細胞破碎（cell rupture）是指通過物理、化學、酶或機械的方法破壞細胞壁或細胞膜，使胞內(nèi)產(chǎn)物獲得最大程度的釋放，是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎。由于采用的表達系統(tǒng)不同或采用的DNA重組技術不同，目的蛋白表達的定位也不同（胞內(nèi)、細胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外）。分泌到胞外的產(chǎn)物，不需破碎，其分離和純化都相對簡單。但許多生物活性物質(zhì)結(jié)構復雜，如果分泌到培養(yǎng)液中其活性往往會改變，必須在細胞內(nèi)組裝來獲得生物活性。因此在選擇破碎方法時不僅考慮細胞破碎效果和產(chǎn)物釋放率，還要考慮產(chǎn)物的穩(wěn)定性和易于后期純化及破碎的規(guī)模與成本。

細胞破碎目的是使胞內(nèi)產(chǎn)物獲得最大程度的釋放。由于各種生物的細胞壁結(jié)構和組成不完全相同，因此細胞破碎的難易程度也不同。另外，不同的生化物質(zhì)，其穩(wěn)定也存在很大差異，在破碎過程中應防止其變性或被胞內(nèi)酶水解。因此選用適宜的破碎設備和破碎方法，對后期的純化起很大作用。常用細胞破碎方法見表4-8。

機械破碎主要靠擠壓、剪切和撞擊作用，具有處理量大、破碎效率高、速度快等優(yōu)點，是工業(yè)規(guī)模細胞破碎的主要手段。常用機械破碎方法主要包括高壓勻漿法、珠磨法和超聲波破碎法等方法。

高壓勻漿器是常用的設備，它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵和排出閥組成。物料在柱塞作用下通過止逆閥進入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的特定寬度的限流縫隙中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速沖擊，產(chǎn)生空穴效應、撞擊效應和剪切效應等多種作用，把原先比較粗糙的乳狀液或懸浮液加工成極細微分散、均勻、穩(wěn)定的液-液乳化物或液-固分散物（圖4-3）。

高壓勻漿破碎細胞影響因素有操作壓力、懸浮液的黏度、料液溫度。在一定范圍內(nèi)，提高壓力可增加破碎率，減少操作次數(shù)。但壓力過高，溫度難以控制。一般壓力每上升10MPa，溫度上升2℃。因此在操作方式上，一般采用在一定壓力下多次循環(huán)通過等方式連續(xù)操作。為了控制溫度的升高，可外置冷卻循環(huán)裝置調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20℃左右。一般大腸埃希菌破碎在壓力為80MPa條件下循環(huán)兩次，細胞即可完全破碎；酵母一般在100MPa條件下循環(huán)兩次，破碎率達到95%以上。高壓勻漿法適用于酵母、大腸埃希菌、巨大芽胞桿菌和黑曲霉等，但較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌、較小的革蘭陽性菌以及有些質(zhì)地堅硬的亞細胞器易損傷勻漿閥，不適合用該法處理。

高速珠磨機的破碎腔由夾套組成，夾套內(nèi)通冷卻劑可以移出細胞破碎時產(chǎn)生的熱量。破碎腔內(nèi)裝有直徑極細的無鉛玻璃珠、石英砂、氧化鋯或其他材質(zhì)的微珠。當啟動電機后，玻璃珠隨攪拌槳轉(zhuǎn)動而進行各種形式的運動。由于球體之間以及球體與罐壁之間的摩擦作用，使得球體隨罐壁轉(zhuǎn)動上升到一定高度后以拋物線方式往下落，從而珠子與細胞之間產(chǎn)生了撞擊和剪切效應，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在細胞勻漿液出口處設置了珠液分離器滯留珠子，使珠液分離，破碎能夠連續(xù)進行（圖4-4）。

珠磨法操作的有效能量利用率僅為1%左右，破碎過程產(chǎn)生大量的熱能，因此必須要選用夾套冷卻裝置，降低物料的溫度。一般破碎細胞操作方法分為間歇和連續(xù)操作，適用于絕大多細菌、真菌菌絲和藻類等微生物細胞的破碎。與高壓勻漿法相比，影響破碎率的操作參數(shù)較多，如攪拌速度、料液的循環(huán)速度、細胞懸浮液的濃度、珠粒大小和數(shù)量及溫度等，操作過程的優(yōu)化設計較復雜。一般破碎細菌多采用0.1mm的玻璃珠；破碎酵母、藻類和組織培養(yǎng)細胞用0.5mm的玻璃珠；動植物的組織用1mm的玻璃珠。

超聲波破碎細胞的原理是將電能通過換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能量通過液體介質(zhì)（如水）而變成一個個密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，產(chǎn)生空化效應，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，從而起到破碎細胞等物質(zhì)的作用。超聲波通常在15～25kHz的頻率下操作，具有頻率高、波長短、定向傳播等特點，但該方法由于處理量小、產(chǎn)熱高、時間長、噪聲大及超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使一些敏感性活性物質(zhì)變性失活，一般僅限于實驗室規(guī)模。

超聲波破碎細胞受多種因素的影響，如：超聲探頭的形狀和材料、聲頻、聲能、體積、破碎時間、細胞黏度等因素。此外介質(zhì)的離子強度、pH和細胞類型也有很大影響。如桿菌比球菌易破碎，革蘭陰性菌比陽性菌易破碎，而酵母的破碎效果較差。一般超聲操作在冰浴下進行短時破碎，細胞濃度應低于20%，一般破碎1～2分鐘，冷卻1～2分鐘以上。超聲破碎所需時間根據(jù)產(chǎn)物而不同，有些僅需每次1分鐘，2～3次，而一些細胞破碎需10次以上。超聲波破碎也可與其他方法結(jié)合使用，如凍融方法，可節(jié)省超聲波破碎的時間。

包括物理法（干燥法、反復凍融法、滲透壓沖擊法）、化學法、酶溶法等，其中化學法和酶溶法應用最為廣泛。

主要原理是使細胞結(jié)合水分喪失，其細胞膜的滲透性發(fā)生變化，同時部分菌體會產(chǎn)生自溶，然后用有機溶劑如丙酮、丁醇或緩沖溶劑處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就會被抽提出來。干燥法可分為空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。酵母常在空氣中干燥（25～30℃），再用其他溶劑抽提；細菌適用于真空干燥，把干燥成塊的菌體磨碎再進行抽提；冷凍干燥適用于制備不穩(wěn)定的生化物質(zhì)，在冷凍條件下磨成粉，再用緩沖液抽提。干燥法條件變化劇烈，易引起蛋白質(zhì)或其他組分變性，應用受到限制。

主要原理是在冷凍條件下促使細胞膜的疏水鍵結(jié)構破裂，從而增加細胞的親水性能；另一方面冷凍時胞內(nèi)水結(jié)晶，胞內(nèi)冰晶引起細胞膨脹破裂。一般操作是將細胞急劇凍結(jié)至-20～-15℃，使之凝固，然后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)-融化操作反復進行多次，使細胞受到破壞。該法較溫和，但需要反復凍融，周期長且破碎率較低，僅適用于細胞壁較脆弱的菌體。在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性，不適合對冷凍敏感的目的產(chǎn)物。

主要原理是由于滲透壓劇烈改變，使細胞快速膨脹破裂。一般操作過程中首先將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)如一定濃度的甘油或蔗糖溶液，使之脫水收縮，當達到平衡后，將介質(zhì)突然稀釋或?qū)⒓毎D(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖溶液中，由于滲透壓的突然變化，細胞外水分迅速進入細胞內(nèi)，引起細胞溶脹，甚至破裂，它的內(nèi)含物隨即釋放到溶液中。該法細胞破碎率低，僅適用于不具有細胞壁或細胞壁較脆弱的細胞，不適用于革蘭陽性菌。

是使用某些化學試劑如酸堿、有機溶劑、變性劑、表面活性劑、金屬螯合劑等，改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來。化學法對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)，碎片少，漿液黏度低，易于固液分離和進一步提取。但有些試劑有毒，且易引起活性物質(zhì)的失活變性。

用堿處理可溶解除去細胞壁以外的大部分組分，酸處理可使蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸。酸堿還可以調(diào)節(jié)溶液的pH，改變蛋白質(zhì)的電荷特性，提高產(chǎn)物的溶解度，便于后面的提取。

分解細胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。如丙醇、丁醇、三氯甲烷等。但有機溶劑易引起蛋白質(zhì)變性失活，使用時應考慮其穩(wěn)定性，操作時應在低溫下進行。

通過變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。常用變性劑有鹽酸胍和脲。

可促使細胞某些組分溶解，改變膜的通透性，其增溶作用有助于細胞的破碎。常用的表面活性劑有曲拉通 X-100、十二烷基磺酸鈉、吐溫40、吐溫80等。

用EDTA處理革蘭陰性菌，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴，對細胞外層膜有破壞作用。

是利用酶反應分解、破壞細胞壁上的特殊化學鍵以達到破壁的目的。即利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步提高其對胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。該法操作溫和，選擇性強，酶能快速地破壞細胞壁，而不影響細胞內(nèi)含物的質(zhì)量，但酶的費用高，通用性差，因而限制了它在大規(guī)模生產(chǎn)中的應用。常用的溶酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等。一般細胞壁溶解酶是幾種酶的復合物。

自溶作用是酶法的另一種方式，它是利用微生物自身產(chǎn)生酶來溶菌，而非外加其他酶。通過調(diào)節(jié)溫度、時間、pH、激活劑和細胞代謝途徑等誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達到細胞自溶的目的。

細胞破碎率定義為被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：

式（4-1）中， Y（%）為細胞破碎率； N ₀為原始細胞數(shù)量； N為經(jīng) t時間操作后保留下來的未損害完整細胞數(shù)量。

破碎率的檢測對于細胞破碎效果的評估、破碎工藝的選擇、工藝放大和工藝條件的優(yōu)化起非常重要的作用。常用的檢測細胞破碎程度的方法有直接計數(shù)法、間接計數(shù)法和測定電導率法等。

一般采用涂片染色的方法，將完整細胞與破碎細胞區(qū)分開來，通過顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù)破碎前后完整細胞的數(shù)量。如采用革蘭染色方法，完整的酵母細胞呈紫色，受損的酵母細胞呈亮紅色，加以區(qū)別。

間接計數(shù)法是在細胞破碎后，測定懸浮液離心上清中蛋白質(zhì)含量或特定酶的活力，直接與100%破碎時的標準值比較，間接計算出細胞的破碎率。另外也可以用離心細胞破碎液觀察沉淀模型的方法，即完整的細胞壁比細胞碎片先沉淀下來，并顯示不同的顏色和紋理。對比兩項，可間接計算細胞破碎率。

當細胞內(nèi)含物釋放到緩沖液中時，電導率將發(fā)生變化且電導率與細胞破碎率呈線性關系，即隨電導率的增加破碎率相應增加。但因該法受到多種因素影響，因此應預先用其他方法來標準化。