- 基因工程藥物研究與應用
- 李校堃主編
- 17040字
- 2021-04-16 15:28:42
三、蛋白質分離純化方法
(一)沉淀法
是采取適當措施改變溶液的理化參數，控制溶液中各種成分的溶解度，從而將溶液中的欲提取成分和其他成分分開的技術，也稱溶解度法。沉淀是一不固定形的顆粒，除含有目標蛋白外，還夾雜其他雜蛋白、鹽等，構成成分復雜，一般常用于蛋白的初步提純。常用的沉淀法包括鹽析沉淀法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法、聚乙二醇沉淀法、選擇性變性沉淀法等多種方法，可根據蛋白的不同性質選擇。下面以鹽析法為主，介紹各種沉淀方法。
1.鹽析沉淀法
蛋白質是親水性大分子，所以在水溶液中有雙電層結構，來保證分子的溶解度平衡并穩定存在。當加入鹽時，鹽會電離成離子態，溶液中高濃度的中性鹽離子有很強的水化能力，會奪取蛋白質分子的水化層，使蛋白質膠粒失水，破壞了蛋白質的雙電層結構，發生凝集而沉淀析出。不同的蛋白質在同一濃度鹽溶液中的溶解度不同，可利用不同濃度的鹽溶液使不同蛋白質成分分別析出。鹽析法是最早使用的生化分離手段之一，具有安全、經濟、不需特殊設備、操作簡便、不易引起蛋白質變性等優點。但鹽析法分辨率不高，沉淀物中含有大量鹽析劑，后期的純化銜接有條件性，因此一般用于破碎后蛋白的初步分離。鹽析法分離蛋白質有兩種方法：一種即在一定pH和溫度條件下改變離子強度進行鹽析（Ks分級鹽析法），這種方法可使被鹽析物質溶解度劇烈下降，易產生共沉淀現象，分辨率不高，常用于蛋白質的粗分離；另一種方法是在一定離子強度下改變pH和溫度進行鹽析（β分級鹽析法），這種方法可使被鹽析物質溶解度變化緩慢且變化幅度小，分辨率較高。
（1）鹽析沉淀的影響因素 1）無機鹽的種類：
在相同離子強度下，不同種類鹽對蛋白質的鹽析效果不同。一般離子半徑小而帶電較多的陰離子的鹽析效果較好，如高價鹽離子鹽析作用較低價鹽強，陰離子比陽離子鹽析作用好。常見陰離子鹽析作用順序為 
＞ 
＞F -＞CH 3COO -＞Cl -＞Br -＞ 
＞ 
＞I -＞SCN -；常見陽離子鹽析作用順序為Al 3＋＞H ＋＞Ca 2＋＞NH 4 ＋＞K ＋＞Na ＋＞Mg 2＋。
＞ ＞F -＞CH 3COO -＞Cl -＞Br -＞ ＞ ＞I -＞SCN -；常見陽離子鹽析作用順序為Al 3＋＞H ＋＞Ca 2＋＞NH 4 ＋＞K ＋＞Na ＋＞Mg 2＋。
選擇鹽析用無機鹽時要考慮以下幾點：有足夠大溶解度，能配制高離子強度鹽溶液，且溶解度受溫度影響應盡可能小；鹽析作用要強。一般選擇多價陰離子鹽；在生物學上是惰性的，不影響蛋白質等生物大分子的活性；來源豐富、經濟、安全。
蛋白質鹽析常用的中性鹽主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等（表4-11）。
表4-11 常用中性鹽在水中的溶解度%（g/100ml）
在蛋白質鹽析中，硫酸銨是最常用的中性鹽，它溶解度大且受溫度影響小（25℃時飽和溶液為4.1mol/L，即767g/L；0℃時飽和溶解度為3.9mol/L，即676g/L），不易引起蛋白質（酶）變性，價廉易得。但硫酸銨水解后使溶液pH降低，在高pH下釋放氨氣，腐蝕性強，后處理困難。一般硫酸銨溶液調高pH時選用氨水溶液。其他鹽析劑如硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鹽等，具有較強的緩沖能力，但其溶解度隨溫度變化明顯，常達不到使蛋白質析出的濃度。與硫酸銨相比價格貴、溶解度低且易與某些金屬離子生成沉淀，所以應用受限。
2）鹽離子濃度：
當鹽離子濃度較低時，可促進蛋白質分子與水分子間的作用，使蛋白質溶解度增大；當鹽濃度達到某一值后，隨鹽濃度的增加，蛋白質溶解度不斷降低。因此，采用鹽析方法時，鹽離子要達到一定濃度，蛋白質才能沉淀析出。
3）溶質濃度的影響：
在相同鹽析條件下，蛋白質濃度越大越易沉淀，使用鹽的飽和度的極限愈低，越容易沉淀，但其他成分也隨目的蛋白一起沉淀出來即發生共沉淀現象，使分辨率降低。相反，溶液中蛋白質濃度過低時，雖共沉淀作用小，分辨率較高，但反應體積加大，所需用鹽量增加，蛋白質回收率降低。因此鹽析前首先要調節蛋白質溶液的濃度，一般常將蛋白質溶液濃度控制在2.0%～3.0%（g/100ml）較為適宜。
4）溫度的影響：
大多數情況下，在一定溫度范圍內，物質的溶解度隨溫度的增加而增加，但溶液的離子強度增加后，可能會出現相反的現象。鹽析時的溫度選擇應以不影響蛋白質的活性為準則。由于高濃度鹽溶液對蛋白質有一定保護作用，除對溫度敏感的蛋白質在低溫（0～4℃）操作外，一般可在室溫中進行。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25℃）比0℃時溶解度低，更容易鹽析。
5）pH的影響：
蛋白質表面所帶靜電荷越多，分子間的排斥力越強，生物分子不容易聚集，溶解度就越大。當表面靜電荷為零時即在等電點時，分子間的排斥力小，易聚集沉淀，此時溶解度最低。因此在不影響蛋白質的活性的情況下，往往選擇pH在目的物等電點附近。這樣既可減少中性鹽的消耗，又提高了蛋白收率，同時也可減少共沉作用。同時希望溶液中目的蛋白不被析出，也可選擇溶液的pH偏離該成分的等電點遠一些。
（2）鹽析的操作方法：
硫酸銨是一中性鹽，對蛋白質有相當好的安定作用，又因為其離子容積較大，吸走水分子的能力也大，成為最常用的蛋白質鹽析沉淀劑。硫酸銨的加入方式分兩種，即直接加入固體硫酸銨法和加飽和硫酸銨溶液法。
1）直接加入固體硫酸銨法：
在大規模生產過程中，溶液體積大或所需硫酸銨的濃度較高時，可采用這種方式，以減少溶液體積的變化。在操作過程中，首先應將固體硫酸銨研成細粉，加入速度不宜太快，少量多次分批加入，并充分攪拌使其完全溶解，防止局部濃度過高。攪拌過程應溫和，防止蛋白質起泡變性。為達到所需的飽和度，加入硫酸銨質量可按式（4-2）計算：
式（4-2）中， W為1L溶液應加入硫酸銨質量（g）； G為飽和溶液中含鹽量，0℃時為515g，20℃時為513g； S 1、 S 2為初始溶液和最終溶液的飽和度（%）； A為常數，0℃時為0.227，20℃時為0.29。
2）加飽和硫酸銨溶液法：
硫酸銨的飽和濃度為4.1mol/L（即767g/L，25℃），飽和硫酸銨配制方法為加入過量的硫酸銨，如取800～850g硫酸銨分批加入到1000ml水溶液中，加熱至50～60℃保溫數分鐘，趁熱濾去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1～2天，有固體析出時即達100%飽和度。一般飽和硫酸銨溶液的pH在4.5～5.5之間，需用氨水或硫酸調節pH后備用。加入飽和硫酸銨體積可按式（4-3）計算：
式（4-3）中， V為應加入硫酸銨飽和溶液體積（L）； V 0為蛋白質溶液的原始體積（L）； S 1、 S 2為初始溶液和最終溶液的飽和度（%）。
加飽和硫酸銨溶液法，通常在實驗室或小規模生產或硫酸銨濃度不需要太高時，可采用這種方式，它可以防止溶液局部濃度過大，但溶液體積往往被增大，不利于下一步分離純化（表4-12，表4-13）。
表4-12 25℃時硫酸銨水溶液由原來的飽和度達到所需飽和度時，每升硫酸銨水溶液應加硫酸銨的克數
表4-13 0℃時硫酸銨水溶液由原來的飽和度達到所需飽和度時，每升硫酸銨水溶液應加硫酸銨的克數
對分離目的蛋白的鹽析操作，分級鹽析法是最適宜的方法。它通過改變鹽的濃度與溶液的pH，可將混合液中的不同性質的蛋白逐步分開。具體操作實例如下：首先要進行試驗探索，如：先進行0～30%的硫酸銨沉淀，再進行30%～60%的硫酸銨沉淀，最后進行60%～80%的硫酸銨沉淀；每一段鹽析靜置之后都離心，將上清和沉淀分別進行電泳。通過試驗結果可以看出哪一段鹽析出來的目的產物最多，相對來說雜質就更少。比如試驗中的目標蛋白主要在60%～80%這段出來，那么就可確定在0～60%的硫酸銨沉淀可以拋棄，然后進行60%～80%的硫酸銨沉淀并將其收集進行下一步純化工作。
蛋白質在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入透析袋內，用緩沖液進行透析，在低溫中進行，并每隔4～6小時更換緩沖液。該法透析所需時間長，緩沖液的體積需求量大。也可用葡萄糖凝膠G-25、G-50或S-100等凝膠過濾除鹽；也可直接串聯疏水柱層析方法進行進一步純化。
2.有機溶劑沉淀法
親水性的有機溶劑能降低溶液的介電常數從而增加蛋白質分子上不同電荷的引力，導致溶解度的降低，易聚集形成沉淀；另外，有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，能破壞蛋白質的水化膜，降低了它的親水性，導致脫水聚集。該法易于沉淀分離，分辨力比鹽析法好，溶劑易除去，但容易引起蛋白質變性。它常用于蛋白質或酶的提純，使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。
影響有機溶劑沉淀因素：
（1）有機溶劑的種類和用量：
選擇的有機溶劑一般能與水無限混合，介電常數小，沉淀作用強，毒性小，易于去除，最重要的是不能使蛋白質變性失活。常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等，其中乙醇由于無毒、沉淀作用強、易于去除，而廣泛應用。進行有機溶液沉淀時，欲使溶液達到一定有機溶劑濃度，需加入的有機溶液的體積可按式（4-4）計算：
式（4-4）中， V為需要加入有機溶液的體積（L）； V 0為原溶液體積（L）； S 1、 S 2：原溶液中有機溶液的濃度和需要達到的有機溶液的濃度（%）。
（2）溫度的影響：
有機溶劑與水混合時會釋放熱量，因此操作過程中應先將蛋白質溶液冷卻，并將有機溶劑冷卻至更低溫度（一般-10℃以下），并在充分攪拌下緩慢加入有機溶劑，避免溫度升高及局部濃度過高引起蛋白質變性。一般沉淀0.5～2小時后即進行沉淀分離，并真空抽出殘余有機溶劑或加入大量緩沖液進行稀釋。
（3）pH的影響：
溶液的pH盡量在目的蛋白的等電點附近，可增加沉淀效果。但pH選擇首先要考慮蛋白的穩定性，同時還要使溶液中大多數蛋白質帶有相同電荷，避免共沉淀現象的發生。
（4）樣品的濃度的影響：
樣品的濃度較高時易產生共沉淀現象，分辨率不高；而樣品的濃度過稀，溶劑用量大，樣品收率低。一般將蛋白質溶液濃度控制在1.0%～2.0%（g/100ml）較為適宜。
（5）離子強度的影響：
較少的無機鹽可以起到助沉劑，甚至保護蛋白質的作用。常用的無機鹽為單價鹽如氯化鈉、醋酸鈉、醋酸銨等，離子濃度一般為0.01～0.05mmol/L。當溶液中鹽濃度較高時（0.2mmol/L以上），會增加蛋白質的溶解度，增加有機溶劑的加入量。因此當溶液中無機鹽的含量較高時應先除鹽。
（6）某些金屬離子的影響：
某些多價陽離子能與蛋白質形成復合物，使得其溶解度大大降低，使沉淀更加完全，減少有機溶劑的用量。常用的有硫酸銅、硫酸鋅、醋酸鋅等試劑。使用過程中，常先去除雜蛋白，再加入金屬離子。
3.等電點沉淀法
是利用蛋白質在pH等于其等電點的溶液中溶解度下降、易產生聚集的原理進行沉淀分級的方法。可根據不同蛋白質的等電點差異進行分離，操作簡單，成本低，引入的外來雜質少，是一種常用的分離純化方法。該法操作需要在低離子濃度下調整溶液的pH，一般適用于疏水性較強、在等電點時溶解度很低的蛋白質，而對親水性很強的物質，由于在水中溶解度較大，仍不易產生沉淀。而且在等電點時，蛋白質一般沉淀不完全，同時許多蛋白質的等電點十分接近，故單獨使用此法收率低、分辨力差，效果不理想。一般多用于將蛋白質等電點相距較大的雜蛋白去除，實際工作中常把等電點沉淀和鹽析法、有機溶劑沉淀法聯合使用。
4.聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇（PEG）是一種水溶性的非離子型高分子聚合物，它能夠降低蛋白質水和作用，增強生物分子之間的靜電引力引起沉淀，同時聚乙二醇具有空間排斥作用，將生物分子“擠壓”到一起而引起沉淀。PEG的添加量與蛋白質的分子量相關，分子量越高，沉淀所需加入的PEG量越少。該法操作時，同樣受溫度、離子強度、pH、濃度等多種因素的影響。一般選用的PEG分子量應大于4000，常用分子量為6000～20 000，濃度為20%。聚乙二醇的去除常采用吸附法或沉淀法，將其與目的蛋白分離。
5.選擇性變性沉淀法
選擇性變性沉淀法是根據混合物溶液中各種分子在不同物理化學因子作用下穩定性不同的特點，選擇適當的條件（具有一定的極端性），使欲分離的成分存在于溶液中，而且保持其活性，其他成分（即雜質）由于環境的變化而變化，從溶液中沉淀出來，從而達到純化有效成分的目的。常用的選擇性變性沉淀法有熱變性沉淀法和酸堿性沉淀法。
6.其他沉淀方法
一種是成鹽沉淀法，它是根據生物大分子與小分子金屬離子或有機酸類可以生成鹽類復合物沉淀，從而進行分離。但可能會使蛋白質發生不可逆沉淀，使用該法時須謹慎。另一種是親和沉淀法，它是利用親和反應的原理，可選擇性與目的蛋白結合形成復合物，從而進行分離。
(二)色譜分離技術
色譜分離（chromatographic resolution，CR）又稱層析分離技術，是一種分離復雜混合物中各個組分的有效方法。該法利用多組分混合物中各組分物理化學性質（如分子極性、分子形狀和大小、等電點、分子親和力、疏水性等）的差別，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相中。當多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理化學性質的差別，具有不同的分配系數，當兩相作相對運動時，這些物質隨流動相一起運動，并在兩相間進行反復多次的分配，從而使各物質達到分離。近幾十年來，色譜技術得到飛速發展，因其分離效率好、靈敏度高、選擇性強、分離速度快、重復性好及實現自動化操作已成為生物物質分離和純化技術的關鍵組成部分，是生物下游加工過程最重要的純化技術。常用的色譜介質及其原理和應用如表4-14所示。常用純化術語解釋如表4-15所示。
表4-14 適用于規模化分離純化得主要色譜方法
續表
表4-15 常用純化術語解釋
1.凝膠過濾層析
凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography，GFC）是以多孔性物質作固定相，根據樣品分子大小不同從而達到分離的一種液相層析法。樣品分子與固定相之間不存在相互作用力（吸附、分配和離子交換等），因而凝膠過濾層析又常被稱作凝膠擴散層析、體積排阻層析、分子篩層析等。凝膠過濾層析具有許多優點，介質為不帶電荷的惰性物質，與被分離物質間無相互作用，因此分離條件溫和，回收率高，重現性好；分離范圍廣，可分離從幾百到數百萬分子量的物質；設備簡單，易于操作，可進行連續分離。但也存在分辨率不高、流速慢、受到上樣體積限制等缺點。一般在鹽析、濃縮后進行柱層析或往往用于目的蛋白的精細分離。目前廣泛應用于氨基酸、蛋白質、多肽、多糖及酶等生物物質的分離純化，相對分子量的測定及去除相關雜質如熱原、鹽類及其他小分子試劑。
（1）凝膠過濾層析原理：
凝膠過濾層析的基本原理是含有尺寸大小不等的樣品進入色譜柱后，比固定相孔徑大的溶質分子不能進入孔內，與流動相一起流出色譜柱；比固定相孔徑小的分子才能進入孔內而產生保留，溶質分子體積越小，進入固定相孔內的概率越大，在固定相中停留（保留）的時間也就越長。這種顆粒內部擴散的結果，使小分子移動減慢，從而根據樣品分子量大小的不同由大到小依次從柱內流出達到分離目的。
凝膠過濾層析是在裝有惰性多孔物質填料的玻璃柱中進行的。 V t為凝膠柱床體積； V 0為凝膠柱床中凝膠顆粒間的空隙體積或外水體積； V i為柱中凝膠顆粒內部所含液相體積，稱內水體積； V g為凝膠顆粒所占體積。 V t為 V 0、 V i、 V g之和，即
式（4-5）中， R為柱子內半徑； h為凝膠柱床高。
對某種物質在凝膠柱內的洗脫體積 V e與 V 0、 V i之間的關系可用式（4-6）表示，即：
式（4-6）中 K d為排阻系數或分配系數，反映物質分子進入凝膠顆粒程度。當 K d=1時，說明該物質分子量最小，完全在凝膠顆粒內部擴散，最后被洗脫下來，洗脫體積最大；當 K d= 0時，說明該物質分子量最大，完全不能進入凝膠顆粒內部，只能從顆粒間隙流過，稱全排阻，最先洗脫下來，洗脫體積最小，等于外水體積；當0＜ K d＜1時，說明溶質分子只有部分向凝膠顆粒內擴散；若 K d＞1，則說明該物質分子與凝膠有吸附作用。
（2）凝膠過濾介質：
凝膠過濾介質按骨架分為多糖類及樹脂類。多糖類主要為纖維素、葡聚糖及瓊脂糖等，樹脂類包括聚丙烯酰胺系、聚乙烯醇系等。作為凝膠過濾介質應具備以下條件：介質本身應為惰性物質，不與溶質、溶劑發生任何作用，親水性高；穩定性好，耐受較寬的pH和離子強度及壓力環境；凝膠顆粒大小均勻，介質內孔徑大小分布要均勻。
目前已商品化的凝膠過濾介質品種主要有：
1）葡聚糖凝膠系列：
葡聚糖是應用廣泛的一類軟凝膠，商品名為Sephadex。它是葡聚糖（右旋糖酐）與交聯劑環氧氯丙烷交聯而成的葡聚糖珠狀凝膠。交聯度決定凝膠孔穴大小，影響凝膠性能、分離范圍及效果。G型凝膠系列產品中，G后面的數字代表交聯度，數字越大交聯度越小，網孔越大，排阻極限亦越大，適合于分離分子量高的產品；數字越小交聯度越大，網孔越小適合于分離分子量低的產品。此外，該數字也代表凝膠持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5ml，G-100表示1g干膠持水10ml，依此類推。凝膠粒度分為粗、中、細、超細四種，由粗到細分辨率高，但流速變慢。
葡聚糖凝膠的化學性質較為穩定，在酸、堿溶液中穩定；可120℃高壓滅菌30分鐘不被破壞。常用的保存方法有濕法、干法、半縮法。濕法保存可在一定量的防腐劑或抑菌劑如0.02%疊氮鈉、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇或0.25mol/L氫氧化鈉等溶液中4℃短期保存；干法保存一般用濃度逐漸升高的乙醇分步處理（如20%～80%），使其脫水收縮，再抽濾除去乙醇，用60～80℃暖風吹干后可在室溫保存，但處理不好凝膠孔徑可能略有改變；半縮法保存可用60%～70%乙醇使凝膠部分脫水收縮，4℃短期保存。G型凝膠系列產品如表4-16所示。
表4-16 葡聚糖凝膠規格及性能
2）修飾葡聚糖凝膠：
Superdex系凝膠由高交聯度的多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結合而成，具有良好的理化穩定性，可在pH3～12范圍內使用。8mol/L脲或去污劑對該系列凝膠無影響（表4-17）。
表4-17 Superdex系凝膠規格及性能
Sephacryl系凝膠由丙烯烷基葡聚糖經甲叉雙丙烯酰胺共價交聯制成，具有良好的理化穩定性，可在pH2～11范圍內使用，可耐高壓滅菌（pH7.0），可耐受去污劑、6mol/L鹽酸胍等洗脫液處理（表4-18）。
表4-18 Sephacryl系凝膠規格及性能
續表
3）瓊脂糖凝膠：
瓊脂糖凝膠來源于海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價交聯，其結合力僅為氫鍵，鍵能較弱。瓊脂糖凝膠的商品名因生產廠家不同而異。瑞典商品名為Sepharose，英國為Sagavac，美國為Bio-Gel，丹麥為Gelarose，國內瓊脂糖凝膠為Sepharose B系列。它與葡聚糖不同，凝膠孔徑不是由交聯度決定，而是依賴瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠化學穩定性較差，凝膠顆粒的強度很低，一般只能在pH4～9、溫度0～40℃范圍內正常使用。需要注意的是瓊脂糖凝膠與硼酸能形成配位化合物，使其結構與孔徑發生改變，應避免用硼酸緩沖液（表4-19）。
表4-19 瓊脂糖凝膠規格及性能
續表
4）聚丙烯酰胺凝膠：
聚丙烯酰胺凝膠是以丙烯酰胺與亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑，經四甲基乙二胺催化聚合而成的親水性凝膠，如美國伯樂公司產商品名為生物凝膠-P。生物凝膠的孔徑隨凝膠總濃度或交聯度增加而變小。其穩定性與葡聚糖凝膠相比更為穩定，在pH2～11范圍內穩定，有較高分辨率和機械強度。商品生物凝膠編號能反映出其分離界限，如Bio-GelP-100，將編號乘以1000為100000，即為它的排阻極限（表4-20）。
表4-20 聚丙烯酰凝膠規格及性能
5）多孔玻璃珠：
多孔玻璃微球物理化學穩定性高，能耐受高溫滅菌及較強烈的反應條件；機械強度大，能在高壓下操作，流速快，試驗重復性好；能抵御酶及微生物的作用，性能穩定。缺點是有大量硅羥基存在，親水性不強，對糖類、蛋白質等物質特別是堿性蛋白質有非特異性吸附作用。常用聚乙二醇浸泡加以鈍化后使用。商品名為Bio-Glas，后面的編號代表其孔徑，編號越大，分離分子量越大（表4-21）。
表4-21 多孔玻璃微球的規格及性能
續表
6）疏水性凝膠：
常見的疏水性凝膠為聚甲基丙烯酸酯凝膠和聚苯乙烯凝膠。適用于疏水性物質及非水溶液，以聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯含量控制孔徑，但也受到洗脫劑的影響。如在芳香族溶劑中其溶脹度大，排阻極限也增大；在醇類物質中，骨架不溶脹，孔徑小，排阻極限也小（表4-22）。
表4-22 疏水性凝膠規格及性能
（3）凝膠層析的應用及影響分離的主要因素：
凝膠色譜法應用范圍廣泛，一般在恒定的緩沖溶液下，根據物質分子量不同進行分離。選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的根本保證。
1）凝膠層析的應用：脫鹽：
脫鹽用的凝膠多為大顆粒、高交聯度的凝膠如SephadexG-25、G-50。由于交聯度大，顆粒強度高，加之凝膠顆粒大，流速快，處理量也較高。用層析柱脫鹽時，上樣樣品的體積必須小于柱內水體積，一般小于內水體積的1/3，以便得到理想脫鹽效果。
分離純化：一般用于分子量相差較大物質的分離。一般用于精細分離時上樣體積應小于柱體積的5%，最好控制在2%以內，以便達到較好的分離效果。
相對分子量測定：根據不同分子量的物質，只要在凝膠的分離范圍內，其洗脫體積或分配系數與相對分子質量的對數呈線性關系。測定時先以三個以上已知分子量的標準蛋白過柱，測取各自洗脫體積并以洗脫體積為縱坐標，分子量對數作為橫坐標制作標準曲線。再測定待測物質的洗脫體積，便可由標準曲線求得分子量。該法測定的分子量為近似分子量，誤差在10%，對球形分子的測量精確度較高，對棒狀分子的測量值小于實際值。一般準確測定分子量采用質譜分析方法。
去熱原：應用于無熱原水的制備及低分子生物制劑中抗原性雜質的去除。如用Sephadex G-25凝膠去除氨基酸中的熱原性物質效果較好；另外，用DEAE-Sephadex-A25去除水中的熱原效果較好。
2）影響分離的主要因素：
選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的關鍵，同時分離過程還與洗脫流速、適宜的離子強度和pH相關，還應考慮上樣量、樣品黏度及凝膠柱床高度。
介質選擇：只將分子量極為懸殊的兩類物質分開，如將蛋白質脫鹽，可采用排阻極限小的介質如Sephadex G-25或G-50，上樣量大，洗脫流速快；分離分子量相差不大的分子，如分離蛋白質與其聚合體，可根據表中各種凝膠排阻范圍加以選擇，同時還需控制上樣量及上樣流速，才能達到較好的分辨效果。
洗脫流速：洗脫流速過快會使色譜帶變形，影響分離效果。因此根據具體試驗情況在凝膠線性流速范圍進行選擇。特別是使用分子篩時，降低流速能達到較好的分辨效果。
洗脫液的離子強度與pH：對水溶性物質的洗脫應采用適宜的離子強度與pH，酸性蛋白的洗脫很少受離子強度變化的影響；堿性蛋白在酸性條件下易于洗脫，洗脫液中應含一定濃度的無機鹽；多糖物質洗脫以水最佳。
上樣量：用于分級分離時，上樣前需濃縮，為達到較好分離效果，上樣量控制在柱體積的2%～5%。
樣品黏度：樣品相對于流動相的黏度越大，分辨率越差。一般要求樣品的黏度小于0.01Pa·s，蛋白質類樣品濃度一般要低于40mg/ml左右。
凝膠柱及填裝：凝膠層析法分離蛋白一般要求有較細的柱徑、較長的柱長及柱床高度，所需柱長通常為內徑的25～40倍，裝柱后測量柱效。如用Sephacryl S-100分離蛋白質，所需柱床高度應不小于80cm，柱效不低于9000。
2.離子交換層析
離子交換層析（ion exchange chromatography，IEC）是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離的方法。該法可以同時分離多種物質，具有工作容量大、靈敏度高、重復性好、選擇性強、分離速度快等優點，是當前最常用的層析方法之一，常用于蛋白質、氨基酸、多肽及核酸等的分離純化。
（1）離子交換色譜原理：
離子交換色譜原理是利用離子交換劑的荷電基團，吸附溶液中帶電離子或離子化合物，這種結合是可逆的，被吸附的物質隨后被帶有同類型電荷的其他離子所置換，而被洗脫下來。由于不同物質對交換劑的結合力不同，在梯度洗脫過程中，被洗脫下來的順序不同，因而達到分離的目的。離子交換現象可用下面的方程式表示：
式（4-7）中，R -代表陽離子交換劑功能基團和載體；A ＋表示平衡離子；B ＋表示交換離子。
離子交換劑的選擇性可用平衡常數 K表示，即：
如果反應溶液中〔A ＋〕=〔B ＋〕，則 K=〔RB〕/〔RA〕。當 K＜1時，〔RB〕＜〔RA〕表示離子交換劑對B ＋的結合力小于A ＋；當 K=1時，〔RB〕=〔RA〕表示離子交換劑對A ＋、B ＋的結合力相同；當 K＞1時，〔RB〕＞〔RA〕表示離子交換劑對B ＋的結合力大于A ＋。 K值反映離子交換劑對不同離子的結合力或選擇性參數。兩性電解質（如蛋白質、氨基酸、核苷酸等）與離子交換劑的結合能力，主要取決于它們的理化性質與特定條件下呈現的離子狀態。當pH＜p I時，蛋白質帶正電荷，能被陽離子交換劑吸附；反之，當pH＞p I時，蛋白質帶負電荷，能被陰離子交換劑吸附。溶液的pH偏離等電點越遠，蛋白質分子所帶的凈電荷量越大。由于蛋白質等生物大分子等電點不同，可通過改變溶液的pH和離子強度影響它們與離子交換劑的吸附作用，從而使它們得到分離純化。圖4-6為離子交換吸附和洗脫示意圖。
圖4-6 離子交換吸附和洗脫示意圖
（2）離子交換層析介質：
據離子交換介質材質及親水性不同可分為親水性的天然或合成高聚物如纖維素系、葡聚糖系、瓊脂糖系等，疏水性的聚苯乙烯高聚物，耐高壓的剛性有機合成高聚物，硅膠顆粒等。作為離子交換介質應具備以下條件：要有大的交換容量和良好的交換選擇性；穩定性好，耐受酸堿、鈣鹽、有機溶劑、溫度及壓力環境；凝膠顆粒大小均勻，介質內孔徑大小分布要均勻，并具有一定強度；交換速度快，可逆性好，易洗脫和再生，可反復使用。
常見的離子交換介質的功能基團見表4-23。
表4-23 常用離子交換介質功能基團
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目前已商品化的離子交換介質的品種主要有：
纖維素離子交換系列：纖維素具有松散的親水網絡、孔徑大、比表面積大等優點。目前常用的珠狀離子交換纖維是用高純微晶纖維素經交聯、功能基化而制備。如DEAE-Sephacel是在合成過程中破壞微晶結構經重新組合而成的珠狀物，再用氯代環氧丙烷進行交聯而成大孔結構。幾種常用的纖維素系離子交換介質如表4-24所示。
表4-24 常用纖維素系離子交換介質
葡聚糖離子交換系列：是以SephadesG-25及SephadesG-50兩種凝膠過濾介質為母體，引入離子交換功能基團后形成，具有較高的容量。名稱中的A表示陰離子交換介質，C表示陽離子交換介質；功能基中WB為弱堿性，WA為弱酸性，SB為強堿性，SA為強酸性；Hb為血紅蛋白。幾種常用的葡聚糖系離子交換介質如表4-25所示。
表4-25 常用葡聚糖系離子交換介質
瓊脂糖離子交換系列：常用的瓊脂糖離子交換系列分為Bio-GelA系和Sepharose系。幾種常用的葡聚糖系離子交換介質如表4-26所示。
表4-26 常用瓊脂糖系離子交換介質
Mono eads離子交換系列：以親水性聚醚為骨架，具有剛性好、粒徑小、分辨效率高的優點，常用于蛋白質、肽類或低聚核苷酸分析柱的制備。幾種常用的Mono eads系離子交換介質如表4-27所示。
表4-27 高效離子交換介質
（3）離子交換層析的應用及影響分離的主要因素：
離子交換層析法廣泛應用于蛋白質、氨基酸、核苷酸、多糖及有機酸等生物大分子的分離純化。目前約有80%蛋白質分離純化中應用離子交換。一般采用鹽濃度梯度洗脫，將目的蛋白與雜質分離，純化倍數可達3～10倍。影響分離的主要因素如下：
1）介質選擇：
離子交換介質分為酸性的陽離子交換介質和堿性的陰離子交換介質，按酸性或堿性強弱分為強型和弱型。如強酸型陽離子交換介質功能基團為— 
，在pH1～14范圍都有吸附；弱酸型陽離子交換介質功能基團為—COOH，一般在pH5.0～10.0范圍才有吸附。一般情況下，在對未知物質進行純化工藝摸索時，采用強型離子交換介質，因其使用范圍更廣，但存在吸附后難以解析的，一般需要較強的條件（如用強酸或強堿）進行洗脫。因此在實際工藝設計中，根據摸索的試驗條件，更多考慮弱型離子交換介質。上樣量應根據選擇介質的最大吸附量進行調整。
，在pH1～14范圍都有吸附；弱酸型陽離子交換介質功能基團為—COOH，一般在pH5.0～10.0范圍才有吸附。一般情況下，在對未知物質進行純化工藝摸索時，采用強型離子交換介質，因其使用范圍更廣，但存在吸附后難以解析的，一般需要較強的條件（如用強酸或強堿）進行洗脫。因此在實際工藝設計中，根據摸索的試驗條件，更多考慮弱型離子交換介質。上樣量應根據選擇介質的最大吸附量進行調整。
2）離子強度：
離子交換吸附應在較低的離子強度下進行，最好選擇允許目的分子與離子交換介質能夠結合的最高離子強度；而洗脫時應選擇可使目的蛋白與介質解析的最低離子強度。目的蛋白解析后應用更高的離子強度徹底清除可能殘留的牢固吸附雜質，具體離子強度應根據試驗確定。一般在吸附階段采用含0.1mol/L氯化鈉的10～50mmol/L緩沖溶液中進行。在此離子強度下目的蛋白不會被洗脫下來，而樣品中與離子交換劑結合不牢的雜質將會被解析下來。離子交換一般不在鹽析分離后進行，必須進行時應先除鹽。
3）pH：
要使目的蛋白以適當的強度結合到離子交換介質上，需選擇合適的吸附pH。對于陽離子交換介質，吸附pH應至少低于目的物質等電點1個pH單位；對于陰離子交換介質，吸附pH應至少高于目的物質等電點1個pH單位。pH偏離等電點越遠，凈電荷越多，越易吸附，但解析困難，具體pH應由試驗確定。操作過程也可以選擇目的蛋白流穿、雜質被吸附的方式，如對于陽離子交換介質，溶液的pH高于等電點，使目的蛋白帶負電荷而流穿，此方式不適用于純化分離，一般用于去除樣品中的熱原或宿主蛋白等。
3.親和色譜
酶、蛋白質、抗體、激素等生物物質，具有識別特定物質并與該物質的分子特異性相結合的能力。這種識別并結合能力具有排他性，即生物分子具有能夠區分結構與性質非常相近的其他分子，選擇性地與其中某一分子相結合。其結合方式為立體構象結合，具有空間位阻效應。結合的作用力包括靜電作用、疏水作用、范德華力及氫鍵等。親和色譜（affinity chromatography，AC）是利用生物分子與其配體特異性結合作用進行生物物質分離純化的色譜技術。早在1910年，就有人利用不溶性淀粉選擇吸附、提純淀粉酶。到了20世紀60年代，親和色譜的優點得到充分認識和發展，親和層析的名稱也被首次利用。親和色譜具有操作簡單、選擇性強、分離速度快、分辨率高、分離條件溫和等優點，一次過柱就能得到高純度的活性物質。但缺點是吸附劑通用性較差，分離不同物質都需制備專用配基，洗脫條件苛刻，價格昂貴及有些配基易脫落。隨著新型介質的應用與各種配體的出現，使親和色譜得到越來越廣泛的應用。
（1）親和色譜原理：
親和色譜是在介質上鍵合可逆結合特異性目的分子的適當配體，含有目的分子的待分離物質通過時，與目的分子特異性結合并去除了所有未結合雜質，再以一定洗脫條件將單一目的分子洗脫下來。親和色譜分離基本原理如下：
1）配基固定化：
選擇合適的配基與不溶性的支撐載體偶聯，或共價結合成具有特異親和性的分離介質。
2）吸附樣品：
配基與被分離生物大分子間專一性識別或特異性吸附，雜質與介質間無親和作用而被去除。配基與生物活性物質吸附作用必須是可逆的。
3）樣品解析：
選擇適宜的條件使被吸附的活性物質解析。
（2）親和色譜介質：
親和色譜介質是利用大多數大分子物質與某些相應的分子專一性可逆結合的特性，將親和配基通過化學鍵固定在色譜介質上而得到的。因此，色譜介質的制備首先要選擇介質和配基，其次是介質的活化或功能化及活化的介質與親和配基偶聯。
1）介質的選擇：
介質的親和配基附著的基礎和骨架，應具有如下特性：理化性質穩定，非特異性吸附小且生物惰性，不因共價偶聯反應和吸附條件的變化發生改變；具有多孔立體網狀結構，能使大分子自由通過，使親和對的兩種成分在自由溶液中充分相互作用；必須能夠活化或功能化，且具有大量可供活化和配基結合的化學基團；具有高度親水性，親水性是保證被吸附物質穩定的重要因素，同時有助于達到親和平衡并減少因疏水造成的非特異性吸附；具有大小均勻、機械強度高等性能，保證良好的流速。
常用的介質有多糖類如纖維素（celluose）、葡聚糖（dextrin）、瓊脂糖（agarose）凝膠、聚丙烯酰胺凝膠及無機介質等。
2）配基的選擇：
配基的選擇主要取決于分離對象，應具有專一性，僅識別被純化的目的物（配體），不吸附其他雜質，可根據配體的生物學特性尋找；應有足夠大的親和力；與目的物間的結合具有可逆性，這樣能夠在一定條件下吸附和解析；大小選擇適宜，具有較好的穩定性。
親和配基按親和力的大小可分為兩類，一類為特殊配基，其 K eq值為10 7～10 15，如生物素、激素、抗原等；另一類為通用配基， K eq值為10 4～10 6。親和力越高，則生產中需要的洗脫條件就越苛刻。特殊配基包括酶的抑制劑、抗體、受體等。常用的特異性親和配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金屬離子等。特異性親和配基由于分子較小、容量高、成本低，因而其實用性越來越受到重視。幾種常用的親和層析介質、配基及目的產物如表4-28所示。親和色譜中配基的選擇和洗脫條件如表4-29所示。
表4-28 商品化的親和色譜介質、配基及其目的產物
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表4-29 親和色譜中配基的選擇和洗脫條件
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3）活化與偶聯：
親和色譜的介質由于其相對惰性，往往不能直接與配基相連，偶聯前一般需活化。親和配基與色譜介質化學反應過程應相對溫和，盡可能保持介質與配基的原來性能，保證專一性或特異性作用。活化的方法較多，常見的方法如表4-30所示。
表4-30 常見活化方法比較
（3）親和色譜的應用及影響分離的主要因素：
親和色譜法廣泛應用于生物分子、各種功能細胞、細胞器、膜片段和病毒顆粒的分離純化，生化成分的分離檢測及其他分離手段難以分離的大分子物質，尤其對分離某些不穩定的大分子物質更具優越性。親和色譜分離純化應考慮以下幾個方面：
1）吸附條件的選擇：
吸附條件最好是自然狀態下配體與目的分子間反應的最佳條件，如緩沖鹽的種類、濃度及pH等條件。如金黃葡萄球菌蛋白A和免疫球蛋白IgG間的結合主要是疏水作用，可以通過增大鹽濃度、調節pH來增強吸附。對配體與配基結合情況不了解，就必須對鹽種類、濃度及pH等條件進行摸索。此外應考慮流速對吸附的影響，流速不能太快，應調節至能夠充分吸附，延長吸附時間，可以在上樣后靜置一段時間再進行洗脫。上樣量可根據填料的吸附容量來推算，通常為吸附容量的1/3或更低，對于吸附力弱的物質，上樣量按照1/10為佳。在樣品上柱后，使用10倍柱體積的緩沖溶液將不結合的雜質清洗掉。
2）吸附后清洗條件的選擇：
某些雜質可以非特異性地吸附，為獲得高純度的目的分子，應選擇一定強度的清洗緩沖液，其強度應介于目的分子吸附條件與目的分子洗脫條件之間。如堿性成纖維細胞生長因子在含0.6mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液中吸附，洗脫條件為含2.0mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，則考慮使用1.2mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進行雜質清洗。
3）洗脫條件的選擇：
從柱中洗脫目標產物是親和色譜是否成功的關鍵。通常采用降低目標產物與配體之間的親和力的方式進行洗脫。可用一步法或連續改變洗脫劑濃度的方式將目標產品洗脫下來。改變pH和離子強度也能改變配體與蛋白質間的作用力，洗脫目標產品。洗脫過程的選擇應考慮目的分子的耐受性，對于吸附得十分牢固的生物大分子，必須使用較強的酸或堿作為洗脫劑或在洗脫液中加入破壞蛋白質的試劑，如脲、鹽酸胍。這種洗脫方式往往造成不可逆的變化，使純化的對象失去生物學活性。因此，對于洗脫得到的蛋白質溶液應立即進行中和、稀釋或透析。
4.疏水性相互作用色譜
疏水性相互作用色譜（hydrophobic interaction chromatography，HIC）是根據生物分子疏水性差異進行相互分離的色譜技術。疏水色譜最早研究是J.Porath研究的疏水吸附中的鹽析效應，1973年Hofstee和Shaltiei分別提出了疏水色譜的概念。主要應用于蛋白質、氨基酸或多肽等生物分子色譜分離。
（1）疏水性相互作用色譜原理：
疏水性相互作用色譜原理是利用蛋白質類生物大分子上的疏水基團或區域在疏水作用體系中，與介質上的疏水基團相互作用，達到吸附平衡，然后根據不同分子吸附強弱差別，在一定條件下解析達到分離目的。親水性蛋白質表面上均含有一定量的疏水基團，疏水性氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸等）含量較多的蛋白質疏水性基團多，疏水性強。在蛋白質水溶液中，暴露于蛋白質表面的疏水基團或疏水部位與親水性固定相表面的弱疏水基團相互作用，被固定相吸附。蛋白質在疏水性吸附劑上的分配系數隨離子強度的提高而增強。因此疏水色譜與離子交換色譜不同，在高鹽下進行吸附，解析則采用降低流動相離子強度的線性梯度洗脫或逐次洗脫法。
（2）疏水性相互作用色譜介質：
適宜制備疏水作用的層析介質材料很多，應用最廣的是瓊脂糖。常用的疏水性配基有苯基、短鏈烷基（C 3～C 8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應根據配基的疏水性而異，疏水性高的配基較疏水性低的配基修飾密度低。配基修飾密度過小疏水性吸附作用不足，密度過大解析困難。一般來說可以用低碳數的配基可以進行吸附，不必用高碳數疏水配基。一般配基修飾密度在10～40μmol/ml之間（表4-31）。
表4-31 常見的疏水性吸附劑
續表
（3）疏水性相互作用色譜的應用及影響分離的主要因素：
疏水性相互作用色譜沒有離子交換色譜應用廣泛，作為離子交換色譜補充工具，主要應用于蛋白質、氨基酸或多肽等生物分子鹽析或離子交換后的色譜分離。疏水性相互作用色譜分離純化應考慮以下幾個方面：生物分子的疏水性與其荷電性質相比復雜得多，不易定量掌握，與介質功能基的種類、流動相中鹽的種類和濃度、操作溫度及pH、添加劑等因素相關。
1）介質選擇：
疏水性強的生物分子應選擇較弱的疏水基團，否則結合過于牢固不利于解析；反之，疏水性弱的生物分子應選擇較強的疏水基團，否則無法結合或結合力較弱，影響分離效果。一般試驗時，先用低疏水性的介質，選擇在低鹽濃度下得到最高分辨率和載量的介質。
2）離子強度與種類：
離子強度高，有利于蛋白吸附，吸附容量大。鹽種類也對疏水色譜有影響，鹽析效果越顯著的鹽，對疏水作用影響越大。Hofmeisteer給出著名鹽析效應離子串（圖4-7）。一般硫酸銨的濃度在1～2mol/L，氯化鈉在2～4mol/L，根據不同生物分子通過試驗找出載量最大、分離效果最好的濃度。
圖4-7 Hofmeisteer離子串
3）操作溫度及pH：
一般吸附為放熱過程，但疏水吸附相反，吸附結合力隨溫度升高而增大。pH對疏水色譜的影響比較復雜，流動相的pH必須在蛋白質不失活的范圍。
4）添加劑：
低濃度的添加劑如水溶性醇（乙二醇等）、表面活性劑（Tween-20、TritonX-100等），可降低生物分子與配基間的疏水作用力。所以往往加入這些添加劑達到解析目的，但有些添加劑很難用常規方法去除，有時會導致介質載量下降。
5.擴張床吸附技術
擴張床吸附（expanded bed adsorption，EBA）是指20世紀90年代發展起來的新型蛋白質吸附分離技術。眾所周知，在生物工程中降低分離和純化的費用，常常是實現工業化的關鍵。
大規模的離子交換、疏水等固定床吸附技術要求原料中不能含有不溶性顆粒，否則會造成柱床堵塞，影響生產操作。因此，通常分離和純化是由一系列的單元操作組成。其中首先為固液分離操作，去除溶液中的不溶性顆粒，常用離心和超濾方法，接著用層析法進行濃縮和初步純化。當細胞尺寸較小或含細胞碎片時用傳統的過濾或離心很難除去，且費用昂貴。由于發酵液或培養液的體積大、黏度高，故處理難、費時多，常引起目標蛋白質受到蛋白酶、糖苷酶的作用而被破壞，故第一步操作常常成為整個下游過程的制約步驟。為簡化生化分離步驟，提高純化效率和活性回收率，國內外一些學者提出了過程集成的概念，即在一個操作中完成常規分離幾個單元操作完成的任務。基于這種思想，產生了一批集成化的分離純化技術，如親和萃取和親和沉淀、親和膜吸附等。英國劍橋大學的H.A.Chase等在研究流化床吸附的基礎上，發展了能在床層膨松狀態下實現平推流的擴張床吸附（EBA）技術。應用該技術可直接從細胞破碎液中提取出較純的目標產物，固液分離和吸附同時進行，相當于合并了除細胞碎片和初步純化。EBA集過濾、濃縮和初步純化于一步完成，減少了操作步驟，縮短了操作時間，能提高收率和降低成本。該技術的問世立即引起其他學者的重視，短短幾年EBA技術的應用研究迅速發展，很多學者都證明，EBA技術是一種可以直接從含顆粒料液中提取生物大分子的新技術。
（1）擴張床的吸附原理：
擴張床是流化床的一種特殊形式，兼有了固定床與流化床的優點，同時又克服了兩者的缺點。較之于流化床的快流速、高返混，擴張床的返混程度很低，操作接近于固定床。在擴張床中床層高度隨液相流速線性增大。當從底部泵入緩沖溶液達到最低流化流速 U mf時，柱床開始擴張，吸附劑間隙增大，有利于懸浮顆粒通過，直至緩沖溶液流速達到吸附劑的終端流速 U t即緩沖溶液流速與吸附劑顆粒沉降速度達到平衡，便形成了穩定的擴張床。因此流速應選擇在 U mf＜ U＜ U t范圍。擴張床層擴張規律符合Richardson-Zaki方程，即：
式（4-9）中， U為液相空塔速率；ε為床層空隙率； n為Richardson-Zaki系數（層流區 n值一般為4.8）。
吸附劑的終端流速（ U t）可用Stokes沉降方程計算，即：
式（4-10）中， U t為吸附劑的終端流速； d p為顆粒直徑；ρ s為固體密度；ρ L為液體密度；μ L為黏度。
由方程可知，液相黏度和密度越大，終端流速越小，達到一定膨脹率所需要的液相流速越低。
（2）擴張床組成及吸附介質 1）擴張床的組成：
擴張床和常用的液固吸附裝置一樣，吸附劑外還需恒流泵、裝有吸附介質的柱子和在線檢測裝置或收集器。吸附柱底層液體分布器非常重要，它應保證床截面的流速分布均勻，透過料液內的微粒子而截流吸附劑。擴張床床層上部安裝有可調節床層高度的調節器，它的位置能自由改變，吸附操作過程中需恰好在膨脹床層的頂部，以減小吸附死體積。
2）吸附劑：
適用于擴張床的吸附劑需要有一定粒徑和密度分布外，還應滿足以下條件：尺寸和密度應保證其終端流速與料液中需去除的顆粒間有明顯差異；應具有良好的孔道結構，不易被料液中脂類、核酸和雜蛋白等生物物質污染；應具有活性基團，可以修飾吸附目的產物的配基，并對目的產物有較高吸附容量；具有較高化學穩定性和良好機械強度，可進行在線清洗（CIP），使用壽命長；具有良好傳質性能，在較高流速下，保持較高吸附量。
可形成穩定膨脹床的吸附劑主要有兩類。一類是磁性粒子，在外部磁場作用下，磁性粒子呈現穩定的流化狀態，但缺點是設備復雜，反復清洗過程中磁性粒子穩定性差。另一類是具有一定粒徑和密度分布，在液體流速的分級作用下，大粒徑或高密度吸附劑分布于床層底部附近，而小粒徑或低密度吸附劑分布于床層頂部，在床層內形成穩定的吸附劑粒徑或密度分布，使液相和固相返混較小。如Pharmacia公司開發的高密度吸附劑多孔玻璃和STREAMLINE（交聯瓊脂糖凝膠內包埋晶體石英，以提高吸附劑密度）等。
（3）擴張床色譜的應用及影響分離的主要因素：
擴張床色譜主要用于抗體、蛋白質等生物大分子的過濾、濃縮和初步分離。其操作與其他固定床吸附流程相似。擴張床技術目前還處于實驗室或中試階段，大規模生產的例子很少。
影響分離的因素包括柱床擴張特性及穩定性，原料液成分及黏度，流洗、洗脫及再生條件控制等。
1）柱床擴張特性及穩定性：
柱床擴張特性指柱床對流速變化的反應特性，它主要受介質粒徑、介質顆粒與原料液間的密度差及原料液的黏稠度影響。介質粒徑越大，密度越高，達到相同擴張程度所需流速越高。原料液密度越大，黏稠度越高，單位流速變化引起擴張床變化也越大。柱床擴張達到平衡后應對擴張床穩定性進行評估。主要評估方法有目測法、柱床擴張的測定及理論塔板數測定。只有穩定的擴張床才能獲得較高的吸附效率和純化效果。一般擴張床擴張為2～3倍沉降床高度，理論塔板數與預期相差不小于20%為宜。
2）原料液成分及黏度：
原料液的成分十分復雜，一些大顆粒（如核酸、多糖、細胞團塊等）會污染介質，堵塞造成擴張床不穩定，影響柱效，還可影響介質的載量和選擇性。黏度過高對擴張床穩定性產生負面影響，一般控制原料液中生物性物質干重比例在8%以下為宜。
3）流洗：
流洗步驟中，應將溶解的和不溶性顆粒徹底從柱床洗出，以保證進一步精細純化。一般需要流洗5個沉降柱床體積以上，流洗溶液中可加25%甘油將細胞和未吸附的蛋白質洗出。
4）洗脫：
洗脫應在柱床沉降狀態下以固定床方式進行。根據介質載量情況選擇洗脫方向，吸附的目的分子較少時一般正相洗脫，載量飽和一般反相洗脫。可用分步洗脫法或梯度洗脫法，也可按擴張床模式進行洗脫。
5）再生：
每次洗脫完畢后必須在線清洗，延長擴張床使用壽命。大多數再生操作都使用0.5～1.0mol/L NaOH清洗3～4小時，再用30%異丙醇或20%～70%乙醇洗滌，再生以后應校驗動態吸附容量和床層的擴展程度，變化不能太大。對于不能耐受NaOH清洗介質，可改用8mol/L尿素、6mol/L鹽酸胍或1mol/L醋酸進行清洗。
（田海山）