緩釋粉霧劑分析方法的建立及應(yīng)用

徐恩宇¹，李浩瑩²，劉俊亭^1*

（1．中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，沈陽 110122；2．蘇州惠仁生物科技有限公司，蘇州 215513）

與口服及注射方式相比，吸入式給藥途徑是治療呼吸系統(tǒng)疾病的黃金療法^[1,2]。吸入粉霧劑 （dry powder inhalers，DPI）是目前發(fā)展最快的肺吸入制劑，隨患者主動(dòng)吸氣氣流引發(fā)的藥物顆粒沉積在呼吸道的不同部位，空氣動(dòng)力學(xué)直徑在2μm以下的納微藥物顆粒能被肺泡吸收^[3]。通常，藥物沉積在肺部會(huì)被快速吸收，藥物的初期釋放往往存在“突釋現(xiàn)象”，可能造成局部給藥濃度過高，對(duì)人體組織或器官有潛在的不良反應(yīng)。因此，開發(fā)一種檢測(cè)吸入式藥物在肺部分布情況的方法顯得尤為重要。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器和試劑

1260型高效液相色譜儀（含G1312B雙元泵，G1329B型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1314F型紫外檢測(cè)器，OpenLAB CDS化學(xué)工作站，美國(guó)Agilent公司）；B-290小型噴霧干燥機(jī)（瑞士Büchi公司）；下一代藥用撞擊器（Next Generation Impactor，NGI，英國(guó)Copley Scientific公司）；RC806溶出試驗(yàn)儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）。

硫酸沙丁胺醇（Salbutamol Sulfate，SS，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；殼聚糖（200～400mPa·s）、殼聚糖（<200mPa·s）、羧化殼聚糖、磷酸二氫鉀（上海阿拉丁試劑有限公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Spectrum Chemicals & Laboratory Products Cali公司）；3號(hào)HPMC膠囊，（蘇州膠囊有限公司）。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1　硫酸沙丁胺醇緩釋粉霧劑的制備

分別稱取藥用輔料殼聚糖（Chitosan 200～400mPa·s），殼聚糖（<200mPa·s）和羧化殼聚糖各1.0g，分別加入0.5%醋酸水溶液100ml攪拌溶解，再分別精確加入2mg硫酸沙丁胺醇（SS），攪拌均勻，得質(zhì)量濃度1.0%的試液。噴霧干燥進(jìn)口溫度150℃，溶液泵速400ml/h，噴嘴壓縮空氣流量650L/h，真空度100%，出口溫度（84 ± 1）℃，噴嘴孔1.5mm。分別收集旋風(fēng)分離器底部1/3處和收集器中的粉末，并分裝于3號(hào) HPMC膠囊，產(chǎn)品儲(chǔ)存于棕色干燥器中。

1.2.2　硫酸沙丁胺醇HPLC分析方法的建立

參照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2010年版二部附錄VD）測(cè)定。硫酸沙丁胺醇（SS）化學(xué)名稱1-(4-羥基-3-羥甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇硫酸鹽，分子式(C₁₃H₂₁NO₃)₂?H₂SO₄，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

1.2.3　試劑的配制

磷酸二氫鈉緩沖液（0.08mol/L，pH = 3.15）：稱取磷酸二氫鈉12.48g，加超純水溶解并稀釋至1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.10 ± 0.05后，經(jīng)0.2μm微孔濾膜過濾脫氣后備用。

硫酸沙丁胺醇儲(chǔ)備液：精密稱取硫酸沙丁胺醇原料藥0.5000g加磷酸二氫鈉緩沖液溶解并稀釋至10ml，搖勻，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

空白輔料溶液：按處方工藝制備空白輔料粉末，稱取0.02g溶于100ml容量瓶中，加磷酸二氫鈉緩沖液溶解并稀釋至刻度，得空白輔料溶液備用。

1.2.4　色譜條件

色譜系統(tǒng)：Agilent 1260 infinity泵（1260 bin pump, G1312B），自動(dòng)進(jìn)樣器（1260 ALS, G1329B），紫外檢測(cè)器（1260 VWD, G1314F），Agilent化學(xué)工作站（OpenLAB CDS）；色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 (25mm×4.6cm, 5 μm)；保護(hù)柱：Eclipse XDB-C18 (4.6mm×12.5mm, 5 μm)；流動(dòng)相：磷酸二氫鈉緩沖液（0.08mol/L，pH = 3.15）：甲醇=80 : 20；流速0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)276nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量50μl；理論塔板數(shù)：按硫酸沙丁胺醇計(jì)算，應(yīng)不低于 3000。

硫酸沙丁胺醇的HPLC圖譜如圖2所示，在此條件下，硫酸沙丁胺醇的保留時(shí)間約為5.3min。

2　結(jié)果與討論

2.1　標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及線性關(guān)系的考察

精密量取硫酸沙丁胺醇儲(chǔ)備液，加磷酸二氫鈉緩沖液逐級(jí)稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別進(jìn)行HPLC測(cè)定，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣3次。以硫酸沙丁胺醇峰面積A對(duì)濃度c進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A = 22.55c + 0.039；R² =0.999，如圖3所示。

2.2　精密度

取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下低、中、高三組濃度樣品溶液，分別在日內(nèi)0h、5h、10h和日間1d、2d、3d重復(fù)測(cè)定，記錄峰面積A₁、A₂、A₃，計(jì)算日內(nèi)及日間精密度（RSD）結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，在所選擇的含量測(cè)定條件下，日間及日內(nèi)精密度較好，樣品穩(wěn)定性和方法重現(xiàn)性滿足分析要求。

2.3　回收率

一般制劑含量測(cè)定的回收率是向輔料中加入處方量80%、100%、120%已知含量的主藥，按含量測(cè)定的方法測(cè)定。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線一項(xiàng)操作方法，配制低、中、高三組濃度硫酸沙丁胺醇樣品液，測(cè)定其峰面積，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相應(yīng)濃度，回收率結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，在硫酸沙丁胺醇的高、中、低濃度范圍內(nèi)，3 組 9 次測(cè)定的平均回收率為99.8% ± 0.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于等于1.56%。結(jié)果表明：在所選擇的含量測(cè)定條件下，方法的回收率較好，輔料不干擾測(cè)定，該方法可以滿足硫酸沙丁胺醇含量測(cè)定的需要。

2.4　體外肺沉積性質(zhì)

吸入粉霧劑體外分布測(cè)定采用下一代藥用撞擊器（NGI），收集杯內(nèi)涂甘油層可預(yù)防粒子回彈。通常在 20℃相對(duì)濕低于 35 % 條件下模擬藥粉在肺部沉積狀況^{[4, 5]}：打開 NGI 鉸鏈蓋，放入經(jīng)甘油涂層的一套收集盤，再將預(yù)分離器、人工喉和入口適配器與NGI入口依次連接；取裝樣膠囊一粒（25mg），精密稱定重量W₁后，置于給藥裝置（Handihaler^?）內(nèi)，掀壓按鈕刺破膠囊，在60L/min抽氣流下給藥5s，稱定重量W₂，用小刷拭凈殘留內(nèi)容物，再稱定膠囊殼重量W₃；分別加入20ml超純水溶解給藥裝置（DEV）、人工喉（THR）、預(yù)分離器（SEP）和收集盤（S1～S8）各部分含藥粉末，精濾液進(jìn)行HPLC測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)將S2—S8級(jí)收集盤中檢測(cè)到的藥物總量定義為有效部位沉積量（FPD，粒徑小于4.46μm），其所占收集到全部藥物的百分比定義為有效部位沉積率（FPF）。膠囊內(nèi)容物的排空率按公式：[(W₁?W₂)/(W₁?W₃)]×100%計(jì)算，應(yīng)不少于90%。

2.5　溶出度考察

由于噴霧干燥所得含藥粉體粒徑小，藥物溶出面積大，撒入水中即可溶解，采用“槳法”以減少藥物擴(kuò)散邊界層厚度以提高藥物的擴(kuò)散系數(shù)來考察其溶解行為。精密稱定含 SS 粉末50mg，放入雙層紗布制成的松散口袋中，以500ml超純水為釋放介質(zhì)，水浴控溫（37± 0.1）℃，轉(zhuǎn)速50r/min，依法操作^[6]，分別于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)取樣2ml，精濾液進(jìn)行 HPLC 法測(cè)定含量，繪制溶出度曲線。

2.6　體外沉積率及排空率

以乳糖制劑作對(duì)照組，3種殼聚糖制劑中藥物的體外沉積性能見圖4。與乳糖制劑相比，殼聚糖載體中藥物粉末在人工喉（THR）處藥物截留量均顯著降低，且在下呼吸道處（S2-S8）的藥物沉積量明顯提高。此外，羧化殼聚糖制劑中藥物在S2—S4部分有效沉積量較高，而200～400mPa·s的殼聚糖制劑中藥物在S5—S8部分沉積量最多，即存在較多小于2μm的藥物顆粒，可經(jīng)肺泡吸收提高藥物生物利用度（p<0.05）。

由表3可以看出，3種殼聚糖制劑的排空率均超過90%，符合藥典要求；有效部位沉積率（FPF）達(dá)55%～65%，遠(yuǎn)高于乳糖制劑的11%，說明殼聚糖制劑粉粒大部分處于“可呼吸粒徑”范圍內(nèi)，顆粒間黏附力小、再分散性好，符合SEM和粒度分析結(jié)果。

2.7　粉霧劑體外釋放效果初評(píng)

乳糖、羧化殼聚糖、殼聚糖（<200mPa·s）和殼聚糖（200～400mPa·s）制劑的溶出度曲線見圖5。

由圖5可知，在初始1min，乳糖制劑中藥物釋放量超過 80%，說明乳糖載體不具有緩釋效果；然而3種殼聚糖制劑中藥物釋放量在40%～55%，“突釋”現(xiàn)象顯著下降，且在20min內(nèi)，藥物能釋放量均較平穩(wěn)。在指定時(shí)段內(nèi)，羧化殼聚糖中藥物基本釋放完全，小于200mPa·s的殼聚糖中SS釋放85%，200～400mPa·s的殼聚糖中SS釋放70%。藥物釋放的速度與程度與載體的分子量和溶解性密切相關(guān)。乳糖是一種小分子量（342.30g/mol）的化合物，極易溶解于水（25℃和40℃時(shí)水中溶解度分別為18.9g和25.1g）^[7]，所以在水中因其有效溶解使得藥物快速地被釋放，在1min內(nèi)釋放量超過80%，在5min達(dá)到完全釋放。作為一種殼聚糖修飾方式，殼聚糖羧化后可明顯改善其溶解性，與其他2種殼聚糖相比具有較高的溶解度^[8]，所以藥物在以羧化殼聚糖為輔料的制劑當(dāng)中獲得了較快的釋放速率，且達(dá)到平衡時(shí)藥物可基本獲得完全釋放。殼聚糖溶解性還與其分子量有關(guān)，分子量越大，其溶解性就越差^[9]。而黏度是分子量的外在表現(xiàn)，黏度越高，相對(duì)分子質(zhì)量越大，在水中的溶解度就越低。所以高黏度殼聚糖（200～400mPa·S）比低黏度殼聚糖（<200mPa·S）更能促進(jìn)藥物的緩釋效果。達(dá)到釋放平衡時(shí)在高黏度殼聚糖（200～400mPa·S）中藥物的釋放量為65%，在低黏度的殼聚糖（<200mPa·S）中的藥物釋放量為80%。這個(gè)可能是高相對(duì)分子質(zhì)量的聚合物具有更大的吸附能力，小分子的藥物吸附于聚合物的長(zhǎng)鏈上而未能獲得自由釋放于水溶液中，從而造成高黏度高相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖所獲得了較少的藥物釋放量。通過這些基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)可以得出，盡管對(duì)藥物釋放量有所影響，但所采用的3種殼聚糖對(duì)藥物均有一定的緩釋作用，而且相對(duì)分子質(zhì)量升高可進(jìn)一步延緩藥物的釋放，獲得更好的緩釋效果。可以預(yù)期這些系統(tǒng)的一種或幾種的組合來調(diào)控藥物的釋放速率從而滿足臨床的特定需求。

3　結(jié)論

本研究采用目前較先進(jìn)的新一代藥用撞擊器考察粉霧劑體外沉積性能，發(fā)現(xiàn)不同殼聚糖制劑中藥物在呼吸道中的沉積位置和沉積量存在顯著差異。羧化殼聚糖制劑可治療氣管和支氣管等局部疾病；分子量介于 200～400mPa·s間的殼聚糖制劑粒徑更小可經(jīng)肺泡吸收，達(dá)到全身給藥治療目的。因此，處方中添加不同分子量的輔料在藥劑研究中同樣需要引起重視，尤其對(duì)局部靶向給藥具有指導(dǎo)意義。

藥物在體內(nèi)吸收速度常由溶解速率決定，易溶性藥物也會(huì)因制劑的處方和工藝不同導(dǎo)致藥物溶出度有很大差異，從而影響藥物生物利用度和療效。目前各國(guó)藥典均未提出考察粉霧劑緩釋效果的標(biāo)準(zhǔn)方法，本研究發(fā)現(xiàn)加入殼聚糖后藥物的“突釋”現(xiàn)象明顯下降，且在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)藥物釋放穩(wěn)定，且隨著殼聚糖分子量的增加，粉霧劑緩釋效果逐漸提高，其緩釋機(jī)理有待進(jìn)一步闡明?？偨Y(jié)所有體外數(shù)據(jù)分析可知，本方法用于吸入式藥毒物在肺部分布情況的研究是可行的，具有一定的臨床應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。

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^*通信作者：劉俊亭，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向法醫(yī)毒物分析，E-mail: liujunting8@163.com