第二節 色譜分離及鑒定

色譜法根據其分離原理可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與分子排阻色譜法等。

吸附色譜法是利用被分離物質對吸附劑吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫，使組分分離。常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質。

分配色譜法是利用被分離物質在兩相中分配系數的不同，使組分分離。其中一相被涂布或鍵合在固體載體上，被稱為固定相；另一相為液體或氣體，被稱為流動相。常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。

離子交換色譜法是利用被分離物質在離子交換樹脂上交換能力的不同，使組分分離。常用的樹脂有不同強度的陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂。流動相為水或含有機溶劑的緩沖液。

分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，是利用被分離物質分子大小不同導致其在填料上滲透程度不同，使組分分離。常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等。根據固定相和供試品的性質，一般選用水或有機溶劑作為流動相。

色譜法又可根據分離方法分為紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。所用溶劑應不與供試品發生化學反應、純度高。分析時的溫度，除氣相色譜法或另有規定外，系在室溫操作。分離后各成分的檢出，應采用各品種項下所規定的方法。采用紙色譜法、薄層色譜法或柱色譜法分離有色物質時，可根據其色帶進行區分；分離無色物質時，可在短波（254nm）或長波（365nm）紫外燈下檢視，其中紙色譜或薄層色譜也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質的薄層硅膠，采用熒光淬滅法檢視。柱色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法可用連接于色譜柱出口處的各種檢測器檢測。柱色譜法還可分部收集流出液后用適宜方法測定。

一、液-固色譜分離常用固定相

液-固色譜分離常用固定相的種類有多種，如硅膠、鍵合相硅膠、氧化鋁、活性炭、離子交換劑、大孔吸附樹脂、凝膠、聚酰胺等。上述固定相各具特點，可選擇用來分離不同類型的化合物。天然產物化學研究中，往往需采用不同的固定相進行多次有針對性的色譜分離，才能得到純化合物。下面就幾種常用液-固色譜分離固定相做簡單介紹。

1．硅膠。

硅膠色譜適用范圍廣，能用于非極性化合物、極性化合物，如芳香油、萜類、甾體、生物堿、苷類、蒽醌類、酚類、磷脂類、脂肪酸、氨基酸等及一系列合成產物的分離。

正相色譜硅膠是多孔性物質，可用通式SiO2·xH2 O表示。它具有多孔性的硅氧烷（siloxane）及—Si—O—Si—的交鏈結構，其骨架表面的硅醇（silanol）基團能通過氫鍵與極性或不飽和分子相互作用。硅膠的吸附性能取決于硅膠中硅醇基的數目及含水量。隨著水分的增加，其吸附能力降低（見表1-1）。當含水量超過12%，硅膠的吸附力極弱，不能用作吸附色譜的載體，只可用作分配色譜的載體。硅膠的表面積、表面結構、微孔體積及微孔半徑均會直接影響色譜分離的效果。

色譜硅膠應是中性、無色顆粒，由于在制備過程中接觸強酸，常呈酸性，故在使用前應檢查其水浸液的pH值，pH值不低于5時才可使用；否則應用水洗至中性，再在110℃活化24h。硅膠在甲醇、水等強極性溶劑中有一定的溶解度，約為0.01%。如溶液pH值大于9，則溶解度大幅度增加。

有時可以向硅膠中加入某種試劑，以改良其吸附性能，提高其分離效果。通常，AgNO3處理過的硅膠對不飽和烴類有極好的分離效果。改良吸附劑的制備一般是將含1%～10%填加試劑的水或丙酮溶液與硅膠混勻，待稍干后于110℃活化即可。

正相硅膠色譜可選擇的流動相種類相對較多，為得到好的分離效果，可選擇具有一定比例的多種溶劑的混合液作為流動相。可借助分析型硅膠薄層色譜的結果來摸索制備型色譜的分離條件。在實際色譜分離過程中，也可采用梯度洗脫方式。常用溶劑的介電常數見表1-2。

硅膠的再生一般可用乙醇或甲醇洗滌，除去溶劑，烘干，活化處理后即可。必要時用0.5%NaOH溶液浸泡、洗滌，過濾，水洗，再以5%～10% HCl浸泡、洗滌，最后用純化水洗至中性，110℃活化，過篩即可。

2．鍵合相硅膠。

硅膠表面的硅羥基能與正辛醇、氰乙醇及聚乙二醇等，在一定溫度下加熱脫水后生成單分子鍵合固定相（Si—O—C型），與十八烷基三氯硅烷生成烷基化學鍵合相（Si—O—Si—C型）。另外，用SOCl2將硅膠表面氯化后，可與各種有機胺反應生成具有Si—O—Si≡N鍵的各種不同極性基團的化學鍵合相。鍵合相硅膠對化合物的分離具有不同的選擇性，在液相色譜中占有重要地位，并普遍應用于高效液相色譜。

鍵合相硅膠根據粒度，可用于常壓至高壓的各種液相分離。在鍵合相硅膠中，以C18反相硅膠應用最為普遍，它對極性化合物和非極性化合物均適用。在利用鍵合相硅膠進行反相色譜時，常用甲醇-水、乙醇-水或乙腈-水為洗脫劑。可用具有相同鍵合相硅膠的薄層色譜或分析型高效液相色譜進行制備型色譜的洗脫劑選擇。

3．氧化鋁。

氧化鋁是一種常用的吸附劑，由氫氧化鋁直接在高溫下（約600℃）脫水制得。由于制備條件常為弱堿性，對于分離植物中的堿性成分（如生物堿）頗為理想，但不宜用于醛、酮、酯等類化合物的分離，因為有時堿性氧化鋁可與上述成分發生反應，如異構化反應和氧化反應等。可用水洗除去氧化鋁中的堿性雜質，再活化即得中性氧化鋁。目前，除了生物堿等堿性物質外，很少使用氧化鋁色譜，基本上被硅膠色譜所取代。氧化鋁吸附樹脂、葉綠素及其他雜質能力強，常用于預處理提取物，去除雜質，便于之后的分離與純化。硅膠對雜質的吸附能力較差，樣品處理量相應地比氧化鋁少。

氧化鋁的活性與含水量關系極大，一般在200℃左右加熱4h～6h活化，除去其中水分，可得Ⅰ～Ⅱ級氧化鋁；若要降低活性，可加入一定量的水。活化時，氧化鋁表面的氧能與水分子結合形成羥基，具有離子交換性質，但溫度不宜過高（＜400℃），否則會引起氧化鋁晶格的改變，導致其吸附力不可逆地下降，而不能用于色譜。通常色譜用氧化鋁為Ⅲ級，級別過高的氧化鋁吸附的選擇性能差，有時也可加適量乙酸來降低活性。表1-3列出了氧化鋁含水量與活性的比較。

同硅膠色譜一樣，在氧化鋁色譜中，極性溶劑的洗脫能力較非極性溶劑大，所以逐步遞增溶劑的極性可使吸附在氧化鋁柱上的不同化合物依極性大小依次洗脫，達到分離的目的。在實際操作中，主要根據薄層色譜展開情況來選擇柱色譜洗脫劑。

4．活性炭。

活性炭色譜是用來分離水溶性物質的主要方法之一，對植物中的某些苷類、糖類及氨基酸等成分具有一定的分離效果。由于活性炭價廉易得，因此適用于大量制備型色譜的分離。

活性炭一般分為動物炭、植物炭和礦物（煤）炭3種，分別由動物的骨頭、木屑、煤屑高溫炭化而成。目前市售的醫藥用活性炭及色譜用活性炭多以木屑作原料，加氯化鋅在700℃～800℃高溫炭化，活化，再經適當處理除去雜質而制成，最終通常呈粉末狀或顆粒狀。粉末狀活性炭顆粒極細、吸附力強，但流速慢，色譜過程中需要加壓或減壓操作，難以達到理想的流速。因此，色譜用活性炭通常呈顆粒狀，雖然總表面積減少，但流速易于控制。

活性炭的吸附作用，在水溶液中最強，在有機溶劑中較弱，故用于有機溶劑脫吸附。例如，以乙醇-水進行洗脫時，隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加，有時也用稀甲醇、稀丙酮、稀乙酸溶液洗脫。

活性炭對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物；對極性基團（如—COOH、—NH2、—OH等）多的化合物的吸附力大于極性基團少的化合物。因此，可以利用吸附性能的差別，將水溶性芳香族化合物與脂肪族化合物、氨基酸與肽、單糖與多糖分離開來。

使用前，應先將活性炭于120℃加熱4h～5h，將所吸附的氣體除去。使用過的活性炭可用稀酸、稀堿交替處理，然后水洗，加熱活化。有時，可將粉末狀活性炭制成顆粒狀錦綸活性炭或與硅藻土混合后裝柱，以增加流速，但顆粒狀活性炭吸附性能要比粉末狀活性炭低。

5．離子交換劑。

離子交換劑是高分子化合物，具解離性離子交換基團，在水溶液中能與其他陽離子或陰離子進行交換作用，而這種交換作用是可逆的。當兩種以上成分被“吸附”在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時，它們被洗脫的能力取決于各物質洗脫反應的平衡常數。利用物質“吸附”及“脫吸附”能力的不同進行分離，即離子交換色譜。目前，大部分采用合成離子交換劑，一種是單體在聚合前本身就含有交換基團；另一種是首先形成聚合物，然后引入交換基團，其中用途最廣的是離子交換樹脂。另外，也有在纖維素或多聚糖上人工引入交換基所成的離子交換劑，它們大多用于植物大分子蛋白質、核酸、酶及多糖體的分離和精制。

離子交換樹脂可分為兩大類，即陽離子交換樹脂與陰離子交換樹脂。

根據上述原理可采用不同型號的離子交換樹脂，將植物在水中具有一定溶解度的酸、堿成分與兩性成分分離開來，如圖1-12所示。植物中的生物堿，特別是水溶性生物堿可用陽離子交換樹脂分離與純化。

影響離子交換的因素如下：

（1）溶液的酸堿度。離子交換劑可以簡單地理解為一種高分子不溶性酸或堿，因此溶液的酸堿度對離子交換有很大地影響。當交換溶液中氫離子的濃度顯著增加時，因同離子效應，可抑制陽離子交換劑中酸性基團的解離，故離子交換反應進行大幅減少，甚至不進行。通常，強酸性交換劑交換液的pH值應大于2，弱酸性交換劑交換液的pH值應在6以上。同樣，在陰離子交換劑中，當溶液的pH值增大時，也會發生同樣的情況，故強堿性交換劑交換液的pH值應在12以下，弱堿性交換劑交換液的pH值應在7以下。

（2）交換離子的選擇性。離子交換劑對交換化合物來說，主要取決于化合物解離離子的電荷、半徑及酸堿性的強弱。解離常數大、酸堿性強者容易發生置換，但洗脫相對較難。解離離子價數越高，電荷越大，它的吸附性越強，越易交換在交換樹脂上。堿金屬、堿土金屬及稀土元素還與其原子序數有關，堿金屬和堿土金屬原子序數大，則交換吸附就強；稀土元素的原子序數小，其交換吸附弱。

（3）被交換物質在溶液中的濃度。離子交換操作通常是在水溶液或含有水的極性溶劑中進行的，這樣有利于解離與交換。濃度低的溶液對離子交換劑的選擇性大。在高濃度時，解離度會趨向降低，有時會影響吸附次序及選擇性。濃度過高時，還會引起樹脂表面及內部交聯網孔收縮，影響離子進入網孔。因此，一般實驗操作時，所用的溶液的濃度應略高，有利于提取和分離。

（4）溫度的影響。稀溶液溫度的改變對交換性能的影響不大，但當溶液濃度在0.1mol/L以上時，溫度升高，水合傾向大的離子容易發生交換吸附，同時離子的活性系數增大。對弱酸性、弱堿性交換劑來說，溫度對其交換率有較大的影響，一般溫度升高，離子交換速度加快。

（5）溶劑的影響。通常在水中進行交換，也可采用含水的極性溶劑。

此外，對交換樹脂本身來說，交聯度大，結構中的交聯網孔直徑小，大分子和離子就不容易進入；反之，交聯度小，交聯網孔直徑大，則易于離子的擴散與交換。因此，通過交聯度的大小可以改變交換樹脂對被交換物質的選擇性。樹脂顆粒的大小也會影響交換速率。顆粒小，表面積大，有利于與溶液中的離子接觸，交換速率增加。強酸性和強堿性的交換樹脂交換基團的解離能力強，容易與溶液中的離子交換。

6．大孔吸附樹脂。

大孔吸附樹脂是一種不含交換基團、具有大孔結構的高分子吸附劑，也是一種親脂性物質。大孔吸附樹脂具有各種不同的表面性質，如疏水的聚苯乙烯，可以有效地吸附具有不同化學性質的各種類型化合物，其吸附的特點是解吸附容易。當吸附過程是以親脂鍵為主時，隨著被吸附物的相對分子質量增加，吸附量也增加。吸附劑的表面積越大，吸附量越大。通常，大孔吸附樹脂的比表面積可達100m2/g～600m2/g，因此它又具有吸附容量大的特點。但對一些分子立體結構較大的有機化合物，還要考慮樹脂的孔徑，使分子能進入顆粒間隙。

大孔吸附樹脂具有選擇性好、機械強度高、再生處理方便、吸附速度快等優點，因此適用于水溶液中分離弱極性或非極性化合物。組分間極性差別越大，分離效果越好。混合組分在大孔吸附樹脂吸附后，一般依次用水、含水甲醇、乙醇或丙酮〔10%、20%……（體積分數）〕洗脫，最后用濃醇或丙酮洗脫。再生時，用甲醇或乙醇浸泡、洗滌即可，必要時可用1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液依次浸泡，然后用純化水洗滌至中性，浸泡在甲醇或乙醇中備用。使用前用純化水洗滌，除盡醇即可應用。

在分離的開始階段，先將強極性樣品通過聚合物載體，可很好地除去其中的親水性雜質（氨基酸、糖類等）。典型的分離過程是先采用大孔吸附樹脂色譜，再進行硅膠色譜、反相色譜及凝膠過濾等。

對強極性成分進行初步分離的另一方法是使用AmberliteXAD-2樹脂。這種樹脂可吸附多酚類化合物，因而被用于黃酮類成分的分離。在得到黃酮組分之后，可繼續采用其他吸附劑進行分離，得到黃酮單體。

20世紀70年代末，大孔吸附樹脂開始應用于中草藥化學成分的提取與分離。用于中草藥化學成分提取與分離的大孔吸附樹脂型號有D-101型、DA-201型、MD-05271型、GDX-105型、CAD-40型、XAD-4型、SIP系列、D-型等。常用的大孔吸附樹脂有D-101型、DA-201型（天津制膠廠）、D-型（天津骨膠廠）。

7．凝膠。

凝膠色譜法是20世紀60年代發展起來的一種分離分析技術，使用的固定相是凝膠。凝膠是具有許多孔隙的網狀結構的固體，具有分子篩的性質。當被分離物質的分子大小不同時，它們進入凝膠內部的能力不同。凝膠中的孔隙大小與分子大小有相近的數量級。當混合物通過凝膠時，比孔隙小的分子可以自由進入凝膠內部，而比孔隙大的分子就不能進入，因此不同孔徑的分子的移動速度就產生了差異。大分子不被遲滯而隨溶液流動較快，小分子則由于向孔隙內擴散或移動受到滯留，所以落后于大分子而得到分離（如圖1-13所示）。此法被稱為凝膠色譜（gel chromatography），在蛋白質及多糖等大分子化合物的分離中應用較普遍。

從理論上講，凝膠過濾柱是利用分子排阻效應來發揮分離效能的。但當將凝膠用于分離小分子時，溶劑、溶質、固定相之間的相互作用變得重要起來。凝膠可分為親水性凝膠和疏水性凝膠。

1）親水性凝膠

目前，最常用的親水性凝膠是交聯葡聚糖凝膠（Sephadex），是由葡聚糖（右旋糖酐）和甘油基通過醚橋（—O—CH2—CHOH—CH2—O—）相交聯而形成的多孔性網狀結構。交聯結構直接影響凝膠網狀結構中孔隙的大小。交聯度越大，網狀結構越緊密，孔隙越小，吸水時膨脹也越小；反之，交聯度越小，網狀結構越疏松，孔隙越大，吸水時膨脹的程度也就越大。根據交聯度的不同，所能分離成分的分子大小也不同。交聯度可用“吸水量”或“膨脹質量”來表示，即1g干凝膠所吸收的水的質量，英文字母G代表葡聚糖凝膠不同規格型號，阿拉伯數字為凝膠的吸水量乘以10的值，如G-25表示每克葡聚糖凝膠膨脹時吸水2.5g。

2）疏水性凝膠

在交聯葡聚糖分子上引入一個基團增大其親脂性，成為疏水性凝膠。例如，在Sephadex G-25中引入羥丙基基團形成醚鏈的結合狀態：R—OH→R—O—CH2CH2CH2OH，即成為Sephadex LH-20，從而使它不僅具有親水性，能吸水，而且可以膨脹，這就擴大了它的應用范圍，適用于分離難溶于水的親脂性成分。目前，在植物小分子化學成分分離中常使用Sephadex LH-20。表1-4列舉了Sephadex LH-20在不同溶劑中浸泡后的床體積。

一般來說，使用過的凝膠不需經任何處理，適當方法保存以備用。若加樣處顏色較深，可將此部分丟棄。若整個柱體的凝膠顏色較深，可用0.2mol/L NaOH溶液（內含0.5mol/L NaCl）處理，再用水洗凈。

利用Sephadex LH-20進行分子排阻色譜，對天然產物的分離具有重要意義。凝膠可根據混合物中各組分分子質量的不同對其進行分離，因此非常適用于從樣品中除去大分子成分及聚合物。

Sephadex LH-20過濾不僅可作為一種有效的初步分離手段，還可用于最后的分離工作，以除去微量的固體雜質、鹽類或其他外來物質。當純化合物的量很少時，通常在分離的最后階段使用Sephadex LH-20過濾法，原因之一在于它只導致極少的樣品損失。以凝膠過濾作為最初的純化手段也越來越常見。

8．聚酰胺。

聚酰胺（polyamide）是通過酰胺基團聚合而形成的一類高分子化合物，分子中含有豐富的酰胺基團，可與酚類、酸類、醌類、硝基類化合物等以氫鍵形式結合而被吸附，與不能形成氫鍵的化合物分離。

化合物分子中酚羥基數目越多，則吸附力越強；芳香核、共軛雙鍵越多，吸附力也強。易形成分子內氫鍵的化合物，其吸附力減弱。從聚酰胺柱上洗脫被吸附的化合物是通過溶劑分子取代酚類化合物來完成的，即以新的氫鍵代替原有氫鍵脫吸附而完成。通常，脫吸附劑是在水中遞增甲醇或乙醇的含量。如黃酮體苷元與苷的分離，當用稀醇作洗脫劑時，黃酮體苷比其苷元先洗脫下來，而以非極性溶劑作洗脫劑時，黃酮體苷元比苷先洗脫下來，這表明聚酰胺具有“雙重色譜”的性能，因聚酰胺分子中既有非極性的脂肪鍵，又有極性的酰胺基團。當用含水的極性溶劑作流動相時，聚酰胺作非極性固定相，其色譜行為類似反相分配色譜，所以黃酮體苷比苷元更容易洗脫。當用非極性氯仿-甲醇作流動相時，聚酰胺則作極性固定相，其色譜行為類似正相分配色譜，所以苷元比其苷更容易洗脫。因此，聚酰胺色譜除了上述化合物外，也可用于分離萜類、甾體、生物堿及糖類。

色譜中常用的聚酰胺是由己內酰胺聚合而成的聚酰胺-6（尼龍-6）及由己二酸與己二胺聚合而成的聚己二酰己二胺（尼龍-66）。其既親水又親脂，性能比較好，既可分離水溶性物質，又可分離脂溶性物質。它們可溶于濃鹽酸、甲酸，微溶于乙酸、苯酚等溶劑，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和苯等常用有機溶劑。它們對堿較穩定，對酸的穩定性較差，尤其是無機酸，溫度高時更敏感。

制備柱時，將顆粒狀聚酰胺混懸于水中用濕法裝柱。在用非極性溶劑系統時，則用組分中低極性的溶劑裝柱。一般100ml聚酰胺可上樣1.5g～2.5g，實際比例視具體情況而定。樣品先用洗脫溶劑溶解。若樣品不溶解于洗脫劑，可選用易揮發的有機溶劑溶解，拌入聚酰胺干粉中后將溶劑減壓蒸去，用濕法裝入柱頂。洗脫劑常采用水-乙醇（95∶5,9∶1,7∶3,1∶1,3∶7），或采用氯仿、氯仿-甲醇（19∶1,10∶1,5∶1, 2∶1,1∶1）依次洗脫。若仍有物質未洗脫下來，可采用稀氨水或稀甲酸胺溶液洗脫，并分段收集。使用過的聚酰胺一般用5%NaOH溶液洗滌，然后用水洗滌，再用10%乙酸洗滌，最后用純化水洗至中性即可。

聚酰胺薄膜色譜是將聚酰胺溶于甲酸并涂布在滌綸片基上制成的，待甲酸揮發、干燥后即可使用。它既可用于聚酰胺柱色譜探索分離條件，又可檢查柱色譜各洗脫部分的成分和純度。聚酰胺薄膜層析常用展開溶劑系統見表1-5。若在各種溶劑系統中加入少量酸或堿，可避免色譜中出現拖尾現象，使斑點清晰。

二、紙色譜法

紙色譜法是以紙為載體，以紙上所含水分或其他物質為固定相，用展開劑進行展開的分配色譜法。供試品經展開后，可用比移值（Rf）表示其各組成成分的位置（Rf=原點中心至斑點中心的距離/原點中心至展開劑前沿的距離）。影響Rf的因素較多，因而一般采用在相同實驗條件下與對照物質對比的方法以確定其異同。進行藥品鑒別時，供試品在色譜圖中所顯主斑點的位置與顏色（或熒光）應與對照品相同。進行藥品純度檢查時，可取一定量的供試品，經展開后，按各品種項下的規定，檢視其所顯雜質斑點的個數或呈色深度（或熒光強度）。進行藥品含量測定時，將主色譜斑點剪下洗脫后，再用適宜的方法測定。

1．儀器與材料。

（1）展開容器。

展開容器通常為圓形或長方形玻璃缸，稱為展開缸。缸上有磨口玻璃蓋，應能密閉。用于下行法時，蓋上有孔，可插入分液漏斗，用以加入展開劑。在近頂端有一用支架架起的玻璃槽作為展開劑的容器，槽內有一玻棒，用以壓住色譜濾紙；槽的兩側各支一玻棒，用以支持色譜濾紙，使其自然下垂，避免展開劑沿色譜濾紙與溶劑槽之間發生虹吸現象。用于上行法時，在蓋上的孔中加塞，塞中插入玻璃懸鉤，以便將點樣后的色譜濾紙掛在鉤上，并除去溶劑槽和支架。

（2）點樣器。

常用具支架的微量注射器或毛細管點樣，應能使點樣位置正確、集中。

（3）色譜濾紙。

色譜濾紙應質地均勻、平整，具有一定機械強度；不含影響展開效果的雜質；不應與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果，必要時可進行處理后再使用。用于下行法時，取色譜濾紙按纖維長絲方向切成適當大小的紙條，離紙條上端適當的距離（使色譜濾紙上端能足夠浸入溶劑槽內的展開劑中，并使點樣基線能在溶劑槽側的玻璃支持棒下數厘米處）用鉛筆劃一點樣基線。必要時，可將色譜濾紙下端切成鋸齒形，便于展開劑滴下。用于上行法時，色譜濾紙長約25cm，寬度則按需要而定，必要時可將色譜濾紙卷成筒形。點樣基線距底邊約2.5cm。

2．操作方法。

（1）下行法。

將供試品溶解于適宜的溶劑中制成一定濃度的溶液。用微量注射器或毛細管吸取溶液，點于點樣基線上。溶液宜分次點加，每次點加后，使其自然干燥、低溫烘干或經溫熱氣流吹干，樣點直徑為2mm～4mm，點間距離為1.5cm～2.0cm。樣點通常應為圓形。

將點樣后的色譜濾紙的點樣端放在溶劑槽內并用玻棒壓住，使色譜濾紙通過槽側玻璃支持棒自然下垂，點樣基線在支持棒下數厘米處。展開前，展開缸內用各品種項下規定的溶劑的蒸氣使之飽和，一般可在展開缸底部放一裝有規定溶劑的平皿，或將浸有規定溶劑的濾紙條附著在展開缸內壁上，放置一定時間，待溶劑揮發使缸內充滿飽和蒸氣。然后小心添加展開劑至溶劑槽內，使色譜濾紙的上端浸沒在槽內的展開劑中。展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙移動進行展開。展開至規定的距離后，取出色譜濾紙，標明展開劑前沿位置，使展開劑揮散后，按規定方法檢出色譜斑點。

（2）上行法。

上行法的點樣方法同下行法。展開缸內加入展開劑適量，放置待展開劑蒸氣飽和后，再下降懸鉤，使色譜濾紙浸入展開劑約0.5cm，展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙上升。除另有規定外，一般展開至約15cm后，取出晾干，按規定方法檢視。

展開可以采用單向展開，即向一個方向進行；也可采用雙向展開，即先向一個方向展開，取出，使展開劑完全揮發后，將濾紙轉動90°，再用原展開劑或另一種展開劑進行展開；亦可采用多次展開、連續展開或徑向展開等。

三、薄層色譜法

薄層色譜法是將供試品溶液點于薄層板上，在展開容器內用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的對照物按同樣方法所得的色譜圖對比，亦可用薄層色譜掃描儀進行掃描，用于鑒別、檢查或含量測定。

1．儀器與材料。

（1）薄層板。

①市售薄層板：市售薄層板分普通薄層板和高效薄層板，如硅膠薄層板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜等。

②自制薄層板：在保證色譜質量的前提下，可對薄層板進行特殊處理和化學改性，以適應供試品分離的要求，可用實驗室自制的薄層板。最常用的固定相有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254、微晶纖維素等，一般要求粒徑為10μm～40μm，加水或用羧甲基纖維素鈉水溶液（0.2%～0.5%）適量調成糊狀，均勻涂布于玻板上。使用涂布器涂布時，應能使固定相在玻板上形成一層符合厚度要求的均勻薄層。玻板應光滑、平整，洗凈后不附水珠。

（2）點樣器。

一般采用微升毛細管或手動、半自動、全自動點樣器材。

（3）展開容器。

上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸，展開時必須能密閉。水平展開使用專用的水平展開缸。

（4）顯色裝置。

噴霧顯色應使用玻璃噴霧瓶或專用噴霧器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代替；蒸氣熏蒸顯色可用雙槽展開缸或適宜大小的干燥器代替。

（5）檢視裝置。

檢視裝置為裝有可見光、254nm和365nm紫外光源及相應濾光片的暗箱，可附加攝像設備供拍攝圖像用。暗箱內光源應有足夠的光照度。

（6）薄層色譜掃描儀。

薄層色譜掃描儀是指用一定波長的光對薄層板上有吸收的斑點，或經激發后能發射出熒光的斑點，進行掃描，將掃描得到的譜圖和積分數據用于物質定性或定量的分析儀器。

2．操作方法。

（1）薄層板制備。

①市售薄層板：臨用前一般應在110℃活化30min。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板可根據需要剪裁，但必須注意剪裁后的薄層板底邊的硅膠層不得有破損。如在存放期間被空氣中的雜質污染，使用前可用氯仿、甲醇或二者的混合溶液在展開缸中上行展開預洗，晾干，110℃活化，置干燥器中備用。

②自制薄層板：除另有規定外，將1份固定相和3份水（或加有黏合劑的水溶液）在研缽中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩地移動涂布器進行涂布（薄層厚度為0.2mm～0.3mm）。取下涂好薄層的玻板，置水平臺上于室溫下晾干后，在110℃烘30min，最終置于有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度，在反射光及透視光下檢視，表面應均勻、平整、光滑，并且無麻點、無氣泡、無破損及無污染。

（2）點樣。

除另有規定外，在潔凈、干燥的環境中，用專用毛細管或配合相應的半自動、自動點樣器械點樣于薄層板上。樣點一般為圓點狀或窄細的條帶狀。點樣基線距底邊10mm～15mm，高效板基線一般距底邊8mm～10mm。圓點狀樣點的直徑一般不大于3mm，高效板一般不大于2mm。接觸點樣時，切勿損傷薄層表面。用半自動或自動點樣器械噴霧法點樣，條帶狀樣點的寬度一般為5mm～10mm，高效板一般為4mm～8mm。樣點間距離可視斑點擴散情況以相鄰斑點互不干擾為宜，一般不少于8mm，高效板供試品樣點間距離不少于5mm。

（3）展開。

將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距原點5mm為宜，密閉。除另有規定外，一般上行展開8cm～15cm，高效板上行展開5cm～8cm。溶劑前沿達到規定的展距，取出薄層板，晾干，待檢測。

展開前如需溶劑蒸氣預飽和，可在展開缸中加入適量的展開劑，放入薄層板，密閉，一般保持15min～30min。溶劑蒸氣預平衡后，展開。

（4）顯色與檢視。

若供試品含有可見光下有顏色的成分，可直接在日光下檢視，也可用噴霧法或浸漬法，以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在日光下檢視。對于有熒光的物質或遇某些試劑可激發產生熒光的物質，可在365nm紫外燈下觀察熒光斑點。對于在可見光下無色，但在紫外光下有吸收的成分，可用帶有熒光劑的薄層板（如硅膠GF254板），在254nm紫外燈下觀察熒光板面上的熒光物質淬滅形成的斑點。

（5）記錄。

薄層色譜圖像一般可采用攝像設備拍攝，以光學照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層掃描儀掃描或其他適宜的方式記錄相應的色譜圖。

3．系統適用性試驗。

按各品種項下要求，對實驗條件進行系統適用性試驗，即用供試品和對照品對實驗條件進行試驗和調整，以達到規定的檢測靈敏度、分離度和重現性要求。

（1）檢測靈敏度。

用于限量檢查時，采用供試品溶液和對照品溶液與稀釋若干倍的對照品溶液，在規定的色譜條件下，于同一薄層板上點樣、展開、檢視，后者應顯清晰的斑點。

（2）分離度。

用于鑒別時，對照品溶液與供試品溶液中相應的主斑點應顯示為兩個清晰的分離的斑點。用于限量檢查和含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度（R）的計算公式為

式中，d2為相鄰兩峰中后一峰與原點的距離，d1為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離；W1及W2分別為相鄰兩峰的峰寬。除另有規定外，分離度應大于1.0。

（3）相對標準偏差。

薄層掃描含量測定時，同一供試品溶液在同一薄層板上平行點樣的待測成分的峰面積測量值的相對標準偏差（RSD）應不大于5.0%，需顯色后測定的RSD應不大于10.0%。

4．測定法。

（1）鑒別。

取適宜濃度的對照溶液與供試品溶液，在同一薄層板上點樣、展開與檢視，供試品溶液所顯主斑點的顏色（或熒光）和位置應與對照溶液的斑點一致。

（2）限度檢查。

采用定量配制的對照品或稀釋的對照品作為對照。供試品溶液色譜中待檢查的斑點應與相應的對照品溶液或系列對照品溶液的相應斑點相當，顏色（或熒光）不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，測定峰面積，供試品的峰面積值不得大于對照品的峰面積值。必要時，應規定檢查的斑點數和限量值。

（3）含量測定。

按照薄層色譜掃描法，測定供試品中相應成分的含量。或將待測色譜斑點刮下洗脫后，再用適宜的方法測定。

5．薄層色譜掃描法。

薄層色譜掃描法是指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點，或經激發后能發射出熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分數據用于鑒別、檢查或含量測定。測定時，可根據不同薄層掃描儀的結構特點，按照規定方式掃描測定。一般選擇反射方式，采用吸收法或熒光法。除另有規定外，含量測定應使用市售薄層板。

掃描方法可采用單波長掃描或雙波長掃描。如采用雙波長掃描，應選用待測斑點無吸收或最小吸收的波長為參比波長，供試品色譜中待測斑點的Rf和光譜掃描得到的吸收光譜圖或測得的光譜最大吸收和最小吸收應與對照品相符，以保證測定結果的準確性。薄層掃描定量測定應保證供試品斑點的量在線性范圍內，必要時可適當調整供試品溶液的點樣量，供試品與對照品同板點樣、展開、掃描、測定和計算。

薄層色譜掃描用于含量測定時，通常采用線性回歸二點法計算。如線性范圍很窄，可用多點法校正多項式回歸計算。供試品溶液和對照品溶液應交叉點于同一薄層板上，供試品點樣不得少于2個，對照品每一濃度不得少于2個。掃描時，應沿展開方向掃描，不可橫向掃描。

四、柱色譜法

1．吸附柱色譜。

色譜柱為內徑均勻、下端縮口的硬質玻璃管，下端用棉花或玻璃纖維塞住，管內裝入吸附劑。吸附劑的顆粒應盡可能大小均勻，以保證良好的分離效果。除另有規定外，通常多采用直徑為0.07mm～0.15mm的顆粒。色譜柱的大小、吸附劑的品種和用量，以及洗脫時的流速，均應符合各品種項下的規定。

（1）吸附劑的填裝。

①干法：將吸附劑一次性加入色譜柱，振動管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入洗脫劑；或在色譜柱下端出口處連接活塞，自管頂加入適量的洗脫劑，旋開活塞使洗脫劑緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤濕、下沉，在管內形成松緊適度的吸附層。操作過程中，應保持有充足的洗脫劑留在吸附層上面。

②濕法：將吸附劑與洗脫劑混合，攪拌除去氣泡，再緩慢傾入色譜柱中，然后加入洗脫劑，將附著在管壁的吸附劑洗下，使色譜柱面平整。填裝的吸附劑用洗脫劑從色譜柱自然流下，至液面和柱表面相平時，即加供試品溶液。

（2）供試品的加入。

除另有規定外，將供試品溶于開始洗脫時使用的洗脫劑中，再沿管壁緩緩加入，注意勿使吸附劑翻起。或將供試品溶于適當的溶劑中，與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發去盡，并使混有供試品的吸附劑呈松散狀，加在已制備好的色譜柱上面。如供試品在常用溶劑中不溶解，可將供試品與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。

（3）洗脫。

除另有規定外，通常按洗脫劑洗脫能力大小遞增變換洗脫劑的品種和比例。分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時再改變洗脫劑的品種和比例。操作過程中，應保持有充足的洗脫劑留在吸附層的上面。

2．分配柱色譜。

分配柱色譜的方法與吸附柱色譜基本一致。裝柱前，先將載體和固定液混合，然后分次移入色譜柱中用帶有平面的玻棒壓緊。供試品可溶于固定液，混以少量載體，加在預制好的色譜柱上端。

洗脫劑需先加固定液混合使之飽和，以避免洗脫過程中固定液的流失。

五、高效液相色譜法

高效液相色譜法是采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內，各成分在色譜柱內被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。

1．對儀器的一般要求。

所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢測，并符合有關規定。

（1）色譜柱。

最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜，凝膠或高分子多孔微球等填充劑用于分子排阻色譜等，手性鍵合填充劑用于對映異構體的拆分分析。

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，均影響供試品的保留行為和分離效果。孔徑在15nm以下的填充劑適合分析相對分子質量小于2000的化合物，相對分子質量大于2000的化合物應選擇孔徑在30nm以上的填充劑。

以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用pH值為2～8的流動相。當pH值大于8時，可使載體硅膠溶解；當pH值小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH值大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當需使用pH值小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機-無機雜化填充劑等。

（2）檢測器。

最常使用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，其他常用的檢測器有二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發光散射檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。

紫外-可見分光檢測器、二極管陣列檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測溶液的濃度有關，還與待測物的結構有關；示差折光檢測器和蒸發光散射檢測器為通用型檢測器，對所有化合物均有響應；蒸發光散射檢測器對結構類似的待測物，其響應值幾乎僅與待測物的量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄待測物在規定波長范圍內的吸收光譜，故可用于待測物的光譜測定和色譜峰的純度檢查。

紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和示差折光檢測器的響應值與待測溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發光散射檢測器響應值與待測溶液的濃度通常呈指線關系，一般需經對數轉換。

不同的檢測器對流動相的要求不同。采用紫外-可見分光檢測器，所用流動相應符合紫外-可見分光光度法對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機溶劑的截止波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器不得使用含不揮發鹽的流動相。

（3）流動相。

可采用固定比例（等度洗脫）或按規定程序改變比例（梯度洗脫）的溶劑作為流動相。由于C18鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對于以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。

各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑和長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體的色譜系統并達到系統適用性試驗的要求。對于必須用特定型號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。

2．系統適用性試驗。

色譜系統的適用性試驗通常包括理論塔板數、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復性5項指標。

按各品種項下要求，對色譜系統進行適用性試驗，即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗，應符合要求。如達不到要求，可對色譜系統進行適當調整。

（1）色譜柱的理論塔板數（n）。

在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質色譜峰的保留時間（tR）和半高峰寬（Wh/2），tR、Wh/2可用時間或長度計（下同），但應取相同單位。按下列公式計算色譜柱的理論塔板數，即

（2）分離度（R）。

無論是定性鑒別，還是定量分析，均要求待測物質色譜峰與其他色譜峰內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。分離度的計算公式為

式中，為相鄰兩峰中后一峰的保留時間，為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1及W2分別為此相鄰兩峰的峰寬（如圖1-14所示）。除另有規定外，定量分析時分離度應不小于1.5。

（3）重復性。

取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次。除另有規定外，其峰面積測量值的RSD應不大于2.0%。也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子，其RSD應不大于2.0%。

（4）拖尾因子（T）。

為保證分離效果和測量精度，應檢查供試品色譜峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規定。拖尾因子計算公式為

式中，W0.05h為5%峰高處的峰寬，d1為峰頂在5%峰高處橫坐標平行線的投影點至峰前沿與此平行線交點的距離（如圖1-15所示）。

除另有規定外，峰高法定量時T值應為0.95～1.05。峰面積法測定時，T值偏離過大，會影響峰面積的檢測和定量的準確度。

（5）靈敏度：通常以信噪比（S/N）表示。通過測定一系列不同濃度的供試品或對照品溶液來測定信噪比。定量測定時，信噪比應不小于10；定性測定時，信噪比應不小于3。靈敏度可以用來評價色譜系統的檢測能力。

3．測定法。

（1）內標法加校正因子測定供試品中某種雜質或主成分含量。

按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液。精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子（f），即

式中，As為內標物質的峰面積或峰高，AR為對照品的峰面積或峰高；Cs為內標物質溶液的濃度，CR為對照品溶液的濃度。

再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，進樣，記錄色譜圖。測量供試品中待測成分（或其雜質）和內標物質的峰面積或峰高按下式計算，即

式中，Ax為供試品（或其雜質）的峰面積或峰高，Cx為供試品（或其雜質）溶液的濃度，A′s為內標物質的峰面積或峰高，C′s為內標物質的濃度，f為校正因子。

采用內標法，可避免因供試品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。

（2）外標法測定供試品中某種雜質或主成分含量。

按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液。分別精密取一定量，進樣，記錄色譜圖。測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積或峰高，按下式計算含量

式中，Ax為供試品（或其雜質）的峰面積或峰高，Cx為供試品（或其雜質）溶液的濃度，AR為對照品的峰面積或峰高，CR為對照品溶液的濃度。

由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中某種雜質或主成分含量時，以定量環或自動進樣器進樣為宜。

（3）加校正因子的主成分自身對照法。

測定雜質含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取雜質對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖。按前述方法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質的實測峰面積。這些需做校正計算的雜質，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數值一并載入各品種項下。

測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液，作為對照溶液，進樣，調節檢測靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進樣量（以色譜柱不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰的峰高達滿量程的10%～25%。除另有規定外，通常含量低于0.5%的雜質，峰面積的RSD應小于10%；含量在0.5%～2%的雜質，峰面積的RSD應小于5%；含量大于2%的雜質，峰面積的RSD應小于2%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣。除另有規定外，供試品溶液的記錄時間，應為主成分色譜峰保留時間的2倍。測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質含量。

（4）不加校正因子的主成分自身對照法。

當沒有雜質對照品時，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述“（3）加校正因子的主成分自身對照法”配制對照溶液并調節檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣。除另有規定外，供試品的記錄時間，應為主成分色譜峰保留時間的2倍。測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質含量。

（5）面積歸一化法。

由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此通常只能用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規定外，一般不宜用于微量雜質的檢查。其方法是測量各雜質的峰面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各雜質峰面積之和占總峰面積的百分率。

注意：本法進樣前的溶液應澄清，除另有規定外，供試品進樣前必須經0.45μm微孔濾膜過濾。

六、氣相色譜法

氣相色譜法是采用氣體為流動相（載氣）流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先后進入檢測器，用數據處理系統記錄色譜信號。

1．對儀器的一般要求。

所用的儀器為氣相色譜儀。氣相色譜儀由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統等組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均應根據分析要求進行適當設定。

（1）載氣源。

根據供試品的性質和檢測器種類選擇載氣。除另有規定外，常用載氣為氮氣。

（2）進樣部分。

進樣方式一般可采用溶液直接進樣或頂空進樣。

①溶液直接進樣：采用微量注射器、微量進樣閥或有分流裝置的氣化室進樣；進樣口溫度應高于柱溫30℃～50℃；進樣量一般為數微升，柱徑越細，進樣量應越少。采用毛細管柱時，一般應分流以免過載。

②頂空進樣：適用于固體和液體供試品中揮發性組分的分離和測定。將固體或液體供試品制成供試液后置于密閉小瓶中，在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發性組分在液態和氣態達到平衡后，由進樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。

（3）色譜柱。

色譜柱為填充柱或毛細管柱。

①填充柱：材質為不銹鋼或玻璃，內徑為2mm～4mm，柱長為2m～4m，內裝吸附劑、高分子多孔小球或涂漬固定液的載體，粒徑為0.18mm～0.25mm、0.15mm～0.18mm或0.125mm～0.15mm。常用載體為經酸洗并硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球。常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

②毛細管柱：材質為玻璃或石英，內壁或載體經涂布或交聯固定液，內徑一般為0.25mm、0.32mm或0.53mm，柱長為5m～60m，固定液膜厚0.1μm～5.0μm。常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛細管柱在使用前需老化處理，以除去殘留溶劑及易流失的物質。色譜柱如長期未用，使用前也應老化處理，使基線穩定。

（4）柱溫箱。

由于柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結果的重現性，因此柱溫箱控溫精度應在±1℃，且溫度波動小于每小時0.1℃。溫度控制系統分為恒溫和程序升溫兩種。

（5）檢測器。

適合氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器（FID）、熱導檢測器（TCD）、氮磷檢測器（NPD）、火焰光度檢測器（FPD）、電子捕獲檢測器（ECD）、質譜檢測器（MS）等。火焰離子化檢測器對碳氫化合物響應良好，適合檢測大多數的藥物；氮磷檢測器對含氮、磷元素的化合物靈敏度高；火焰光度檢測器對含磷、硫元素的化合物靈敏度高；電子捕獲檢測器適于含鹵素的化合物；質譜檢測器能給出供試品中某種成分相應的結構信息，可用于結構確證。除另有規定外，一般使用火焰離子化檢測器，用氫氣作為燃氣，空氣作為助燃氣。在使用火焰離子化檢測器時，檢測器溫度一般應高于柱溫，并不得低于150℃，通常為250℃～350℃，以免水汽凝結。

（6）數據處理系統。

數據處理系統可分為記錄儀、積分儀以及計算機工作站等。

各品種項下規定的色譜條件，除檢測器種類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外，其余如色譜柱內徑、長度、載體型號和粒度、固定液涂布濃度、載氣流速、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體品種并符合系統適用性試驗的要求。一般色譜圖于30min內記錄完畢。

2．系統適用性試驗。

除另有規定外，應照高效液相色譜法項下的規定進行。

3．測定法。

（1）內標法加校正因子測定供試品中某種雜質或主成分含量。

（2）外標法測定供試品中某種雜質或主成分含量。

上述（1）～（2）法的具體內容均同高效液相色譜法的相應部分。

（3）標準加入法測定供試品中某種雜質或主成分含量。

精密稱（量）取某種雜質或待測成分對照品適量，配制成適當濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入供試品溶液中，根據外標法或內標法測定雜質或主成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試液溶液中某種雜質和主成分含量。

也可按下述公式進行計算，加入對照品溶液前后校正因子應相同，即

則待測組分的濃度Cx可通過如下公式進行計算，即

式中，Cx為供試品中組分X的濃度，Ax為供試品中組分X的色譜峰面積，ΔCx為所加入的已知濃度的待測組分對照品的濃度，Ais為加入對照品后組分X的色譜峰面積。

氣相色譜法定量分析，當采用手動進樣時，由于留針時間和室溫等對進樣量的影響，使進樣量不易精確控制，故最好采用內標法定量；當采用自動進樣時，由于進樣重復性的提高，在保證進樣誤差的前提下，也可采用外標法定量。當采用頂空進樣時，由于供試品和對照品處于不完全相同的基質中，故可采用標準溶液加入法，以消除基質效應的影響。當標準加入法與其他定量方法結果不一致時，應以標準加入法結果為準。

（何勤 宋顥 錢廣生）