核酸限制性內切酶（restriction endonuclease）是一類能夠識別雙鏈DNA分子上某段特定核苷酸序列，并在該序列中進行切割的核苷內切酶，主要存在于原核微生物中。而在宿主菌中可識別相同序列的DNA甲基化酶，只對本宿主DNA進行甲基化修飾，從而避免了內切酶對宿主DNA的作用，構成了原核微生物限制-修飾-保護機制的分子基礎。

核酸限制性內切酶參與的反應均需要Mg ^2＋。表3-1和3-2顯示限制性內切酶的類型及其特點。Ⅰ型限制性內切酶是大而復雜的蛋白質，由3種亞單位構成，既有限制性內切酶的作用，也有甲基化酶的作用，需要ATP（或dATP）和 S-腺苷- L-甲硫氨酸，它們識別兩側不對稱DNA序列，并能隨機在識別位點至少1000個堿基對處切除DNA，在其識別位點發生甲基化，例如EcoR和EcoK由3個不同亞基組成，識別位點為一個二重識別序列，甲基化位點與識別位點相同。Ⅲ型限制性內切酶在離識別序列3'端24～26個堿基對處切割DNA分子，如EcoPⅠ由兩個亞基組成，識別序列不對稱，酶切位點也不在識別位點上。如上所述，基于Ⅰ型和Ⅲ型限制性內切酶酶切位點與識別位點不同，且切割產物無特異性，因此在基因工程無應用價值。在基因工程操作中，主要采用的是Ⅱ型限制性內切酶（restriction endonucleaseⅡ），可特異識別和切割4～8個bp長度且具有回文序列的DNA片段，主要產生三種末端結構：5'-粘性末端，3'-粘性末端，平端。