第5節(jié)　RNA的分離提取

DNA、RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)。RNA是由核糖核苷酸經(jīng)磷酯鍵縮合而成的長(zhǎng)鏈狀分子。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。rRNA和tRNA在蛋白質(zhì)的生物合成中也發(fā)揮著不可替代的重要功能。因此，mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中起著舉足輕重的作用。另外，RNA是存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。

RNA種類繁多，大家熟悉的信使RNA分子，可以作為模板翻譯成蛋白質(zhì)；rRNA、tRNA等，參與構(gòu)成細(xì)胞器的基本結(jié)構(gòu)；微RNA是一類長(zhǎng)度在20～22nt的小RNA分子，可以通過互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合到mRNA上，參與基因調(diào)控過程；此外，生物體中還存在大量長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子，它們參與到細(xì)胞分化、癌癥發(fā)生、端粒長(zhǎng)度維持等多個(gè)生物學(xué)過程中。RNA分子作為中心法則中的重要一員，發(fā)揮著重要的作用。

細(xì)胞內(nèi)總RNA的制備方法很多，AGPC法（acid guanidinium thiocyanate/phenol/chloroform，異硫氰酸胍/苯酚/氯仿）是比較常用的方法。許多公司有現(xiàn)成的總RNA提取試劑盒，可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。TRIZOL就是一種新型的總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞、抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)，核糖體上的蛋白質(zhì)變性，核酸釋放。釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH值下溶解度的不同，而分別位于整個(gè)體系的中間相和水相，從而得以分離，經(jīng)有機(jī)溶劑抽提、沉淀，得到純凈的RNA。

目前RNA提取分離技術(shù)在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用，特別是qPCR檢測(cè)、RNA測(cè)序、RNA修飾和RNA芯片等方向^{［11～16］}，都是基于RNA提取技術(shù)基礎(chǔ)之上的新型研究領(lǐng)域，可用于檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，在克隆基因、調(diào)節(jié)基因的基礎(chǔ)上，對(duì)基因進(jìn)行干擾、增強(qiáng)、取代以及重組，在分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

（1）了解提取RNA的技術(shù)與操作規(guī)則。

（2）學(xué)習(xí)和掌握利用TRIZOL法提取RNA的基本原理和方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中，當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開，水相層（無色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。

三、材料、試劑與儀器

1.實(shí)驗(yàn)材料

三孢布拉氏霉菌。

2.實(shí)驗(yàn)試劑

提取RNA所需試劑：液氮、TRIZOL試劑、氯仿、異丙醇、70%乙醇、純水。

核酸電泳驗(yàn)證試劑：瓊脂糖、5×TBE溶液（配制方法見附錄Ⅲ）、溴化乙錠（EB）。

3.實(shí)驗(yàn)儀器

核酸電泳儀、凝膠成像儀、研缽、漩渦混合儀、冷凍離心機(jī)、EP管、微量移液器（200μL、1000μL）。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）發(fā)酵100mL三孢布拉氏霉菌后，用紗布過濾掉發(fā)酵液，留下菌體。

（2）加入液氮，預(yù)冷研缽，將菌體放入研缽中充分研磨到無明顯顆粒。

（3）佩戴口罩，加入TRIZOL試劑1mL，繼續(xù)研磨至無明顯顆粒（保持研缽中一直有液氮）。

（4）將研磨成粉末狀的TRIZOL和組織混合物轉(zhuǎn)移到EP管中。

（5）加入0.2mL氯仿到EP管中，漩渦混勻。靜置5min。

（6）在冷凍離心機(jī)中（4℃）13000r/min離心15min。

（7）此時(shí)EP管中分為三層。吸取上清液，注意不能吸取到中間相或下層有色相，加入等體積的異丙醇，混合均勻，室溫沉淀15～20min或放置-20℃沉淀過夜。

（8）在冷凍離心機(jī)中（4℃）13000r/min離心15min，小心丟棄上清液，如果RNA含量高，能在管底看到乳白色沉淀。

（9）用70%乙醇洗滌白色沉淀，在冷凍離心機(jī)中（4℃）13000r/min離心15min。

（10）小心棄去上清液。將EP管蓋打開放置2min，讓乙醇揮發(fā)。

（11）加入30μL純水。

（12）對(duì)提取產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，用1×TBE溶液配制1%的瓊脂糖凝膠，加入萬分之一EB，在TBE溶液中進(jìn)行凝膠電泳，檢測(cè)產(chǎn)物是否正確。

具體實(shí)驗(yàn)步驟如圖1-4所示。

五、結(jié)果與分析

1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三孢布拉氏霉菌的RNA提取結(jié)果如圖1-5所示。

2.問題及可能原因分析

（1）出現(xiàn)RNA條帶彌散：沒有佩戴口罩、手套（人的唾液和空氣中含有RNA酶，能夠促進(jìn)RNA降解），或者提取操作不熟練導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)時(shí)間過長(zhǎng)，或者實(shí)驗(yàn)用品沒有進(jìn)行二次滅菌。

（2）不同組織或細(xì)胞RNA提取得率低：樣品裂解或勻漿處理不徹底或者最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

（3）A₂₆₀/A₂₈₀<1.65：檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品不是溶于TE，而是溶于水。低離子濃度和低pH條件下A₂₈₀會(huì)較高，或者樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少，也可能是勻漿后樣品未在室溫放置5min，水相中混有有機(jī)相。

六、注意事項(xiàng)

（1）經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致RNase污染。

（2）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

（3）RNA在TRIZOL試劑中不會(huì)被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5mol/L NaOH溶液中浸泡10min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

（4）配制溶液應(yīng)使用無RNase的超純水。

七、思考題

如何評(píng)判核酸分離純度？

（袁其朋）