官术网_书友最值得收藏!

三、DNA聚合酶

DNA聚合酶(DNA polymerase)的共同特點是能夠將脫氧核糖核苷酸連續加至雙鏈DNA分子引物鏈的3'-OH末端,催化核苷酸的聚合作用,但不從引物模板解離。該酶催化反應時必須具備DNA模板、3'-OH的引物及其他必需因子,合成DNA的方向是5'-3'。在基因工程中應用較多的DNA聚合酶主要有大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ、大腸埃希菌DNA酶Ⅰ的大片段(Klenow酶)、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶及逆轉錄酶等。DNA聚合酶的特性如表3-3所示。
表3-3 DNA聚合酶特性

1.大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ

迄今為止,從大腸埃希菌中分離獲得了3種DNA聚合酶,即DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)、DNA聚合酶Ⅱ(polⅡ)、DNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中polⅠ和polⅡ主要參與DNA修復過程,而polⅢ則與DNA復制相關。基因工程中主要應用的是DNA聚合酶Ⅰ。1957年Kornberg從大腸埃希菌中首次發現了polⅠ,該酶是一種單鏈多肽,分子量為1.09×10 3,具有3種酶活性:5'-3'聚合酶活性、5'-3'核酸外切酶活性、3'-5'核酸外切酶活性。

2.大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段

大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段( E. coli DNA polⅠKlenow fragment)是大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ經枯草芽胞桿菌蛋白酶或胰蛋白酶水解后,得到的較大的片段,相對分子量為7.6×10 4。Klenow片段保留了完整的5'-3'聚合酶活性和3'-5'核酸外切酶活性。該酶主要用于修補限制性內切酶酶切DNA形成的3'隱蔽末端、標記DNA片段末端、cDNA第二條鏈的合成以及DNA序列測定。

3.T4 DNA聚合酶

T4 DNA聚合酶是分離自T4噬菌體感染的大腸埃希菌的一種DNA聚合酶,需要模板和帶有3'-OH末端的引物,具有5'-3'聚合酶活性,DNA鏈從該3'-OH起始,按5'-3'方向延伸,該酶還具有3'-5'核酸外切酶活性,但沒有5'-3'外切酶活性。相對分子量為1.14×10 5,外切酶活性較Klenow酶高200倍,且對單鏈DNA作用強于雙鏈DNA。目前商品酶多分離自基因工程大腸埃希菌,主要用于補平5'凸出末端,進行放射性標記;也可用于切平3'凸出末端。

4.T7 DNA聚合酶

分離自T7噬菌體感染的大腸埃希菌的一種DNA聚合酶,具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'核酸外切酶活性,其單鏈或雙鏈外切酶活性是Klenow酶的1000倍。能利用引物在單鏈模板上退火合成DNA,因此多用于測序,是雙脫氧末端終止法的測序酶。該酶在所有DNA聚合酶活性中活性最強,可延伸引物長達1000個核苷酸,因此也適用于合成較長的DNA鏈。

5.測序酶

測序酶(sequenase)是一種經化學修飾的T7 DNA聚合酶,修飾后喪失了3'-5'核酸外切酶活性,穩定性增加,持續合成能力強,聚合速率高,是對長DNA片段進行雙脫氧終止法測序最好的酶。

6.逆轉錄酶

1970年兩位美國科學家各自在反轉錄病毒中發現了逆轉錄酶(reverse transcriptase),該酶催化以RNA為模板合成DNA的反應,其產物為cDNA。目前該酶主要有兩種,一種來源于禽成髓細胞瘤病毒,另一種則分離自克隆Moloney鼠白血病病毒逆轉錄酶基因的大腸埃希菌。兩者均具有5'-3'聚合酶活性,能以RNA或DNA為模板合成DNA;具有RNA酶H活性,即核糖核酸外切酶活性,以3'-5'方向或5'-3'方向特異降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈。

7.Taq DNA聚合酶

從耐熱菌 T. aquaticus中分離獲得Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase),該酶具有5'-3'聚合酶活性及依賴于聚合酶作用的核酸外切酶活性,其特點是在DNA變性溫度下仍具有很高活性,因此能以高溫變性的DNA為模板合成DNA新鏈,最適反應溫度為75~80℃,主要用于聚合酶鏈式反應(PCR)在體外擴增DNA。

8.末端轉移酶

末端轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)是一種無須引物即能將若干堿基加在雙鏈或單鏈DNA 3'末端的酶,利用這一特點可進行3'末端加尾或標記。TdT催化反應需要Mg 2+,若以Co 2+代替,則可將同聚體“尾”加至由限制性內切酶酶切產生的平末端或黏末端的3'-OH部位。該酶是一種非特異的酶,4種dNTP中任何一種均可作為其前體物。
主站蜘蛛池模板: 东乌| 新密市| 武隆县| 托克托县| 台南市| 米脂县| 贵定县| 雷州市| 大田县| 福安市| 闻喜县| 黎平县| 河南省| 嘉祥县| 舞阳县| 威远县| 岐山县| 文成县| 玉山县| 龙陵县| 铜鼓县| 石河子市| 玉溪市| 新龙县| 贵州省| 乾安县| 祁连县| 方山县| 汝南县| 枣庄市| 高唐县| 理塘县| 册亨县| 阿鲁科尔沁旗| 澜沧| 舞阳县| 赤城县| 西丰县| 加查县| 抚顺县| 白山市|