第三節(jié) 毛細管電泳法

毛細管電泳法是指以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)供試品中各組分的淌度（單位電場強度下的遷移速度）和（或）分配行為的差異而實現(xiàn)各組分分離的一種分析方法。

當(dāng)熔融石英毛細管內(nèi)充滿操作緩沖液時，管內(nèi)壁上硅羥基解離釋放氫離子至溶液中，使管壁帶負電荷并與溶液形成雙電層（電位），即使在較低pH值的緩沖液中也是如此。當(dāng)在毛細管兩端加上直流電壓時，將使帶正電的溶液整體地移向負極端。此種在電場作用下溶液的整體移動被稱為電滲流（EOF）。管內(nèi)壁硅羥基的解離度與操作緩沖液pH值、添加的改性劑有關(guān)。降低溶液pH值會降低解離度，減小電滲流；提高溶液pH值會提高解離度，增加電滲流。有機添加劑的加入有時會抑制管內(nèi)壁硅羥基的解離，減小電滲流，帶電粒子在電場作用下以不同速度向極性相反的方向移動，形成電泳，帶電粒子的運動速度等于其電泳速度和電滲速度的矢量和。電滲速度通常大于電泳速度，因此電泳時各組分即使是陰離子也會從毛細管正極端流向負極端。

一、分離模式

1．毛細管區(qū)帶電泳（CZE）。

將待分析溶液引入毛細管進樣端，施加直流電壓后，各組分按各自電泳流和電滲流的矢量和流向毛細管出口端，按陽離子、中性粒子和陰離子的順序通過檢測器。中性組分彼此不能分離。出峰時間被稱為遷移時間（tm），相當(dāng)于高效液相色譜和氣相色譜中的保留時間。

2．毛細管凝膠電泳（CGE）。

在毛細管中裝入單體和引發(fā)劑，引發(fā)聚合反應(yīng)而生成凝膠，這種方法主要用于分析蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子。另外，還可以利用聚合物溶液（如葡聚糖等）的篩分作用進行分析，稱之為毛細管無膠篩分。有時將它們統(tǒng)稱為毛細管篩分電泳，下分為凝膠電泳和無膠篩分兩類。

3．毛細管等速電泳（CITP）。

采用前導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，在毛細管中充入前導(dǎo)電解質(zhì)后，進樣，電極槽中換用尾隨電解質(zhì)進行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個狹窄的區(qū)帶，然后依次通過檢測器。

4．毛細管等電聚焦電泳（CIEF）。

將毛細管內(nèi)壁涂覆聚合物以減小電滲流，再將供試品和兩性電解質(zhì)混合進樣，在兩個電極槽中分別加入酸液和堿液，施加電壓后毛細管中的操作電解質(zhì)溶液逐漸形成pH梯度，各溶質(zhì)在毛細管中遷移至各自的等電點（pI）時變?yōu)橹行远纬删劢沟膮^(qū)帶，而后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液pH值的方法使溶質(zhì)通過檢測器。

5．膠束電動毛細管色譜（MEKC）。

操作緩沖液中加入大于其臨界膠束濃度的離子型表面活性劑時，表面活性劑聚集形成膠束，其親水端朝外，疏水端朝內(nèi)，溶質(zhì)則在水和膠束兩相間分配，各溶質(zhì)因分配系數(shù)存在差異而被分離。

6．毛細管電色譜（CEC）。

將細粒徑固定相填充到毛細管中或在毛細管內(nèi)壁涂覆固定相，以電滲流驅(qū)動操作緩沖液（有時再加輔助壓力）進行分離。

在以上分離模式中，毛細管區(qū)帶電泳和膠束電動毛細管色譜使用較多。膠束電動毛細管色譜和毛細管電色譜的分離機理以色譜為主，但對荷電溶質(zhì)則兼有電泳作用。在操作緩沖液中加入各種添加劑可獲得多種分離效果。如加入環(huán)糊精、衍生化環(huán)糊精、冠醚、血清蛋白、多糖、膽酸鹽或某些抗生素等，可拆分手性化合物；加入有機溶劑可改善某些組分的分離效果，以至可在非水溶液中進行分析。

二、對儀器的一般要求

毛細管電泳儀的主要部件和其性能要求如下。

1．毛細管。

使用彈性石英毛細管，內(nèi)徑以50μm和75μm兩種規(guī)格使用較多（毛細管電色譜有時用內(nèi)徑更大些的毛細管）。內(nèi)徑小分離效果好，且焦耳熱小，允許施加較高電壓，但若采用柱上檢測，則因光程較短，其檢測限比內(nèi)徑較大管要差。毛細管長度稱為總長度，根據(jù)分離度的要求，可選用20cm～100cm；進樣端至檢測器間的長度稱為有效長度。毛細管常盤放在管架上并在一定溫度下操作，以控制焦耳熱。操作緩沖液的黏度和電導(dǎo)度對測定的重現(xiàn)性很重要。

2．直流高壓電源。

采用0kV～30kV（或相近）可調(diào)節(jié)直流電源，可供應(yīng)約300μA電流，有穩(wěn)壓和穩(wěn)流兩種方式可供選擇。

3．電極和電極槽。

在兩個電極槽中放入操作緩沖液，分別插入毛細管的進口端與出口端以及鉑電極。鉑電極連接至直流高壓電源，正、負極可切換。多種型號的儀器將試樣瓶同時用作電極槽。

4．進樣系統(tǒng)。

每次進樣之前毛細管要用不同溶液進行沖洗，選用自動沖洗進樣儀器較為方便。進樣方法有壓力（加壓）進樣、負壓（減壓）進樣、虹吸進樣和電動（電遷移）進樣等。進樣時，通過控制壓力或電壓及時間來控制進樣量。

5．檢測系統(tǒng)。

紫外-可見分光檢測器、激光誘導(dǎo)熒光檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器均可用作毛細管電泳的檢測器，其中以紫外-可見分光檢測器應(yīng)用最廣，包括單波長、程序波長和二極管陣列檢測器。將毛細管接近出口端的外層聚合物剝?nèi)ゼs2mm，使石英管壁裸露，毛細管兩側(cè)各放置一個石英聚光球，使光源聚焦在毛細管上，透過毛細管到達光電池。對無光吸收（或熒光）的溶質(zhì)的檢測，還可采用間接測定法，即在操作緩沖液中加入對光有吸收（或熒光）的添加劑，在溶質(zhì)到達檢測窗口時出現(xiàn)反方向的峰。

6．?dāng)?shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

毛細管電泳的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與一般色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)基本相同。

三、系統(tǒng)適用性試驗

為考察所配置的毛細管分析系統(tǒng)和設(shè)定的參數(shù)是否適用，系統(tǒng)適用性測試項目和方法與高效液相色譜法或氣相色譜法相同，相關(guān)的計算式和要求也相同。如重現(xiàn)性（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD）、理論塔板數(shù)（n）、分離度（R）、拖尾因子（T）等，可參照測定。具體指標(biāo)應(yīng)符合各品種項下的規(guī)定，特別是進樣精度和不同荷電溶質(zhì)遷移速度的差異對分析精密度的影響。

四、基本操作

1．按照儀器操作手冊開機，預(yù)熱，輸入各項參數(shù)，如毛細管溫度、操作電壓、檢測波長和沖洗程序等。操作緩沖液需過濾和脫氣。沖洗液、緩沖液等放置于樣品瓶中，依次放入進樣器。

2．毛細管的處理對測定結(jié)果影響很大。未涂層新毛細管要用較濃堿液在較高溫度（例如用1mol/L氫氧化鈉溶液，60℃）沖洗，使毛細管內(nèi)壁生成硅羥基，再依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、水和操作緩沖液各沖洗數(shù)分鐘。兩次進樣中間可僅用緩沖液沖洗。但若發(fā)現(xiàn)分離性能改變，則必須用0.1mol/L氫氧化鈉溶液沖洗，甚至要用濃氫氧化鈉溶液升溫沖洗。凝膠毛細管、涂層毛細管、填充毛細管的沖洗則應(yīng)按照所附說明書操作。沖洗時，將盛溶液的試樣瓶依次置于進樣器，設(shè)定順序和時間。

3．操作緩沖液的種類、pH值和濃度，以及添加劑[用以增加溶質(zhì)的溶解度和（或）控制溶質(zhì)的解離度，手性拆分等]的選定對測定結(jié)果的影響也很大，應(yīng)按照各品種項下的規(guī)定配制，根據(jù)初試的結(jié)果進行調(diào)整和優(yōu)化。

4．將待測供試品溶液瓶置于進樣器中，設(shè)定操作參數(shù)，如進樣壓力（電動進樣電壓）、進樣時間、正極端或負極端進樣、操作電壓或電流、檢測器參數(shù)等，開始測試。根據(jù)初試的電泳圖譜調(diào)整儀器參數(shù)和操作緩沖液以獲得優(yōu)化結(jié)果。而后用優(yōu)化條件正式測試。

5．測試完畢后，用水沖洗毛細管。注意將毛細管兩端浸入水中保存。如果毛細管長期不用，應(yīng)將毛細管用氮氣吹干。最后關(guān)機。

6．定量測定以內(nèi)標(biāo)法為宜。用加壓或減壓法進樣時，供試品溶液黏度會影響進樣體積，應(yīng)注意保持供試品溶液和對照溶液黏度一致；用電動法進樣時，被測組分因電歧視現(xiàn)象和溶液離子強度會影響遷移量，也要注意其影響。

（何勤 錢廣生）