- 納豆激酶：生物活性及其應用研究
- 陳杰鵬 徐峰
- 8280字
- 2019-11-29 16:47:32
第二節 納豆激酶
一、納豆激酶的實驗室研究
繼須見博士轟動世界的“下午兩點半實驗”之后，全世界范圍內掀起了納豆激酶研究的熱潮。特別是近30年來，納豆激酶的發現，納豆激酶單位的設定，納豆菌生物提取酶、維生素以及抗菌成分的研究，不斷有新成果被發現和證實。由于納豆激酶顯著的醫療保健作用，公眾給予納豆菌的關注與日俱增，研究逐步深入。
1992年，Nakamura等測定了納豆激酶的基因序列。它的全長基因包括調控序列在內共1473個堿基對，起始密碼子上游17′處為核糖體結合位點AAAGGAG, SD序列上游為A/T含量高達70%的轉錄調控區，1143個堿基對閱讀框架編碼29個氨基酸的信號肽、77個氨基酸的前肽及275個氨基酸的成熟肽。前肽在蛋白質的分泌與折疊過程中起著重要的作用。在大腸桿菌中表達成熟肽的報道很多，表達量約占細菌總蛋白的30%。但大多表達產物都以包涵體的形式存在，而且很難復性。有文獻[16]報道，納豆激酶可在大腸桿菌中以融合蛋白方式表達，表達蛋白占菌體蛋白的15.2%。而蛋白表達方式的不同，其原因在于應用的表達載體不同。當選用pRIT2T（Protein A融合型）為載體，受體菌為大腸桿菌N4830時，產物以融合蛋白形式表達，而使用pBV 220為載體，以大腸桿菌DH5a為受體菌，則表達產物是以包涵體形式存在。1993年，Fujita對納豆激酶進行表達，其相對分子質量為277 000，為具有絲氨酸蛋白酶特征的蛋白水解酶。[17]
從20世紀90年代起，我國科技人員在菌種選育及菌種的生理生化特性鑒定、納豆激酶的分離提純及其氨基酸順序、基因序列測定、理化性質研究、體內外溶栓試驗、急性毒性試驗、治療腦梗死的初步臨床研究等方面進行了大量試驗工作。
黑龍江劉宇峰等人已進行了納豆激酶制劑的生產中試研究，其產品酶活力可達30 000FU/g，但這一結果并不是用世界通用的最權威的溶血栓測定方法檢測所得。由于納豆激酶穩定性差、提純困難，得率低，且納豆激酶的活力都比較低等原因，國內至今沒有將納豆激酶開發成為溶栓藥物的報道，市場上銷售的納豆激酶保健品較多。[18]黃占旺等人針對納豆菌生物學特性，研究了不同溫度、pH、培養時間、通氣量、接種量、鹽濃度因素對納豆菌生長的影響，試驗結果表明，該菌種生長適宜條件為：溫度30～45℃；通風，轉速140 r/min（500mL三角瓶裝液量100mL）；pH 7.0；培養時間24h；接種量2%～5%。納豆菌耐鹽性較強，在含鹽量8%的條件下仍能較好生長。[19]朱健輝等人通過用納豆桿菌進行液態發酵生產納豆激酶的培養基的優化實驗，確定最佳產酶培養基組成為麥芽糖2%、酵母膏4%、CaCl20.03%，pH 7.0。在此基礎上，設計發酵條件的優化實驗，結果表明，在接種量為1%，裝液量為100mL/500mL擋板瓶，200 r/min的條件下，34℃培養48h達到產酶高峰，產酶活力可達4300 U/mL發酵液。在此基礎上，通過模型來描述納豆激酶的生成，確定納豆激酶的液態發酵屬于部分生長偶聯型，這是已見報道的最高酶活記錄。[20]利用篩選的納豆菌試制飲料、咀嚼片、膠囊等相關保健品的研究也見報道，其中劉新梅等人利用納豆菌發酵酸豆乳，當發酵時間為79h，溫度為28℃，裝液量為23mL，酶活可達800.15FU/mL。[21]但是目前相關研究還沒有真正地對篩選的納豆菌種進行比較全面的鑒定分析，部分菌種鑒定實驗也只是粗淺地集中在常規的菌種個體形態、菌落形態、生理生化反應等領域，對于納豆菌的種屬地位、與其他菌種的親緣關系及在微生物系統發育學上的地位問題缺少充足的有說服力的直接證據。
一般從豆豉中篩選出的水解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amylolique fsciens）和從自然界中篩選出來的地衣芽孢桿菌B.LPY菌株[22]都可以作為生產納豆激酶的菌種。此外，在中國南方的藥酒中篩選出的根霉（Rhizopus chiensis）12#經過仔細研究后，發現也具有一定的纖溶活性，[23]但是現在通常使用的用于生產納豆激酶的菌種還是從納豆中篩選出的納豆桿菌。
除上述研究成果，以下是部分關于納豆激酶的研究和報道。
1993年MitsuguFUjita等人報道，相比纖溶酶而言，納豆激酶更應屬于一種具有纖溶活性的枯草蛋白酶。不僅因為納豆激酶的序列與枯草蛋白酶有很高的同源性（與枯草桿菌蛋白酶E的同源性高達99.5%，與枯草蛋白酶A的同源性達99.3%），而且其最敏感的底物也就是枯草蛋白酶的底物（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA）。通過對該酶抑制劑的研究發現，絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）幾乎可完全抑制它的纖溶和酰胺水解活性。而其他絲氨酸蛋白酶抑制劑對它的纖溶活性沒有影響，對酰胺水解活性的影響也非常小。
2002年廣東雙駿生物科技有限公司，優化出穩定高產的納豆激酶菌株，并開發出納豆激酶食品及其組合物，而且還在納豆菌發酵液中提取出維生素K2、多聚谷氨酸等活性分子，并發布了納豆激酶瓊脂糖-纖維蛋白平板法、分光光度法、液相色譜法、NKIU法等納豆激酶含量與活性的測定方法。
2003年4月11日，《人民日報》（第七版）報道納豆（類似我國的豆豉）菌分泌的納豆激酶有抑制血小板聚集的作用，有助于預防高血壓和動脈硬化。隨后中央電視臺及其各地方電視臺開始普及納豆知識。
2004年，歐洲的研究小組報告納豆激酶具有預防旅客血栓癥，即所謂經濟艙綜合征的功效。旅客血栓癥是乘坐飛機等旅行時，長時間坐在座位上，血液循環受阻、血液黏度上升，導致靜脈血管出現血栓的病癥。
2004年內蒙古農業大學的多位教授研究發現，納豆激酶對凝血的三個階段都有影響，且與肝素相比，作用緩和，不易引起出血。
2005、2006年連續兩年內超過800萬美國人服用納豆激酶功能食品，用來預防中風、心肌梗死、腦梗死。
2007年，世界衛生組織最新統計結果表明：在2005—2007年之間，納豆激酶為全世界9000多萬名中風、偏癱、心梗、腦梗死患者提供90%以上治愈率，納豆激酶已經成為目前世界性防治血栓疾病的首選成分。
目前已有諸多學者進行了納豆激酶蛋白質性質的研究。得知納豆激酶相對分子質量為27 728，pI為8.6±0.3。Sumi等人首次報道，[1]并認為它是一種纖溶酶類絲氨酸蛋白酶，能有效地水解纖維蛋白。因此，納豆激酶是一種具有纖溶酶活性的枯草蛋白酶。
2008年河南省微生物工程重點實驗室通過對納豆激酶酶學性質的研究發現，納豆激酶在40℃以下纖溶活性較穩定，65℃以上活性迅速下降。
2008年江南大學國家大學科技園的多位教授完成了固體發酵納豆激酶培養基的優化。
2009年沈陽藥科大學生理教研室開始研究納豆激酶的溶栓活性、抗凝血活性、納豆激酶與阿司匹林、華法林、尿激酶、蚓激酶等相關藥物的相互作用及其對代謝綜合征的影響。
2011年廣州市微生物研究所完成了納豆激酶分離純化的工藝優化。
2013年天津科技大學和唐山師范學院完成了對納豆芽孢桿菌的分子鑒定以及對納豆激酶的基因克隆。
2013年浙江省寧波市李惠利醫院的胡靜建立了快速、簡單測定納豆激酶活性的方法。
2014年Xuetuan Wei所在實驗室將納豆激酶與納米銀組合在一起，發現此組合棒具有溶解纖維蛋白和抗菌的雙重作用。
我國研究人員從日本的納豆激酶研究得到啟發，逐漸把研究方向轉向我國傳統的大豆發酵食品，從豆豉中分離具有纖溶活性的酶，并初步測定了其相對分子質量為3600。[24]豆豉纖溶酶在體內有很好的溶栓活性，在體外也具有很強的抗凝血能力。[25]通過對自行篩選的分解淀粉芽孢桿菌DC-24豆豉溶栓酶的N-端序列的測定以及同源性分析表明，豆豉溶栓酶成熟肽編碼區的核苷酸和氨基酸序列與日本納豆激酶的同源性分別為80.0%和86.5%，這從分子角度證明了豆豉溶栓酶可能是一種新型的溶栓酶。[26]由于納豆激酶來源于食品，并且口服有效，非常有希望成為新型有效的溶栓藥物。[27，28]
二、納豆激酶的生物活性
1987年日本富崎醫科大學須見洋行等首先發現納豆激酶，隨之將提取出的納豆激酶應用于狗的血栓溶解實驗，證明納豆激酶是一種有纖溶活性的酶制劑，所以定名為納豆激酶。1995年Fujita在血栓模型上測試納豆激酶對栓塞后血流再通的作用，發現它的活性是相等劑量纖溶酶的4～5倍。[29]
納豆激酶可顯著延長凝血時間，沈陽藥科大學王建教授和吳浩博士采用分子對接的方法研究發現，納豆激酶可與凝血因子 Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅸ，Ⅺ，Ⅹ Ⅲ發生結合（圖1-19～1-25）。2009年Hsia等人給健康志愿者服用納豆激酶膠囊200mg/天，服用2個月后測定凝血因子水平，發現服用納豆激酶使纖維蛋白原，凝血因子Ⅶ、Ⅷ含量顯著降低，但不影響血脂水平。[30]
圖1-19 納豆激酶與 Ⅱ因子的結合
圖1-20 納豆激酶與 Ⅲ因子的結合
圖1-21 納豆激酶與 Ⅴ因子的結合
圖1-22 納豆激酶與Ⅶ因子的結合
圖1-23 納豆激酶與Ⅸ因子的結合
圖1-24 納豆激酶與Ⅺ因子的結合
圖1-25 納豆激酶與Ⅹ Ⅲ因子的結合
納豆激酶可顯著抑制血栓素TXB2水平，提示其可能通過抑制環氧化酶，抑制TXB2的形成，產生阿司匹林樣作用。
采用56只新西蘭兔，隨機分為7組：溶劑對照組、模型組、納豆激酶（粗）灌胃組、納豆激酶（精）灌胃組、納豆激酶（精）注射組、硫酸氯吡格雷組、硫酸氯吡格雷與阿司匹林組。用球囊導管自股動脈插管建立家兔主動脈球囊損傷模型，檢測各組血小板數目及聚集情況、腹主動脈組織病理學改變，并采用免疫組化法對MMP-2、9表達情況進行檢測。結果與模型組相比，3個納豆激酶給藥組血小板數目及聚集情況均無明顯改變（p＞0.05）；狹窄指數均顯著提高，內膜增殖指數均降低（p＜0.05）；MMP-2、9表達均無明顯改變。結論：納豆激酶可抑制血管成形術后再狹窄，但并非通過作用于血小板和影響MMP-2、9表達發揮作用。
納豆激酶對血小板聚集和血栓形成的影響，與阿司匹林進行對比，用兔的富血小板血漿孵育納豆、膠原蛋白和凝血酶，通過測定血小板聚集率進行分析。結果，納豆激酶顯著抑制膠原和凝血酶誘導的血小板聚集。納豆激酶減少血栓素B2形成，并以濃度依賴性方式抑制膠原蛋白活化的血小板。鼠經口給納豆1周，用35%三氯化鐵濾紙處理動脈10min，觀察納豆對三氯化鐵誘導的動脈血栓的影響。通過激光多普勒探頭監測血流量發現，納豆激酶延遲三氯化鐵誘導的動脈閉塞，500mg/kg的納豆充分防止了血栓阻塞，從而延緩血栓形成。2013年Jiang等人通過體內、體外實驗證明，160～500mg/kg納豆激酶服用1周，抑制血小板聚集可達到40%，通過抑制血小板聚集和溶栓作用，實現對血液循環的調解，從而抑制心血管疾病的發生。[31]
2011年Fujita在測試納豆激酶對血壓的影響，發現在大鼠的食物中加入納豆激酶，使收縮壓和舒張壓均明顯下降。[32]2008年Kim進行納豆激酶降壓作用的臨床研究，發現納豆激酶使高血壓患者的收縮壓和舒張壓均明顯下降。[33]其實，納豆激酶作為保健食品投入使用，已使數以萬計的高血壓患者血壓下降。
納豆激酶除上述功能外還具有護膚、健腦、提高記憶力、減肥等保健功能。納豆菌產生的吡啶二羥酸結合金屬的能力很強，能夠清除體內的放射性元素，常吃納豆可減少患白血病的概率。納豆在發酵過程中產生的菌絲黏液物質，其成分為類果聚糖的混合物：果糖和γ-多聚谷氨酸，它覆在黏膜的表層上，可保護腸胃，防止醉酒。有些研究還認為，大豆制品中的某些蛋白質可促進甲狀腺激素分泌，從而促進糖和脂肪的分解代謝，提高和保持精力。
有研究表明，口服納豆激酶能明顯降低深靜脈血栓和肢體水腫的發生。吳杰忱等報道了納豆激酶在骨質疏松和糖尿病的預防和治療中的作用。
隨著生活水平的提高，人類壽命逐漸延長，血栓類疾病的發病率也有逐年上升的趨勢。世界心臟學會聯合公布最新統計資料顯示，由心腦血管疾病引起的死亡已經躍居各類疾病之首。我國有13億人口，隨著人口的老齡化和人們保健意識的增強，納豆中的活性成分納豆激酶作為新一代的溶栓劑或保健食品，具有極為誘人的廣闊前景。
國內外在抗血栓藥物方面的研究正趨向于低價高效、易吸收、體內半衰期長的藥物方向發展。納豆激酶來源于傳統發酵食品，生產工藝簡單，安全性高，符合治療血栓病的藥品或食品基料的要求。由于納豆有一股特殊的氨臭味，不易被人們接受，這也致使納豆的發展受到一定程度的限制。對納豆中特殊氨臭味的處理成為研究的熱點，可以將納豆與我國傳統食物的風味結合起來，通過調整產品的形態、添加風味物質、低溫干燥等處理方法，去除其特殊的味道，同時又保留原有的功能特性和營養價值，滿足不同人群的需求。而通過分子篩從納豆提取物中分離納豆激酶時，胺類物質就已進入尾料中，所以納豆激酶沒有納豆那種特殊的味道。
2006年Kazuya等進行納豆激酶雙盲對照的二期臨床研究，[34]2008年Ninomiya與華法林對照進行納豆激酶的臨床評價，[35，36]以及Lampe在2016年對納豆激酶的毒理研究所進行的總結，[37]證明納豆激酶應用安全有效。[38]
三、納豆激酶產品的國內外市場開發
鑒于納豆激酶的神奇功能，國內外很多學者和公司對納豆食品和含納豆激酶的保健食品和藥品進行了深入開發。
目前，廣東雙駿生物科技有限公司采用（液體）發酵法生產納豆激酶，產量高且采用膜集成化的全物理分級濃縮的工藝，產品已在國內外市場廣泛應用。黑龍江省科學院應用微生物研究所已篩選出納豆激酶高產菌株，探索出液體發酵生產納豆激酶以及分離提取納豆激酶的生產工藝。同時，上海醫科大學分子遺傳室已經克隆了納豆激酶基因，完成了DNA測序，并獲得了納豆激酶的基因工程菌，表達量可達40%以上，建立了用工程菌生產納豆激酶的純化工藝。
已投放市場的納豆激酶產品有：北京燕京中發公司的燕京牌納豆、北京龍興的納豆激酶膠囊、天津百德公司的納豆口嚼片、湖南貴生坊的納豆素膠囊、草仙藥業的凈血酶納豆膠囊、天津寶恒生物的蛋白硒納豆膠囊和廣東雙駿生物科技有限公司的納豆激酶紅曲膠囊等。
日本擁有400多家公司生產納豆和納豆激酶產品以滿足國內外需求。近年來納豆激酶作為食品添加劑、功能性食品和普通食品發展十分迅速。
（1）日本大和制藥有限公司
其產品名稱為“納豆激酶CP”（納豆激酶復合產品）。其產品的生產條件符合GMP要求，也具有嚴格的質量控制標準。酶活性測定采用酶解底物法，即用纖溶酶分解的4肽底物S22511，依據在405 nm波長的吸收值計算的方法，簡單且準確。
該公司納豆激酶既有生產原料也有生產制劑，制劑有硬膠囊、軟膠囊和片劑三種劑型。作為功能食品，該公司供應的原料在國外的代銷機構制成單一制劑或添加其他成分（如SOD、DHA、VE、卵磷脂、銀杏提取物等）制成復方制劑。如，腸溶膠囊，每粒含325mg納豆激酶提取物，日口服1～3次，每次2粒，預防心腦血栓最宜在睡覺前服用。其售價在每90粒40～50美元。
（2）溫翠普-圣特公司
該公司生產的“納豆精”，是從納豆中提取出的納豆精華，即納豆激酶，制劑有軟膠囊和硬膠囊兩種。它的產品作為食品添加劑和功能食品在日本和世界各地銷售。膠囊規格為100mg/粒，相當1000單位，每天服用2～3粒。“納豆精”具有較好的預防由動脈血栓引起的冠心病、中風等癥的作用，同時具有降血脂、降血黏、降血壓、降膽固醇、溶解視網膜靜脈血栓的作用和抑菌、抗氧化等作用。
（3）過敏癥研究集團公司
該公司生產的納豆激酶復方制劑，90粒膠囊/盒，銷售價為65美元，作為食品補劑和功能食品在國內外銷售。每2粒含納豆激酶275mg，其他成分包括豆油、大豆卵磷脂、甘油脂肪酸乙酯、芹菜籽油、蜂蠟等。作為食品補充劑和功能食品，早晨、中午各服1粒；晚睡前服2粒可用于預防和治療血栓性疾病。
（4）真保健公司
該公司推出的“云香苷酶”的復合制劑（腸衣片）內含納豆激酶（500FU/片）、菠蘿蛋白酶（100mg/片）和云香苷生物黃酮類化合物（120mg/片）等。主要功能是調節體內免疫系統的平衡并具有抗炎活性，降解由于隨年齡增長體內所累積的蛋白質，改善血液循環以預防心、腦血管疾病。
（5）生物技術研發公司
該公司生產的納豆激酶主要成分為納豆桿菌發酵液的濃縮制品，還含有谷氨酸、果糖朊和其他蛋白酶等。有液體、濃縮液和顆粒狀粉末三種制劑。產品的質量標準為：納豆激酶活性：18 000FU/g；細菌數量＜103 cfu/g；大腸桿菌數量陰性；重金屬＜2 ppm；砷鹽＜10 ppm；pH 6.0～8.0；水分＜5%。該品作為功能性食品的原料用于改善血液循環。用量：150～200mg（18FU/mg）/次，每天3次。
韓國維壽酶公司生產的以納豆激酶為主要成分的維壽酶腸溶膠囊，每克干粉含20 000FU，服用量為2 000FU/日。納豆中含有一定量的維生素K2，可有助于控制骨質疏松癥。作為每日食品的營養補充劑，每日一粒膠囊。
朝鮮醫學科學院推出的“血宮不老精”為納豆激酶制品。在1996年5月的朝鮮國家技術創新博覽會上曾獲得國家最高榮譽獎，并得到外國專家的一致好評。它是從朝鮮食品埃里謝中提取、加工制成的納豆激酶混合物。有效成分為納豆激酶，含量為10 000FU（相當60mg納豆激酶）/粒，玉米淀粉（140mg/粒）為輔料。其被吸收后2～3h內即能發揮作用，可用于治療和預防血栓、癱瘓、四肢麻木、急性心肌梗死、半身不遂、言語紊亂、頭痛、頭暈、虛弱、高血壓和低血壓、腦血栓前后的綜合癥狀、脂肪肝、心肌肥大、動脈硬化、高脂血癥、心絞痛、冠心病等。可中和體內毒素，用于老年癡呆和老年綜合征的預防與治療，還可用于降低血液黏度，凈化、更新血液。
“血宮不老精”在朝鮮平壤醫科大學附屬醫院等12家中心醫院的臨床研究指出，其療效為89.29%，在治療過程中，病情未見好轉的僅0.09%。這份近30萬份病歷的臨床觀察和總結為目前所見關于納豆激酶臨床研究的最為完整的報告。
隨著人們生活水平的提高，大量攝取高脂、高蛋白等物質，導致心腦血管疾病呈高發態勢，對人類生命安全構成威脅。而現有的治療心血管疾病的藥物均存在種種弊端。因此，尋求一種成本低、工藝簡單并可大規模工業化生產納豆激酶的方法是十分必要的。我們還可以利用食品生物技術如基因工程、酶工程、細胞工程等，對納豆中的納豆激酶進行研究，拓展我國傳統的大豆制品，開發新產品，滿足人們的需求。
參考文獻