包含體（inclusion bodies，IBs）是外源蛋白在宿主系統中高水平表達時形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，直徑0.1～3.0μm，呈現出無規則或類晶體的結構，難溶于水，可溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。在顯微鏡下觀察時為高折射區，與胞質中其他成分有明顯區別。包含體主要成分一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、外膜蛋白、脂類、脂多糖、核酸等雜質。重組蛋白是非折疊狀態的聚集體，不具有生物學活性，因此要獲得具有生物學活性的蛋白質，必須將包含體溶解，釋放出其中的蛋白質，并進行蛋白質的復性。蛋白質的復性是一個世界性的難題，沒有通用的方法，這無疑加大了下游工作的難度。但以包含體的形成表達的重組蛋白與可溶形式表達重組蛋白相比，也具有一定的優勢：即包含體表達可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解；可降低胞內外源蛋白的濃度，有利于表達量的提高；包含體中雜蛋白含量較低，有利于分離純化；表達對宿主細胞有毒害的蛋白質時，包含體形式無疑是最佳選擇等。因此，只要解決蛋白質復性問題，即將無活性的包含體在體外成功轉變成為有生物學活性的蛋白質，將成為大量生產重組蛋白質最有效的途徑。目前，較成功的包含體形式表達蛋白開發成為產品的有重組人白細胞介素-2（rhIL-2）和重組人干擾素α（rhIFNα）等。

重組蛋白在宿主系統中高水平表達時，無論是用原核表達體系或酵母表達體系甚至高等真核表達體系，都可能形成包含體。包含體形成比較復雜，目前關于包含體的形成機制尚未完全清楚，一般認為與胞質內蛋白質生成速率有關，新生成的蛋白質合成速度過快，無充足的時間進行折疊，二硫鍵不能正確地配對，從而形成非結晶、無定形的蛋白質聚集體；重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子或環境不適，導致無法形成正確折疊；重組蛋白的氨基酸中含硫氨基酸越多越易形成包含體，而脯氨酸的含量明顯與包含體的形成呈正相關；重組蛋白是大腸埃希菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，而使中間體產物大量積累，導致包含體形成及 E. coli胞質內酸性成分與外源蛋白的緊密結合促進蛋白聚合。包含體形成的動力學控制過程，可用下述競爭反應動力學描述（圖4-5）。

由模型可知包含體的形成反應在分子間發生，其反應速率與濃度成正比。當形成天然構象蛋白速度緩慢，新生肽濃度增加和中間肽的疏水性相互作用都可能導致包含體的形成。此外，包含體的形成還被認為與宿主菌的培養條件，如培養基成分、溫度、pH、誘導劑等因素有關。因此，為增加重組蛋白的可溶性表達量，一般常采用降低底物濃度及溫度控制生長速率；發酵液pH遠離蛋白的等電點；通過流加誘導劑控制誘導劑濃度及添加促可溶性表達的生長添加劑（多醇類、蔗糖）等方法。

破碎細胞釋放出以包含體形式存在的目標蛋白，包含體為致密凝聚體，密度較大，低速離心或過濾即可與可溶性蛋白及細胞碎片等分離。在粗制包含體中，除了目標蛋白外還含有脂類、脂多糖、核酸和膜蛋白等雜質，且脂類及部分破碎的細胞膜及膜蛋白與包含體粘連在一起，因此在溶解包含體前應先洗滌包含體。通常用低濃度的變性劑如2mol/L尿素（或鹽酸胍）在50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA（pH7.0～8.5）中洗滌。低濃度的尿素和鹽酸胍能夠增加部分雜蛋白質的溶解性，從而可以選擇性地去除被溶解的雜蛋白；EDTA的主要作用為螯合金屬離子，減少對目標蛋白進一步氧化作用，同時還能起到破壞細胞內膜的作用。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。經過洗滌，包含體的主要成分為集聚態的不溶解于水溶液的目標蛋白，其電泳純度一般高于60%。

包含體中蛋白質的聚集主要是由疏水作用力、氫鍵、離子鍵和二硫鍵等維持。因此溶解包含體常要考慮變性劑的濃度、溫度、作用時間、溶液離子強度、pH以及蛋白質濃度與變性劑濃度之比等因素。常用的變性劑有尿素（8～10mol/L）、鹽酸胍（6～8mol/L），通過離子間的相互作用，破壞包含體蛋白間的氫鍵，引起天然構象解體而溶解包含體蛋白，變性不涉及共價鍵的破裂，一級結構保持完好。尿素、鹽酸胍屬中強度變性劑，易經透析和超濾去除，其中鹽酸胍的增溶效果較尿素好。有些蛋白質含有兩個以上二硫鍵，這種情況下還需添加還原劑切斷二硫鍵。常用還原劑是二硫蘇糖醇（DTT）和β-巰基乙醇（β-ME）和還原型谷胱甘肽，濃度一般為1～50mmol/L，另外還需要EDTA螯合金屬離子，來防止目的蛋白在溶解過程中過度氧化。還可以添加去垢劑如十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），可以破壞蛋白質內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于SDS無法徹底地去除而不允許在制藥過程中使用。還可以采用極端pH破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，但只適合于少部分蛋白的增溶。尿素在堿性環境中不穩定，一般調節pH 8.0～9.0，最好是現用現配，增溶時一般在磁力攪拌下室溫過夜；鹽酸胍的增溶性較尿素強，一般在37℃、1小時便可使多數蛋白質完全變性溶解。

蛋白質復性又稱再折疊，是指變性蛋白質在變性劑去除或濃度降低后，就會自發地從變性的熱力學不穩定狀態向熱力學穩定狀態轉變，形成具有生物學功能的天然結構。一般蛋白質的復性收率僅為20%～40%，因此復性是以包含體形式存在的重組蛋白生產最為關鍵的技術之一，是限制包含體形式表達產物產業化的瓶頸。

一個有效的、理想的復性方法應具有活性蛋白質的回收率高；正確復性的產物易于與錯誤折疊蛋白質分離；折疊復性后可得到濃度較高的蛋白質產品；復性方法周期短；易于放大等特點。迄今為止，不同重組蛋白質其具體適用的復性方法和條件各不相同，尚無可以普遍應用于每種蛋白質的復性方法。現將常用的復性方法介紹如下：

直接加入水或緩沖溶液，放置過夜即可，是最簡單有效的復性方法。缺點是體積增加較大，一般稀釋40～50倍；變性劑稀釋速度過快，不易控制。采用的方式一般有一次稀釋、分段稀釋和連續稀釋三種方式。

透析是將變性溶解的包含體蛋白置于透析袋中，通過緩沖液交換的方法，除去變性劑使蛋白質折疊復性。透析復性一般不增加體積，但耗時長，不適合大規模生產且容易形成沒有活性的蛋白質聚集體。采用的方式一般有直接透析法和梯度透析法，與直接透析法相比，使用梯度透析的方法可以取得較高的復性收率。

選擇合適截留分子量的膜，允許變性劑通過而不允許蛋白質通過，去除變性劑，使蛋白復性。優點是蛋白濃度保持不變，處理量大，易于控制透析速度。缺點是易造成膜污染，有些蛋白在超濾過程中會產生不可逆變性。

近幾年，層析復性是研究較多并成功應用于生產中的一種色譜復性技術，該技術是通過將變性溶解的包含體蛋白上樣，并經過梯度洗脫及改變pH等方法，逐漸去除變性劑使蛋白恢復天然結構，并與其他雜蛋白進行分離。與傳統的稀釋和透析復性方法相比，柱上層析自動化程度高、重現性好，復性樣品處理量大，可實現高濃度復性，利于產業化；有效地限制和減少了聚集反應，有利于提高復性率；復性和純化過程同步完成，縮短生產周期。常用的方法有離子交換法（IEC）、凝膠過濾層析法（GFC）、疏水層析法（HIC）、親和層析法（AFC）等。

離子交換法是利用離子交換劑為固定相，利用變性蛋白與固定相之間所帶電荷不同，變性蛋白吸附于固定相表面，從而避免了復性過程中蛋白質的聚集作用。并在洗脫過程中通過吸附-解吸附-再吸附的過程，促使變性蛋白向有活性的天然形式轉變，與其他雜蛋白相分離。并進一步發展了雙梯度離子交換層析復性蛋白質的方法，通過在洗脫的過程中逐漸降低變性劑濃度和調節pH，提高活性收率，上樣量大，適合于規模化生產。

凝膠過濾層析復性又稱體積排阻復性（SEC），是利用有一定孔徑的凝膠為固定相，根據包含體溶液中目標蛋白與變性劑相對分子質量的差別，在固定相中兩者洗脫速率不同，達到去除變性劑使目標蛋白復性的目的。凝膠過濾復性時，蛋白質與介質之間并不發生其他任何作用，復性過程始終發生在溶液中。隨著變性劑和蛋白質濃度降低，變性蛋白質分子開始復性，并開始在液-固兩相間進行分配。蛋白質分子量大先流出，變性劑分子量小后流出。此外在脲梯度SEC的基礎上發展了pH和脲濃度雙梯度法用于蛋白復性。與常用的稀釋復性法相比，凝膠過濾層析復性能在高的起始蛋白濃度下對蛋白進行復性，活性回收率較高，同時又能使目標蛋白得到一定程度的純化，但上樣量僅為柱床體積的10%，不適用于規模化生產。

疏水色譜是利用疏水性吸附劑為固定相，利用蛋白質與介質間疏水性相互作用的差別進行蛋白質分離純化。蛋白質變性后，疏水基團暴露在分子表面，進入HIC柱后，變性蛋白被固定相吸附，隨洗脫液離子強度的減小，不斷地在固定相表面上進行吸附-解吸附-再吸附，并在此過程中促使蛋白質發生折疊逐漸被復性。蛋白活性收率較稀釋、透析復性有較大程度提高。HIC在蛋白質復性的同時還能與其他雜蛋白進行很好的分離，快速簡便，具有很好的發展潛力。

親和層析是利用固定相中的配體與目的蛋白質間特異性吸附作用，將目的蛋白與變性劑分離，并在洗脫過程中實現蛋白復性。按照偶聯親和配體不同分為可分為金屬離子親和層析、分子伴侶親和層析及脂質體親和層析等。

利用擴張床的吸附層析直接從變性蛋白中捕獲并復性目的蛋白。當變性蛋白以一定流速通過吸附床，實現床層的膨脹但不流化，細胞碎片和不吸附的雜質流穿，目的蛋白吸附在固定相上，用含有變性劑的緩沖溶液清洗殘余雜質，再用不含變性劑的緩沖溶液洗掉變性劑。當擴張床沉降后，再用緩沖溶液將目的蛋白洗脫下來并得以復性。該方法具有處理量大、蛋白濃度高、減少操作步驟及可重復生產的優點。

雙水相體系中加入鹽酸胍，再加入變性蛋白質溶液，使其向某一水相分配過程中逐漸得以復性，直到蛋白質的折疊與去折疊達到一個平衡。

由于蛋白質在反膠束內水相中可以保持其構象和活性，運用相轉移技術可以將蛋白質分子包于反膠束內，有效避免蛋白質間的相互聚集作用，通過逐漸降低變性劑的濃度和加入氧化-還原劑，可使變性蛋白質二硫鍵再氧化重排得到復性，再去除表面活性劑，即可獲得高活性蛋白質。

蛋白質復性是非常復雜的過程，復性收率的高低既與蛋白質本身性質相關，也與變性蛋白的濃度、pH、復性時間、溫度等相關環境因素和操作條件相關。在復性過程中為增加復性效率，通過添加不同化合物，抑制無規則聚集來促進蛋白復性。復性常用的添加劑及其作用見表4-9。

蛋白質復性過程易發生錯誤折疊、聚集，形成多聚體或異構體等影響蛋白的活性及安全性。因此應根據蛋白的性質和需要從生化、免疫、活性、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測（表4-10）。