任務(wù)實(shí)施

操作1　微生物形態(tài)鏡檢觀察

一、目的要求

1.了解顯微鏡的構(gòu)造及成像原理

2.熟悉細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌等微生物的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)

二、顯微鏡的構(gòu)造

顯微鏡的構(gòu)造見54頁(yè)。

注：顯微鏡的總放大倍數(shù)=物鏡放大倍數(shù)×目鏡放大倍數(shù)

三、儀器與試劑

1.實(shí)驗(yàn)器材

普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、標(biāo)本片（細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌等）。

2.實(shí)驗(yàn)試劑

二甲苯、香柏油。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

顯微鏡的使用方法主要包括7步：

1.準(zhǔn)備工作

小心取出顯微鏡，鏡臂正對(duì)操作人員，放于離桌邊5～10cm的位置。凳子的高低調(diào)至合適，并保持顯微鏡不傾斜。

2.調(diào)節(jié)光源

將低倍物鏡與目鏡正確組合，通過目鏡觀看同時(shí)調(diào)節(jié)光源強(qiáng)度至最佳。

3.放置標(biāo)本

下降載物臺(tái)，用玻片夾固定玻片標(biāo)本，并移動(dòng)菌樣至通光孔中央位置。

4.低倍物鏡觀察

通過緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使低倍物鏡鏡頭下端接近于玻片，同時(shí)用眼觀察找到圖像“閃爍點(diǎn)”，立刻更換細(xì)準(zhǔn)焦螺旋前后轉(zhuǎn)動(dòng)，直至找到清晰圖像為止。

5.高倍物鏡觀察

低倍物鏡下，調(diào)整圖像位置于視野中央（即目鏡指針針尖處），接下來轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器至高倍物鏡正確位置（伴有“咔嚓”聲），最后微調(diào)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋即可獲得清晰圖像。

6.油鏡觀察

首先下降載物臺(tái)約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正確位置，接下來在標(biāo)本片鏡檢部位滴加香柏油一滴，從側(cè)面觀察，將油鏡鏡頭浸入香柏油中，最后目鏡觀察調(diào)節(jié)合適光線強(qiáng)度，用粗、細(xì)準(zhǔn)焦螺旋找到清晰圖像，并繪制視野圖像標(biāo)注樣品名稱和放大倍數(shù)。

7.觀察完畢，顯微鏡清潔還原

油鏡鏡頭清潔要用三張擦鏡紙。第一張擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油，第二張擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭上殘留的油跡，第三張擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。另外，可用柔軟的綢布擦拭顯微鏡的金屬部件。顯微鏡還原主要包括關(guān)閉電源、物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形、載物臺(tái)下降、加蓋防塵罩并歸位等操作。

五、數(shù)據(jù)記錄與處理

繪制標(biāo)本片的視野圖。

六、操作注意事項(xiàng)

（1）取放載玻片，要先下降載物臺(tái)，再取放。

（2）不要用手觸摸顯微鏡光學(xué)部件，保持光學(xué)系統(tǒng)表面清潔。

（3）使用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋微調(diào)時(shí)，如遇到不能繼續(xù)向同一方向轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，應(yīng)立刻向相反方向轉(zhuǎn)動(dòng)準(zhǔn)焦螺旋。

（4）使用高倍物鏡時(shí)，由于物鏡與標(biāo)本之間距離很近，要特別小心，以免損壞物鏡鏡頭。

任務(wù)評(píng)價(jià)

思考與交流

1.顯微鏡最重要部件是什么？

2.如何正確使用顯微鏡？

3.如何正確處理有污物的物鏡鏡頭？

操作2　水浸標(biāo)本片制作

一、目的要求

1.掌握水浸標(biāo)本片的制作過程

2.熟悉簡(jiǎn)單染色方法

二、方法原理

水浸標(biāo)本的制作技術(shù)是研究微生物的一種主要方法。大多數(shù)的微生物由于個(gè)體微小，肉眼不適合觀察；另外細(xì)胞內(nèi)的各個(gè)結(jié)構(gòu)，由于其折射率相差很小呈現(xiàn)無色，即使光線可透過，也難以辨明。但在經(jīng)過固定、染色、包埋等處理后就可把材料做成較薄的水浸片，可以顯示不同細(xì)胞組織的形態(tài)及其中某些化學(xué)成分含量的變化，在顯微鏡下即可清楚地看到其中不同的區(qū)域組分狀態(tài)。

三、儀器與試劑

1.實(shí)驗(yàn)器材

普通光學(xué)顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、吸水紙、鑷子、酒精燈等。

2.實(shí)驗(yàn)試劑

生理鹽水、呂氏堿性美藍(lán)或齊氏石炭酸復(fù)紅染液。

3.實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)菌平板或細(xì)菌斜面。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）擦拭載玻片和蓋玻片　將清洗好的載玻片和蓋玻片用清潔的紗布擦干。其方法是擦拭載玻片時(shí)，左手拇指和食指夾著其短邊的邊緣，右手拇指和食指持清潔的紗布沿長(zhǎng)邊往返，在上下兩面同時(shí)輕輕擦拭。擦拭蓋玻片，方法與載玻片相似，但要先持兩對(duì)邊擦拭后，再旋轉(zhuǎn)90°持另兩對(duì)邊進(jìn)行二次擦拭。

（2）在擦拭好的載玻片正中央加滴一滴生理鹽水。

（3）用滅菌的接種環(huán)挑取菌樣，均勻涂抹在載玻片中間的生理鹽水中，然后滴加染色劑進(jìn)行染色。

（4）用鑷子夾住蓋玻片一邊，將另一邊放入載玻片水滴中，使蓋玻片傾斜，來回拖拉一次，然后慢慢地放下另一邊，輕輕抽出鑷子，并用吸水紙把多余的蒸餾水吸干，水浸標(biāo)本片制作完成。

（5）將標(biāo)本片置于顯微鏡觀察，并繪制視野圖像。

五、數(shù)據(jù)記錄與處理

繪制水浸標(biāo)本片的視野圖。

六、操作注意事項(xiàng)

（1）擦拭載玻片和蓋玻片，一手用食指和拇指輕輕夾住載玻片的邊緣，另一只手拿紗布將載玻片放在兩層紗布之間，用食指和拇指夾住輕輕擦拭，用力要均勻。此外，由于蓋玻片小而薄，擦拭時(shí)必須小心。

（2）用滴管在載玻片中央滴加蒸餾水要適量，水滴太小容易產(chǎn)生氣泡或干涸影響觀察，水滴太大容易溢出載玻片而污染物鏡鏡頭。

（3）接種環(huán)挑取菌樣要少許，涂抹要均勻，過多的菌樣反而影響觀察結(jié)果。

（4）加蓋蓋玻片要熟練，防止出現(xiàn)氣泡。

任務(wù)評(píng)價(jià)

思考與交流

1.如何清潔載玻片和蓋玻片？

2.如何加蓋蓋玻片才不會(huì)產(chǎn)生氣泡？

3.為什么制作水浸標(biāo)本片時(shí)不要挑取過多菌樣？

操作3　常用染色技術(shù)

一、目的要求

1.掌握簡(jiǎn)單染色的步驟

2.掌握革蘭氏染色法的步驟和關(guān)鍵點(diǎn)

3.學(xué)會(huì)識(shí)別細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果

4.了解無菌操作技術(shù)

二、方法原理

（一）簡(jiǎn)單染色

利用單一染料對(duì)菌體進(jìn)行染色的方法稱為簡(jiǎn)單染色。常用的微生物細(xì)胞染料分為堿性染料和酸性染料，前者包括美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、沙黃（番紅）及孔雀綠等，后者包括酸性復(fù)紅、伊紅及剛果紅等。簡(jiǎn)單染色以堿性染料進(jìn)行，原因是微生物細(xì)胞在堿性、中性及弱酸性溶液中通常帶負(fù)電荷，而染料電離后染色部分帶正電荷，易與細(xì)胞結(jié)合使其著色，有利于觀察。

（二）革蘭氏染色

革蘭氏染色與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的肽聚糖層較厚，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結(jié)晶紫-碘的紫色復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色；而革蘭氏陰性細(xì)菌的肽聚糖層很薄，脂多糖含量高，經(jīng)乙醇處理后部分細(xì)胞壁可被溶解并改變其組織狀態(tài)，細(xì)胞壁孔徑變大，因而結(jié)晶紫-碘紫色的復(fù)合物容易被洗脫至無色。再經(jīng)沙黃復(fù)染后，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

三、儀器與試劑

1.實(shí)驗(yàn)器材

普通光學(xué)顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、吸水紙、鑷子、酒精燈等。

2.實(shí)驗(yàn)試劑

蒸餾水、生理鹽水、呂氏堿性美藍(lán)溶液、草酸銨結(jié)晶紫溶液、革蘭氏碘液、95%乙醇、沙黃染液。

3.實(shí)驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌斜面、金黃色葡萄球菌斜面、大腸桿菌斜面。

四、測(cè)定步驟

（一）簡(jiǎn)單染色

1.涂片

取一塊載玻片，滴一滴生理鹽水于中央，用接種環(huán)按無菌操作要求挑取少許枯草芽孢桿菌于載玻片上的生理鹽水中，涂抹均勻。按上述操作也可制作大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等涂片。

2.干燥

自然干燥或用電吹風(fēng)干燥。

3.固定

涂菌面朝上，通過酒精燈外焰往返移動(dòng)3～5次。

4.染色

將載玻片平放于載玻片支架上，滴加呂氏堿性美藍(lán)染液于涂菌部位進(jìn)行染色，時(shí)間1～2min。

5.水洗

染色完畢后進(jìn)行蒸餾水沖洗，可用吸水紙吸去多余水分，并自然干燥或電吹風(fēng)吹干。

6.鏡檢

將制備好的樣品置于顯微鏡下觀察，記錄。

（二）革蘭氏染色

1.涂片

在載玻片中央滴一滴無菌生理鹽水，用滅菌的接種環(huán)挑取菌樣（菌樣可為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）在生理鹽水中涂成薄層，并進(jìn)行干燥。

2.固定

用鑷子夾住載玻片一端，菌樣面朝上，在酒精燈外焰往返移動(dòng)3～5次。待冷卻后染色。

3.初染

滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。

4.媒染

滴加革蘭氏碘液，染色1min，水洗。

5.脫色

滴加95%乙醇脫色約15～30s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。

6.復(fù)染

滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、干燥。

7.鏡檢

使用顯微鏡油鏡鏡檢觀察。

五、數(shù)據(jù)記錄與處理

繪制出各種染色后的視野圖。

六、操作注意事項(xiàng)

（1）選用活躍生長(zhǎng)期菌種染色，老齡的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌會(huì)被染成紅色而造成假陰性。

（2）涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽(yáng)性。

（3）脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟，脫色不夠易造成假陽(yáng)性，脫色過度易造成假陰性。

任務(wù)評(píng)價(jià)

思考與交流

1.染色過程中如何實(shí)現(xiàn)固定操作？

2.簡(jiǎn)單染色為什么要用堿性染色劑？

3.革蘭氏染色的步驟是什么？關(guān)鍵操作是哪一步？

操作4　菌落形態(tài)觀察

一、目的要求

1.了解細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌四類微生物的菌落形態(tài)特征

2.掌握常見微生物菌落的特征描述

二、方法原理

依據(jù)微生物菌落形態(tài)要點(diǎn)完成菌落描述。

三、儀器與試劑

1.實(shí)驗(yàn)器材

恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、酒精燈、接種環(huán)等。

2.實(shí)驗(yàn)試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。

3.實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌、釀酒酵母、啤酒酵母、根霉、曲霉、青霉、毛霉等。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

菌落特征觀察內(nèi)容：

1.菌落形態(tài)

主要包括形狀、透明度、邊緣狀況等。

2.大小

描述菌落大小。

3.表面狀況及隆起度

主要包括菌落表面濕潤(rùn)情況、黏稠度、隆起度、厚度、孢子狀態(tài)等。

4.質(zhì)地

菌落的致密或疏松情況。

5.培養(yǎng)基上蔓延程度

觀察菌落在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)延伸情況。

6.與培養(yǎng)基結(jié)合程度

主要指菌落與培養(yǎng)基結(jié)合的牢固或松軟，是否容易挑取。

7.顏色

要從正面、背面、邊緣、中心等多方面描述菌落的顏色，同時(shí)注意不同方面的色差情況。

8.氣味

通過嗅覺來判斷菌落散發(fā)的氣味。

最后，根據(jù)觀察正確描述各類微生物菌落特征，填寫記錄表。

五、數(shù)據(jù)記錄與處理

六、操作注意事項(xiàng)

菌落形態(tài)要觀察仔細(xì)、詳盡，菌落特征描述要規(guī)范、準(zhǔn)確、科學(xué)。

任務(wù)評(píng)價(jià)

思考與交流

1.為什么菌落正反面顏色會(huì)出現(xiàn)色差？

2.描述菌落特征時(shí)，主要從哪些方面入手？

3.試比較一下放線菌與霉菌的菌落特征、細(xì)菌與酵母菌的菌落特征。