、p16；pol帶：p68、p53、p34。（由于使用的毒株不同，HIV-2 env帶也可為gp125/gp80、gp36）。

（4）HIV抗體陰性：無HIV抗體特異帶出現。

3．確證試驗結果報告 符合HIV-1抗體陽性判斷標準，報告“HIV-1抗體陽性（+）”；符合HIV-2抗體陽性判斷標準，報告“HIV-2抗體陽性（+）”。符合HIV抗體陰性判斷標準，報告“HIV抗體陰性（-）”。如疑似“窗口期”感染，建議進一步做HIV核酸檢測。符合HIV抗體不確定判斷標準，報告“HIV抗體不確定（±）”，在備注中應注明“4周后復檢”。

三、HIV-1抗原檢測

常規試驗為HIV-1P24抗原檢測，又分定性和定量檢測。樣品可采用血清、血漿或病毒培養上清液，方法為ELISA抗體夾心法。

（一）定性檢測

1．篩選試驗 按照試劑盒說明書提供的標準判斷有反應或無反應。

2．確證試驗 是P24抗原的中和試驗，用于排除篩選試驗的假陽性。待檢樣品先與中和劑（P24抗原的抗體）共同孵育，如果樣品中存在P24抗原，中和抗體將與之結合形成復合物，而不能與固相載體上的捕獲抗體結合。用這樣處理過的樣品重復篩選實驗的步驟，同時做一孔未中和的原始樣品對照，將中和與未中和孔的OD值進行比較，如果中和孔的OD值下降50%以上，認為樣品中的P24抗原是真正的陽性；如果中和孔沒有出現OD值的下降，認為P24抗原的反應性可能是假陽性，需要做RNA檢測或隨訪做進一步確證。

（二）定量檢測

將P24抗原的標準物質稀釋成包含0.0和125pg/ml 2個濃度在內的6個不同濃度的系列標準，進行檢測。以橫坐標為P24抗原的濃度（pg/ml），縱坐標為OD值，繪制出標準曲線。測出未知標本的OD值以后，在標準曲線上查出抗原的濃度。如果未知標本的OD值超出標準曲線上最高抗原濃度的OD值，則需用正常人血清將標本稀釋以后再行檢測。

（三）結果報告和解釋

HIV-1 P24抗原篩選試驗有反應的標本必須經過中和試驗確證以后才能判斷陽性或陰性；HIV-1 P24抗原陽性僅作為HIV感染的輔助診斷依據，不能據此確診；HIV-1 P24抗原陰性結果不能排除HIV感染。監測病程進展或抗病毒治療效果應進行HIV-1 P24抗原的定量檢測。

四、CD4+細胞和CD8+T淋巴細胞檢測

（一）樣品種類、運輸和接收

1．樣品種類 采用抗凝全血，應選擇合適的抗凝劑。①用于血液學檢測的抗凝劑：K3EDTA或K2EDTA抗凝管；②用于流式細胞儀免疫表型檢測的抗凝劑：K2EDTA、K3EDTA、酸性枸櫞酸葡萄糖溶液（ACD）或肝素抗凝。一般要求48h內染色，染色后6h內分析。如采血后24h內染色，則可在染色后24h內分析。如利用CD45單克隆抗體和側向光設淋巴細胞門，可檢測放置72h的樣品。

2．樣品運輸 室溫（18～25℃）保存和運輸樣品，高溫季節，需用隔熱容器盛裝樣品，并將樣品置于有冰袋和吸熱物質的容器中。

3．樣品接收 由專人接收樣品，檢查樣品數量并核對標識；溶血、凝血或結冰的樣品應視為不合格樣品，超過檢測允許時間的樣品不可檢測；如果樣品運輸過程中溫度超出室溫范圍，但沒有明顯的溶血或結冰，可以處理樣品，但要在工作表的報告上注明溫度條件。

（二）檢測方法

CD4+T細胞和CD8+T細胞計數的方法分為兩大類：一類是應用流式細胞儀測定法；另一類是非流式細胞儀測定法。常用的淋巴細胞計數檢測方法為自動檢測方法，包括流式細胞儀（主要有多平臺法和單平臺法）和專門的細胞計數儀。

1．流式細胞儀檢測方法 可分雙平臺法和單平臺法兩種。

（1）雙平臺方法：是一種細胞群體的絕對計數方法，利用血球計數儀檢測淋巴細胞數量，再根據流式細胞儀得到的細胞群體百分比，計算得到每微升的淋巴細胞數量，這種方法稱為雙平臺方法。雙平臺法需要兩種儀器，由于儀器有系統誤差，計算結果的重復性和準確性影響因素較多，用這種方法進行CD4+和CD8+T細胞計數時，不同實驗室差異很大。這種方法最大的缺點在于操作步驟復雜，操作人員多、費時。因此，很難將變異水平減小到最低。

（2）單平臺方法：是相對雙平臺法而言的，即應用三色、四色流式試劑配以內參絕對計數微球，加上流式細胞儀淋巴細胞亞群獲取和分析軟件，一步即可獲得T細胞亞群的相對數（百分比）和絕對數。通過使用已知數量的參考微球為內參，可以直接報告絕對計數，即通過獲取的目標細胞與參考微球的比例、參考微球數量和樣品體積，得到每微升的淋巴細胞數量。單平臺法最大限度地減少了多個儀器檢測帶來的檢測誤差，細胞絕對計數結果的重復性和準確性都得到了良好的保證。

2．非流式細胞儀測定法

（1）Cyto-Spheres方法：CD4+計數試劑盒包含CD4+微球試劑，即包被有單克隆抗體的惰性乳膠微球，可以通過光學顯微鏡鑒別和手工計數新鮮全血中CD4+T細胞的絕對數。其原理是人和動物的T細胞表面有紅細胞受體，因此紅細胞可以黏附到T細胞的周圍而形成玫瑰花樣的細胞團。在紅細胞中，以綿羊紅細胞最為常用。

（2）Dynabeads方法：以免疫磁珠細胞分離方法為基礎，使用包被CD4+和CD8+抗體的Dynabeads磁珠，從全血中捕獲分離CD4+T細胞和CD8+T細胞；另一種CD14微球用來阻隔單核細胞。用甲紫（龍膽紫）和臺盼藍染色分離出來的CD4+T細胞，在光學顯微鏡下或自動細胞計數儀上計數。

五、HIV核酸檢測

HIV核酸檢測分為定性和定量檢測。

（一）定性檢測

可檢測單個樣品或多個混合樣品（集合核酸定性檢測，Pooling PCR）。方法分為商品化試劑盒和實驗室自建方法兩種，商品化試劑應嚴格按說明書操作。以下介紹的是實驗室自建方法。

檢測血漿或血清樣品使用反轉錄PCR（RT-PCR）方法，建議第1輪PCR擴增使用RT-PCR一步法；檢測血細胞或組織樣品使用PCR方法。一般使用擴增兩輪的套式PCR方法。

設立陽性、陰性及空白對照。陽性對照為與待測樣品同質、含有目的基因的樣品；陰性對照為與待測樣品同質、不含有目的基因的樣品。陽性和陰性對照樣品應與待檢樣品處理程序一致。陰性對照的設置數量應根據實驗樣品的數量設置在不同的位置。

1．試劑

（1）PCR引物：一般使用擴增HIV gag和（或）pol和（或）env和（或）LTR等引物。進行RNA反轉錄時可使用下游特異性引物或隨機引物。引物設計可參考文獻或自行設計，應盡量涵蓋常見的HIV流行毒株，也可使用兼并性引物。

（2）主要試劑：包括核酸提取純化、反轉錄、PCR所需的試劑。使用商品化核酸提取純化試劑、反轉錄酶反應試劑和PCR擴增試劑。

（3）抗污染試劑：實驗室自建檢測方法可使用抗污染試劑，參考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。

2．擴增目的基因片段

（1）核酸提?。嚎墒褂霉枘z柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法及自動化儀器等商品化試劑或設備并按說明書操作。提取RNA時應注意防止RNA降解。DNA應置于-20℃保存，RNA和需長期保存的DNA應置于-80℃保存。

（2）反轉錄合成cDNA：使用商品化試劑并按說明書操作。反轉錄cDNA合成反應需使用反轉錄引物、dNTPs、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行反轉錄反應。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進行第1輪擴增反應。

（3）PCR擴增反應：使用商品化試劑按說明書操作。PCR反應需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水，以及模板（DNA或cDNA）。在擴增儀中，按照設定的程序進行擴增。一般使用2次擴增的套式PCR擴增方法。

3．擴增產物分析及結果報告

（1）擴增產物分析：擴增產物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標準比較，判斷擴增片段是否在預期的分子量范圍內。其他擴增產物分析方法還有限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析及DNA序列分析等。自動化核酸擴增儀使用酶聯比色分析或熒光探針雜交等原理測定。

（2）結果判定和報告：實驗成立的條件：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、雙份平行樣品結果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應結果的判定。HIV核酸檢測陽性：使用商品化檢測試劑，發現核酸陽性反應，應該重復采集樣品進行復測，復測結果呈核酸陽性反應則判定為核酸陽性，復測結果為核酸陰性反應則判為不確定結果，需進一步隨訪檢測。HIV核酸檢測陰性：只可報告本次實驗結果陰性。

（二）定量檢測

HIV-1載量檢測根據方法的原理不同分為核酸序列依賴性擴增（NASBA）技術，實時熒光定量PCR擴增（real-time PCR）技術，分枝DNA信號放大系統（bDNA）技術。

1．核酸序列依賴性擴增（NASBA）技術 此技術是以一種等溫擴增系統。其代表產品為實時熒光技術NucliSens EasyQ分析儀，它通過結合NASBA技術、BOOM核酸提純技術與分子信標探針技術檢測血漿中的HIV RNA水平。

2．實時熒光定量PCR擴增（real-time PCR） 技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。它的代表產品包括Cobas Amplicor Taqman檢測系統、M2000檢測儀和一些國產儀器。

3．分枝DNA信號放大系統（bDNA）技術 基于其獨特的信號放大系統（分枝DNA信號放大系統），為一個人工合成的分枝DNA，它的分枝可結合多個酶標記物，從而將病毒的信號放大，以便進行檢測。代表產品為Bdna440病毒載量檢測儀。

六、HIV-1耐藥檢測

HIV-1耐藥檢測的方法可分為兩大類：一類是基因型檢測法；另一類是表型檢測法。常用方法為HIV-1基因型耐藥檢測法，它主要有美國FDA批準的ViroSeqTMHIV-1基因型自動檢測法、TRUGENERHIV-1基因型半自動檢測方法和各實驗室自建的（In-house或Home-brew）方法。自建法與前兩種方法檢測結果的準確性無顯著性差異，并且價格低廉，以下主要介紹此方法。

（一）樣品采集和處理

要求HIV感染者血漿病毒載量≥1000拷貝/ml或國際單位，采用血漿、濾紙干血斑樣本。

（二）檢測試劑

1．引物 根據所檢測的目的基因、參考文獻和本地HIV-1流行毒株的序列設計擴增和測序引物。

2．主要試劑 實驗室自建方法需配置病毒核酸提取、反轉錄、PCR和測序反應等步驟所需的試劑。

（三）核酸提取

按照核酸提取試劑盒說明書操作，提取血漿RNA常用QIAamp viral RNA Mina Kit試劑盒，提取DBS樣品中的總核酸（RNA和DNA）常用NucliSENS RNA Isolation Kit試劑盒。實驗中應加陰、陽性外部對照，提取RNA時應注意防止RNA降解。RNA和需長期保存的DNA應在-80℃保存。

（四）反轉錄和PCR擴增

將RNA模板、反轉錄引物、dNTP、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、緩沖液和適量無RNA酶的超純水加入反應管中，在適宜溫度下進行反轉錄反應，合成cDNA。將模板（DNA或cDNA）、dNTP、引物、緩沖液、TAQ酶和適量滅菌純水加入反應管中，放在擴增儀上，按照設定的程序進行PCR擴增。建議使用一步法試劑進行第1輪擴增反應。

（五）序列測定

通常采用Sanger法進行DNA測序。將擴增產物、dNTP、ddNTP、測序引物、緩沖液、Taq酶和適量滅菌純水加入反應管中，置于擴增儀上，按照設定的程序進行測序反應，在測序儀中讀取序列數據。也可以送到有資質的商業測序公司進行。

（六）耐藥程度分析

提供HIV-1耐藥基因型檢測數據分析和解釋系統（HIVDRDB）的主要機構有：

1．國際艾滋病協會（IAS, http://www.iasusa.org）。

2．美國斯坦福大學（HIVDB, http://hivdb.stanford.edu）。

3．法國國家艾滋病研究署（ANRS, http://www.hivfrenchresistance.org/index.html）。

4．比利時Leuven大學Rega醫學研究所（REGA, http://www.kuleuven.ac.be/rega/cev/）。

（七）檢測結果的分析解釋

1．耐藥相關的基因突變 分基因區報告耐藥相關的基因突變，可將蛋白酶（PRO）和反轉錄酶（RT）兩個基因區的基因突變分開報告?；蛲蛔儽硎痉绞綖椤白帜?數字-字母”，第1個字母代表野生型病毒株特定密碼子處的氨基酸，第2個字母代表在特定密碼子處替換了的氨基酸。

2．耐藥程度分析 每個HIV-1耐藥基因型解釋系統對耐藥程度的報告是不同的：HIVDB系統分為敏感（S）、潛在耐藥（P）、低度耐藥（L）、中度耐藥（I）和高度耐藥（H）5個水平。Rega、ANRS和商品化試劑盒所采用的系統則分為敏感（S）、可能耐藥（I）和顯示耐藥（R）3個水平。

3．其他 當耐藥毒株在個體內病毒群體中的比例低于10%～20%時，通常檢測不到其存在。因此，當在HIVDB、Rega或ANRS系統中報告為“S”，只可報告本次實驗結果為“未發現耐藥”，不能報告為“敏感”。

七、HIV-1的分離培養

一般采用靶細胞（HIV陰性者外周血淋巴細胞，PBMC）與受檢者標本（PBMC、全血、血漿、精液及其他體液）共培養的方法，最常用的方法是PBMC共培養。

1．靶細胞制備 取HIV陰性者的抗凝全血，采用密度梯度離心的方法分離PBMC，并在含有適量天然白細胞介素-2（IL-2）和植物血凝素（PHA-P）的培養基中培養3日，使淋巴細胞由靜止狀態充分活化。

2．建立共培養 將靶細胞與待檢樣本混合，在合適的條件下培養，培養過程中適時換液或補加新鮮靶細胞，維持培養28日。

3．監測病毒生長 定時取適量培養上清液，檢測HIV-1P24抗原或反轉錄酶活性；也可定期觀察細胞的形態，看有無HIV特征性的合胞體或其他細胞病變。

4．病毒鑒定 取培養上清液提取純化RNA，或取共培養的PBMC提取純化基因組DNA，用PCR方法擴增HIV-1特征性基因片段，對擴增陽性的片段進行基因序列測定。

5．判定結果和解釋 培養上清液P24抗原或反轉錄酶連續2次呈陽性反應、并有P24抗原含量/反轉錄酶活性升高，或同時出現HIV特征性細胞病變，并經鑒定為HIV基因序列，判為HIV-1分離陽性；培養上清液P24抗原或反轉錄酶始終為陰性，判為HIV-1分離陰性。HIV-1分離培養陽性可以確證為HIV-1感染，分離培養陰性不能排除HIV-1感染。