DNA連接酶（DNA ligase）是催化DNA分子中5'磷酸基與3'羥基間形成磷酸二酯鍵的酶，DNA連接酶的作用需要ATP和NAD＋作為輔助因子，DNA連接酶的底物可以是DNA/ RNA雜合體中帶缺刻的DNA、黏端DNA或平端DNA，連接效率依次降低。DNA連接酶有兩種來源，一種是大腸埃希菌的DNA連接酶，以NAD＋作為能源；另一種為T4噬菌體DNA連接酶，以ATP為能源，兩種酶作用機制相同。T4 DNA連接酶是從T4噬菌體感染的大腸埃希菌分離得到的，能進行平端DNA片段的連接，因此在基因工程中應用較廣泛，連接黏端DNA最佳溫度為4～15℃。