金花葵中黃酮類物質的液相色譜法分析

臧健，李宏博，吳正超，劉文娥，李亮亮^*

（沈陽農業大學，遼寧 沈陽 110866）

金花葵，又名菜芙蓉、野芙蓉、有的地區別名叫黏干或山榆皮，是錦葵科秋葵屬一年生草本植物，在200多種秋葵植物中最具食用、藥用、保健價值^[1]。該物種原已被國內外生物界定為絕種植物，直到2003年8月被中國農業科學研究院在河北邢臺地區意外發現，經多年重新栽培繁育，目前全國范圍內包括黑龍江、遼寧、山東、山西等地種植面積超過萬畝^[2]。

黃酮類化合物具有抗氧化、調節機體免疫力、降低心血管疾病發生、抗炎、降血糖等生理活性^[3]。有報道^[4]稱金花葵中黃酮含量高達干重 5.6%，是已知天然產物中含量最高者。目前，研究者^[5-7]多以金絲桃苷作為金花葵中黃酮類物質的活性指標，而其所含黃酮具體種類有哪些還未見報道。本文利用HPLC法對金花葵中的黃酮物質的種類及其含量做了初步探索，為金花葵的進一步開發利用提供了依據。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　樣品來源

金花葵樣品取自沈陽林昰商貿有限公司位于遼寧省本溪市桓仁縣的六道溝種植園，在金花葵八九月份的開花期，由人工采摘（帶花托），經低溫（45～50℃）烘干3天，密封保存。

1.1.2　主要試劑

金絲桃苷、槲皮素、蘆丁、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷等標準樣品，購自成都曼斯特生物科技有限公司；分析純甲醇及磷酸，天津康科德科技有限公司；色譜純甲醇、乙腈，迪馬公司；純凈水，浙江娃哈哈集團公司。

1.1.3　主要儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配有四元低壓梯度泵、二極管陣列檢測器；思博爾系列C18柱（4.6mm × 250mm，5μm）（迪馬公司）；萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）； KQ-500DB 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；制樣粉碎機（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）。

1.2　方法

1.2.1　色譜條件

C18柱（4.6mm × 250mm，5μm），流動相為A. 乙腈，B. 0.05%磷酸溶液，梯度洗脫程序為（以A相為準）：0→25min，12%→35%A；25→27min，35%→12%A；27→32min，12%A；流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長355nm，進樣量20μl。

1.2.2　樣品處理

取1.1.1中樣品用剪刀剪碎成小塊，再用粉碎機粉碎，過100目篩后轉移至密封袋保存。取5g于燒杯中，加70%甲醇水溶液100毫升，于30℃下超聲震蕩50min，過濾并轉移至100ml上述樣品升容量瓶，用70%甲醇水溶液定容至刻度，制成樣品提取液。取1ml過0.22μm濾膜準備上機。

1.2.3　標準溶液配制

分別準確稱取金絲桃苷8.5mg、槲皮素3.7mg、蘆丁10.4mg、牡荊素5.2mg、牡荊素鼠李糖苷11.6mg 于 10ml 容量瓶中，用甲醇定容制成濃度分別為 0.85mg/ml、0.37mg/ml、1.04mg/ml、0.52mg/ml、1.16mg/ml的原始儲備液，再取上述溶液各2ml混合，制成混合標準樣品儲備液，?20℃保存備用。

2　測定與分析

2.1 HPLC方法建立

2.1.1　流動相的選擇

為實現樣品中所有黃酮類化合物的最佳分離，我們在流動相的選擇上嘗試了水-甲醇、水-乙腈、磷酸水-甲醇、磷酸水-乙腈等組合，前三者均有保留時間長，峰型較寬的問題，因此我們選擇了磷酸水-乙腈為流動相。

磷酸水溶液的濃度選擇：我們先后考察了濃度為0.01%、0.05%、0.1%及0.2%的磷酸水溶液與乙腈組成流動相，發現0.05%～0.2%的比例時分離良好，而磷酸濃度較低時，分離出現色譜峰展寬現象，綜合考慮流動相酸度對色譜柱及儀器的影響，最終選擇0.05%磷酸水溶液與乙腈組合作為流動相。

洗脫方式選擇：嘗試各種比例的等度洗脫后，發現均不能達到滿意效果，尤其是牡荊素與蘆丁很難實現分離，最終確定梯度洗脫程序如下（以A相變化為準）：0→25min，12%→35%A；25→27min，35%→12%A；27→32min，12%A。實驗結果表明，按上述梯度洗脫程序進行分離，5種黃酮分離情況良好，圖1為5種黃酮標準樣品的色譜圖。

2.1.2　檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器，在2.1.1條件下對五種黃酮類物質進行吸收光譜掃描，得到最大吸收波長結果為：牡荊素鼠李糖苷342nm；牡荊素340nm；蘆丁355nm；金絲桃苷355nm；槲皮素372nm，綜合考慮我們將檢測波長確定為355nm。

2.1.3　流速的選擇

實驗考察了流動相流速為0.6～1.2ml/min時，5種黃酮混合標準品及金花葵樣品的分離情況，發現流速為1.0ml/min時分離效果最佳。

2.1.4　柱溫的選擇

實驗考察了色譜柱溫度分別為25℃、30℃、35℃時，5種黃酮混合標準品及金花葵樣品的分離情況，發現色譜柱溫度為25℃時，色譜峰寬較窄，分離效果最佳，因此確定色譜柱溫度為25℃。

2.2　方法學考察

2.2.1　回歸方程、檢測限及精密度

將1.2.3中混合儲備液逐級稀釋成不同濃度，按2.1中色譜條件測定峰面積，并分別以目標物色譜峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，分別得到金絲桃苷、槲皮素、蘆丁、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷的回歸方程、相關系數和線性范圍見表1。以3倍信噪比確定檢測限，結果見表1。

取一定濃度的混合對照品溶液，連續進樣6次，進行峰面積和保留時間的精密度考察，結果亦列于表1。表1的結果表明，5種組分峰面積和保留時間的RSD值均較小，表明色譜系統精密度良好。

按1.2.2中方法平行制備6份樣品，測定并計算金絲桃苷、槲皮素、蘆丁、牡荊素鼠李糖苷4種黃酮含量的相對標準偏差分別為1.82%、1.67%、1.47%和1.64%，表明方法精密度良好。

2.2.2　樣品穩定性

取新制備的一份樣品溶液，室溫下放置0、2h、4h、8h、12h、24h、48h后進樣分析，金絲桃苷、槲皮素、蘆丁、牡荊素鼠李糖苷的峰面積相對標準偏差分別為1.16%、1.44%、1.29%、和1.47%，表明供試品溶液在48h內穩定。

2.2.3　加標回收率

取金花葵（花）樣品12份，分為4組，每組3份。每組樣品中分別精密加入混合標準品儲備液0、20μl、50μl、100μl，按前述方法進行樣品的制備和測定，計算金絲桃苷、槲皮素、蘆丁、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷的含量，計算各組分的回收率，所有組分的回收率在95.20%～99.48%范圍內，RSD值均小于2.24%，說明本方法準確可靠。

2.3　樣品測定與分析

將樣品按1.2.2方法處理后，以2.1中方法進行測定，色譜圖見圖2。由色譜結果可知：金花葵中黃酮類物質和含量較高，總量可達到4.87g/100g，其中含量最多者為金絲桃苷，其含量達占了全部黃酮的23.31%，絕對含量為1.13g/100g，這與前人的研究結果相符。另外，我們發現樣品黃酮種類很多，實驗中共分離出黃酮類物質色譜峰63個，其中相對含量超過1%的就有13種，占所有黃酮含量的85.15%；此外，在樣品中可以確認有除金絲桃苷外，還有蘆丁（7.513%）、槲皮素（2.161%），牡荊素鼠李糖苷（3.346%）而未見牡荊素。樣品中黃酮含量信息見表2。

3　結論與討論

黃酮類物質是預防心血管疾病、防癌抗癌、調節免疫、抗衰老、抗菌抗病毒、抗炎抗過敏、止血鎮痛等諸多功效，金花葵這一寶貴的食用、藥用植物在經歷瀕危之后，現在正迅速的成為種植的熱點，本實驗建立了高效液相色譜法分離分析其黃酮類物質的方法，該方法分離效果令人滿意，實驗中發現其黃酮種類豐富，含量較高，經確認的有4種，分別是金絲桃苷、牡荊素鼠李糖苷、蘆丁和槲皮素，其中金絲桃苷含量達到 1.13g/100g。另外值得注意的是金花葵中黃酮種類達63種之多，其中含量超過1%的就有13種。因此，金花葵中黃酮的其他種類及其作用有必要繼續深入研究。

參考文獻

[1] 盧丹. 中國藥物評價, 2015, 32(2): 90-92.

[2] 馬永剛. 中國食品報, 2015年9月18日, 第002 版.

[3] 姜廷福. 分析測試技術與儀器, 2002, 8(4): 582-585.

[4] 楊秀松. 中國藥師, 2013, 16(9): 1307-1311.

[5] 易劍峰. 宜春學院學報: 自然科學, 2007, 29(4): 72-97.

[6] 仇燕. 安徽農業科學, 2011, 39(14): 8331-8333.

[7] 邱金玲. 中醫學報, 2015, 30(211): 1793-1795.

^*通信作者：李亮亮，男，副教授，博士，從事設施園藝及農業環境生態的研究，E-mail：LLL204600@163.com