第一節　心臟胚胎的細胞分化

一、胚胎的發育與細胞分化

人體胚胎從受精卵開始，經過胚前期、胚期和胎期的發育，止于胎兒出生。其胚胎發育的過程需經過細胞分裂、遷移、分化和凋亡的精密調控，而細胞分化是發育的核心。所謂細胞分化（cell differentiation）就是指同一來源的細胞逐漸產生出形態、結構及功能特征各不相同的細胞類群的過程，其結果是細胞在空間上產生差異，形成具有特定形態和功能的組織，在時間上則是同一細胞與其從前的狀態有所不同。通過細胞分化，使具有相同遺傳組成的細胞，選擇性地表達不同的基因，產生不同的結構蛋白、執行不同的功能，共同參與構成一個復雜的個體，所以細胞分化的實質是基因的差別表達（differential expression）。

胚前期發育過程中，隨著胚胎組織細胞分化進程的進行，細胞分化的潛能或可塑性逐漸降低。哺乳動物在8個卵裂球階段，細胞的發育處于“全能性”，即一個體細胞如受精卵一樣，在一定條件下，經過分裂、分化有能力重新形成完整的個體，或者分化形成該個體任何種類的細胞。但是，發育為三胚層胚盤后，隨著細胞空間關系的改變和微環境的變化，這些細胞在發生潛能上已經開始出現一定的局限性，只具有演變為多種細胞類型的能力，這些細胞被稱為多能細胞（pluripotent cell）。例如Beltrami等在2003年報道了成人心臟內的c-kit細胞具有多潛能性并在體外具有增殖能力。這些細胞不僅能分化為心肌細胞，還可以分化為平滑肌細胞和內皮細胞。當經過器官發生，各種組織、細胞的命運被最終確定時，那些僅具有分化形成某一種類型能力的細胞被稱為單能細胞（monopotential cell）。由單能細胞最終形成特化細胞類型的過程稱為終末分化（terminal differentiation）。在細胞發育過程中，這種逐漸由“全能”變為“多能”，最后趨向于“單能”穩定型的分化趨勢是細胞分化過程中的一個普遍規律。一般情況下，細胞分化的過程是不可逆的，然而在某些條件下，分化細胞的基因表達模式可以發生可逆性變化，回到其未分化狀態，這一過程稱為去分化（dedifferentiation）。

二、細胞分化的途徑

細胞分化的機制極其復雜，主要取決于兩個方面：一是細胞的內部特性，二是細胞的外部環境。前者與細胞的不對稱分裂（asymmetric division）以及隨機狀態有關，尤其是不對稱分裂使細胞內部得到不同的基因調控成分，表現出不同于其他細胞的核質關系和應答信號的能力。后者則表現為細胞應答不同的環境信號，啟動特殊的基因表達，產生不同的細胞行為，如定向分裂、生長、遷移、黏附、凋亡等，這些行為在形態發生中具有極其重要的作用。具體分化途徑有如下幾種：

1.不對稱分裂

一次不對稱的分裂會造成兩個子細胞的不同，在這樣的一個過程中，一些重要的分子在分裂時被不均等地分配到兩個子細胞中。這些分子通過直接或間接地改變所在子細胞基因表達的格局，決定這個細胞的命運。不對稱的分裂在發育的初期、受精卵分裂成不同命運的子細胞時非常普遍，但在晚期階段，如神經細胞發生時也會出現。在哺乳動物中，干細胞的分裂也是不對稱的，可以產生一個祖細胞和另一個干細胞，祖細胞只具有有限的自我更新能力，屬于多能或單能干細胞。

2.細胞間的相互誘導

所謂誘導（induction）就是指胚胎發生過程中兩個細胞群體，即兩種胚胎組織，通過相互作用使一個細胞群體或兩個細胞群體都發生定向分化的過程。一般說來，在誘導過程中，一個細胞群體發出和傳遞一種細胞信息或生物刺激，另一個細胞群體則接受這種信息或刺激并發生相應的反應。前者稱誘導組織（inducer tissue），后者稱反應組織（responding tissue）。這種誘導是通過信號來實現的，其中有些誘導信號是短距離的，僅限于相互接觸的細胞間；有些是長距離的，通過擴散作用于靶細胞。誘導方式分為如下兩種：

（1）接觸性誘導（contact induction）：

是通過誘導組織與反應組織間的細胞接觸而實現的一種誘導。細胞間的接觸有兩種方式，即簡單的表面接觸和細胞間的縫隙連接。在簡單的表面接觸中，誘導細胞引起的反應細胞膜上的局部變化迅速擴展到整個細胞膜，通過細胞內信號傳導系統引起基因轉錄和表達的變化，從而導致細胞形態結構和代謝方面的分化發育。借助縫隙連接而形成的細胞接觸，溝通了誘導細胞和反應細胞間的生物信息，從而誘導了反應細胞的分化。細胞接觸性誘導的存在已為若干實驗和觀察所證實，但其誘導信號的傳導途徑和反應細胞的反應機制至今仍未闡明。

（2）非接觸性誘導（noncontact induction）：

是一種較接觸性誘導更廣泛的組織誘導方式。很多證據表明，與前側內胚層共同培養，能誘使后側非心臟中胚層分化成心臟譜系細胞。在培養過程中，將后側中胚層短暫地放置到纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）和骨形成蛋白（bone morphogenetic pro-tein，，BMP）中也足以誘導心臟發育。這一實驗說明，對中胚層的誘導作用，可以不通過細胞的直接接觸而實現。

3.細胞內在程序的調控

發育過程中，細胞在最初的特化之后，通過增殖使細胞的數量得以增加，然后通過一系列局部的誘導作用，對最初的細胞群逐步地進行細化和精加工。細胞因子在相鄰的細胞中誘導一部分細胞以第三種方式特化，第三種細胞反過來再把信號傳給旁邊的其他兩種細胞，產生第四種乃至第五種細胞，其余以此類推。這種漸進式地產生更復雜格局的策略被稱為依次誘導（sequential induction）。通過這種細胞內在程序的調控方式在最初構成的大致輪廓的基礎上一次又一次地精雕細琢。

4.細胞行為

外界信號和細胞的固有特征，不僅決定細胞內部的基因表達，而且還影響細胞的行為，使其參與形態的構建和進一步的分化。這些行為主要包括定向分裂（directed mitosis）、差別生長（differential growth）、細胞凋亡（apoptosis）、細胞遷移（migration）、區別黏附（differential adhesion）、細胞收縮（contraction）、基質膨脹（matrix swelling）、縫隙連接（gap junction）和細胞融合（fusion）等。例如小鼠胚胎發育的第8.5天，心肌前體細胞遷移至胚胎的前側區，要求心肌細胞正確分化；同時為了指導遷移還需要信號途徑引導細胞移向腹中線或是阻止某些側板細胞的遷移。

5.細胞生長控制

細胞生長控制不僅是發育中形態構建的重要機制，也是成體形態維持的重要機制。細胞生長主要取決于刺激細胞分裂、抑制細胞分裂及細胞凋亡的狀態，這些過程都受外界信號的調節。如肌肉細胞發育的原腸胚形成階段，整個胚胎細胞都能合成肌球蛋白，但原腸期以后，合成肌球蛋白的細胞僅局限于心區，而其他部位的細胞則被抑制。

三、心臟細胞的起源

早在胚胎原始心管形成之初，心肌細胞和心內膜細胞兩種細胞譜系就已經確定。其中前者構成了心臟的絕大部分（占95%），最終形成心房心肌細胞群、心室心肌細胞群和心臟傳導系統細胞群；后者在心臟中只占很小一部分（約5%），最終分化形成心內膜、瓣膜、隔膜等組織。

1.心內膜細胞和心肌細胞的起源

在原始心管階段，中胚層生心區細胞首先是一層上皮細胞，隨后這層細胞產生兩個亞細胞群：其中大部分仍然作為上皮層細胞存在，維持N型鈣黏著蛋白的表達，后分化成心肌細胞；而較小的亞細胞群則減弱了N型鈣黏著蛋白的表達，從初期的上皮層中遷移出來，成為內胚層心內膜的前體細胞。而心房和心室肌細胞前體在囊胚期中期分離，在中胚層細胞移入生心區時已經形成了。2004年，Messina等人從人和小鼠的心臟中分離出了心肌前體細胞，這些心肌干細胞可以在體外增殖、分化。2005年，Laugwitz等報道了ISL1（一種LIM同源異型的轉錄因子）可以用來標記出生后心臟中的心肌前體細胞。在出生后的心臟，ISL1陽性的細胞可以進行自我更新，并在純系選擇后迅速分化為成熟的心肌細胞。

2.心臟傳導系統的起源

心臟傳導系統的細胞與心肌細胞相比具有自身的特點：如半徑較大、肌原纖維分布較少，糖原含量大量增加，含有神經元特異性蛋白，如神經絲蛋白、腦相關的糖蛋白。但確定的細胞譜系說明浦肯野纖維的前體細胞是心肌細胞衍生物而非神經嵴細胞衍生物。另外有研究表明浦肯野纖維的分化和冠狀血管的發育在時空上關系密切，提示冠狀血管形成的誘導作用可能使收縮性的肌肉細胞形成浦肯野纖維。雖然心房心室連接處的細胞在發育早期就停止增殖，但此處的環狀結構仍被認為是傳導系統形成的起始位點。

3.冠狀血管細胞系的起源

冠狀血管的前體、內皮層細胞以及來自神經嵴的血管平滑肌細胞都在胚胎發育的第3周進入心臟。冠狀血管的形成有兩種方式：血管發生和維管發生。前者是指從已形成的血管上長出或分支而成的新血管；后者則是由局部內皮小囊融合而形成新血管。目前對于冠狀血管的形成方式還存在爭議，有一種模型認為冠狀血管網通過如下發生機制形成：在外心膜形成時，獨立的內皮層和平滑肌前體從前外心膜移入管狀心臟；內皮層細胞分化成為竇狀小管囊，隨后融合成為毛細血管；一旦封閉的血管網建立起來并環化成大動脈，心臟內平滑肌細胞前體就遷移至確定的內皮層通道處，參與冠狀血管的形成。

四、心臟胚胎組織的分化

胚期發育過程中，側中胚層（lateral mesoderm）位于中胚層最外側的部分，兩側的側中胚層在口咽膜的頭側匯合為生心區。隨著胚體的形成，生心區移到胚體原始消化管的腹側，口咽膜的尾側，分化形成原始心管。之后胚內體腔出現，側中胚層分裂為體壁中胚層（parietal mesoderm）及臟壁中胚層（visceralmeso-derm），前者分化為體壁的骨骼、肌肉、血管和結締組織；后者覆蓋于原始消化管外面，分化為消化和呼吸系統的肌組織、血管和結締組織等。兩層之間的腔為原始體腔，最初呈馬蹄鐵形，繼而從頭端到尾端分化為心包腔、胸膜腔和腹膜腔。

在心臟發育的過程中，不僅有線性心管，還存在其他區域的細胞群參與心臟的發育和成型，這些區域包括第二心臟發育區（second heart field，SHF），以及神經嵴細胞等。SHF是位于咽中胚層的一群心臟前體細胞，在胚胎期線性心管螺旋階段時加入，參與心管的延長，并最終成為心臟流出道、右心室和右心房心肌的大部分；而神經嵴衍生的細胞移行到流出道，形成主動脈和肺動脈之間的分隔，并且分化為主動脈弓的血管平滑肌層；而線性心管則衍變為大部分左心室和左房。α-平滑肌肌動蛋白是心肌細胞分化的早期標志，α-橫紋肌肌動蛋白為橫紋肌特異性標志蛋白。有研究通過標記α-平滑肌肌動蛋白及α-橫紋肌肌動蛋白發現人胚C10～C15期（表1-1）咽中胚層不斷分化出心肌細胞添加至心臟的動脈端使流出道延長，此處是人胚的前生心區；而流出道遠端的心肌可誘導前生心區細胞增殖分化為心肌細胞，證實了心臟流出道由來自SHF的前體細胞、神經嵴細胞和心臟中胚層細胞參與形成的。還有研究采用鼠早期胚胎，發現最初這些SHF細胞參與分化形成整個心管直至繞過背側心系膜，但隨著胚胎發育，與原始心管背側隔離后，咽中胚層內的心臟祖細胞被隔離在心包背側，即誘導原始心管其他極向的生長（圖1-3）。雖然在心臟發育時線性心管和SHF如何融合還不得而知，但通過動物模型可知SHF發育過程中極小的干擾也可能導致很嚴重的心臟發育異常，如大動脈轉位、右心室雙出口、法洛四聯癥、室間隔缺損等。

五、心臟胚胎細胞分化的信號通路

盡管細胞分化的最終命運大相徑庭，但對于分化，尤其是早期分化起主要調控作用的都是少數幾種相同的信號途徑（圖1-4），它們按照極其相似的方式調控發育過程。大多數調控的最終結果是靶細胞的DNA轉錄發生改變，一些基因被激活，另一些基因被阻斷，不同的信號分子激活不同的基因調節蛋白。除此之外，一個特定基因調節蛋白激活的效果還將取決于存在于細胞中的其他基因調節蛋白的聯合作用，因此不同類型的細胞通常對同一種信號會有不同的反應。反應既取決于信號接受前細胞內存在的其他基因調節蛋白，體現了細胞對以往信號的記憶，也取決于細胞同時接受到的其他信號。

對于那些能夠遠距離作用的分子，限制其作用同樣非常重要（表1-2）。大多數發育的信號蛋白在細胞外都存在著能夠抑制其作用的拮抗劑。這些拮抗劑一般是能夠和信號分子本身或其受體相結合的蛋白，從而阻止細胞和這些信號分子的相互作用。發育中大量的細胞分化實際上更多的是受到各種抑制劑的調節。

心臟胚胎細胞分化的重要信號通路有如下幾種：

1.FGF信號通路

心臟的正常發育需要FGF信號通路中各因子的精確表達，其中FGF8已經被認為是影響發育條件突變的主要配體。FGF8不僅在SHF發育過程中參與心臟流出道、內膜墊及間隔的構建，還對神經嵴細胞有趨化作用；而神經嵴細胞也參與調節FGF8配體在SHF增殖和分化過程。FGF8的表達缺失可導致一系列的圓錐動脈干畸形，如大動脈轉位，永存動脈干，右心室雙出口，室間隔缺損或法洛四聯癥等。FGF信號通路通過FGF受體底物FRS2α來調節MAPK和PI3K信號途徑。去除FRS2α基因的動物模型中，心內膜上皮間充質轉化（EMT）和神經嵴細胞遷移到流出道均受到極大影響，導致流出道對位不良、間隔和瓣膜發育異常。

2.Wnt信號通路

Wnt家族是最早誘導心臟發育的信號通路之一，在心臟發育過程中起誘導、增殖、分化等作用。Wnt有三種信號通路途徑：①經典通路；②非經典通路；③Wnt／鈣通路。經典Wnt信號通路促進細胞的增殖，維護其未分化狀態，而非經典Wnt信號通路促進細胞分化。

在原始心管形成后，經典Wnt通路參與心臟前體細胞的正常發育，并需要β-聯蛋白（β-catenin）的存在，表達轉錄因子ISL1。如果在表達ISL1的心臟祖細胞中敲除β-catenin基因，將會影響第二生心區心肌細胞增殖，出現單一、未分開的流出道，房間隔形成異常等，導致孕13天的小鼠胚胎死亡。在孕早期中胚層祖細胞分化階段，敲除胚體的β-catenin基因，其心臟環化和右心室形成受損，第二生心區中的ISL1大幅減少。由此推斷，β-catenin能調節第二生心區的發育。

非經典通路中Wnt5a和Wnt11對心臟的正常發育也具有重要作用，他們能在心臟前體細胞分化階段中減弱β-聯蛋白信號通路對ISL1標記的前體細胞的影響。在Wnt5a和Wnt11基因缺失的動物模型中，SHF心臟前體細胞嚴重缺失，并伴隨著Wnt／β-聯蛋白的表達增加。

最近，抑制心臟發育的調控分子已經被確定，它們包括Wnts及上游的Wnt基因表達的調控因子。Wnt8c和它上游的調控因子ccdx-b在前心臟形成區不表達，它在后側中胚層中表達。在正常發育中，Wnt抑制因子crescent在胚胎的前心區表達，這使得Wnts信號在心臟形成區將會處于一個比較低的水平。因此，促進心臟發育的調節途徑在前板中出現，抑制心臟發育的調控途徑在后側板中出現。

3.Notch信號通路

在心臟發育過程中，Notch信號通路通過調控下游靶點，促進心室心肌的增生和分化，對心室小梁和腔室的發育尤為重要。同時，Notch信號通路也參與上皮間質轉化過程，EMT對心臟瓣膜及間隔的發育是有決定性的。此外，Notch通路參與調節神經嵴細胞在心臟流出道區域的正常發育，當Notch通路失活，可導致胚胎嚴重的先天性心臟發育異常，包括肺動脈狹窄，動脈弓發育異常，提示與血管平滑肌發育缺損有關。而Notch1突變的患者中出現了主動脈狹窄，強調了Notch通路在發育過程中對流出道區域發育的貢獻。

4.TGF-β／BMP信號通路

BMP是TGF-β超家族中最大的一族，涉及多種胚胎發育過程。TGF-β／BMP信號通路的下游通路是Smads蛋白家族信號通路，TGF-β／BMP作為配體形成的受體復合物，激活Smads進入核內，共同激活或抑制受它們調節的靶基因的轉錄。BMP4基因突變的小鼠模型中導致了室間隔缺損、心內膜塑形異常及不正常的瓣膜間隔發育，表明BMP4對心臟的發育具有決定性重要作用。BMP信號通路還參與EMT過程和神經嵴細胞的移行。

隨著胚胎的發育，心源性中胚層細胞的定向分化是在多條途徑的交叉作用下完成的，共同維持心臟的正常發育。有研究表明在胚胎第9天時，Notch信號通路中重組信號蛋白-J的條件性突變可導致心臟發育不全，而通過去除Wnt通路抑制劑Axin2蛋白基因則可使得心臟發育維持正常。由此推測在心臟前體細胞分化和流出道成型過程中Wnt／β-catenin是Notch信號通路的主要下游受體之一。并且在兩者均基因突變缺失的試驗中，BMP4及BMP相關基因的表達均可恢復，由此又推測出Wnt／β-catenin又是BMP信號通路的上游通路。

心臟胚胎的發育涉及一系列復雜、互相關聯的信號途徑及轉錄因子見圖1-5。多種信號通路和轉錄因子在時間空間調控中特異表達，協同維持心臟正常的發育、增生、遷移以及之后分化的平衡。隨著時間推移，正確認識心臟正常發育過程中的調控機制對將來預防和干預先天性心臟病的發生及治療具有重大的指導意義。

（黃瑛　任衛東）