第二章　納豆激酶的分子結構與生物合成

第一節　納豆激酶基因與分子結構

一、納豆激酶的基因

1992年，通過DNA測序，首次得到了納豆激酶基因序列信息。其基因由1473個堿基對組成（圖2-1），基因序列從第181個堿基開始，以GTG為起始密碼子，隨后是1143個堿基對組成的閱讀框架。此閱讀框架分為3個部分：信號序列、前序列和成熟序列，起始密碼子上游的11～17 bp位點是SD序列（AAAGGAG），SD序列在核糖體同mRNA結合過程中起重要作用。SD序列的上游存在的是納豆激酶基因的轉錄調控區，富含A/T堿基，含量高達72%。在結構基因的3′末端為連續的3個終止密碼子TAA、TAG和TAA。終止密碼子之后還存在一段序列，為ρ因子非依賴性終止序列，序列如下：TA—AAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCT-TCTmA。[1]

納豆激酶基因序列的測定，使利用基因工程的方法提高納豆激酶活性及產量成為可能。近年來通過對納豆激酶分子生物學特性的研究，人們認識到納豆激酶與大多數枯草菌素（是一類由各種芽孢桿菌分泌的堿性絲氨酸蛋白質）在核苷酸序列及氨基酸組成上具有高度同源性。因此，進一步推斷納豆芽孢桿菌為枯草桿菌屬，納豆激酶是納豆桿菌的一種發酵產物。

自從Nakamura等首次克隆了納豆激酶基因并測定了全基因序列以來，利用基因工程技術提高納豆激酶活性及產量成為可能。近年來，我國研究人員利用基因工程菌生產納豆激酶，使納豆激酶基因的克隆、表達、純化及表達產物的產量和活性方面的研究取得了重大進展。從枯草桿菌、納豆桿菌、淀粉芽孢桿菌中克隆了納豆激酶成熟肽基因，包括前導肽和成熟肽的納豆激酶原基因，以及包括啟動子、前導肽、信號肽和成熟肽的納豆激酶全基因，分別重組到溫控型和誘導型質粒載體上，實現了在大腸桿菌、枯草桿菌和酵母菌中的表達。通過柱層析還分離純化出了高純度的納豆激酶蛋白。1999年復旦大學醫學院分子遺傳學研究室的劉北域等[2]采用PCR方法從納豆芽孢桿菌基因組中擴增了納豆激酶原基因，其核苷酸序列與文獻報道完全一致，將該基因重組到溫控型表達載體pLY-4上，構建成表達質粒pESX-1，轉化到大腸桿菌JF1125受體菌中，實現了納豆激酶在大腸桿菌中的表達。

2000年華南理工大學的黃志立等[3]從納豆桿菌中克隆了納豆激酶原基因，其基因序列與文獻報道的核苷酸同源性達99.08%，重組到溫控型表達載體pBV220上，轉化大腸桿菌HB101中，實現了納豆激酶在大腸桿菌中表達，表達產物的表達率達12%，用CLT法測定表明表達產物具有溶栓活性，1mL菌液的溶栓活性相當于120 U尿激酶。外源基因在大腸桿菌中的遺傳穩定性實驗表明，傳代21代，外源基因的丟失率達52%。2001年黃志立等[3，4]克隆了納豆激酶結構基因，其基因序列與文獻報道的核苷酸序列完全吻合，并將該基因重組到pTCZaA表達載體上，轉化到畢赤酵母GS115中，研究外源基因在真核表達系統酵母中的遺傳穩定性，結果表明，傳代120代，外源基因的丟失率為0。可見，外源基因在酵母中具有很好的遺傳穩定性。

2002年劉北域等[5]從納豆芽孢桿菌基因組中克隆了包括啟動子、信號肽、成熟肽及3′非翻譯區在內的納豆激酶全長基因，構建到大腸桿菌-枯草桿菌穿梭表達質粒pBL上，納豆激酶轉化到枯草桿菌中并成功表達。表達產物用超濾濃縮、分子篩、離子交換等技術多步純化，每升發酵液可得純度高達95%的重組納豆激酶約100mg。與t-PA比較，比活性達12 000 U/mg，收率為60%。2002年暨南大學生物工程研究所的謝秋玲等[6]克隆了納豆激酶原基因，重組到溫控型表達載體pBV220上，轉化到大腸桿菌DH5α受體菌中。溫度誘導表達后，SDS-PAGE電泳測試，在38 000處有一條明顯的表達帶，表達蛋白占菌體蛋白的20%左右，表達蛋白以包涵體形式存在，包涵體經變性、復性后，用CLT法測定具有溶栓活性。2002年四川大學的彭勇等[7]從解淀粉芽孢桿菌DC-4基因組中克隆了豆豉溶栓酶成熟肽基因（DFE），序列分析表明DFE基因長825 bp，編碼275個氨基酸，與文獻報道的納豆激酶的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為80.0%和86.5%，構建成融合表達載體pET-Nde，轉化大腸桿菌BL21中，在IPTG誘導下，表達的融合蛋白以包涵體形式存在，占菌體可溶性蛋白的40%，表明豆豉溶栓酶可能是一種新型的溶栓酶。2002年彭勇等[8]又從納豆桿菌基因組DNA中克隆了納豆激酶成熟肽基因，與文獻報道的核苷酸序列和氨基酸序列分別有93.4%和94.5%的同源性。重組到融合型表達載體上，經IPTG誘導后，表達的融合蛋白占菌體可溶性蛋白的26%。

從不同菌株中克隆的納豆激酶成熟肽基因在大腸桿菌、枯草桿菌和酵母菌中表達（表2-1），其中有研究指出，在不含前導肽時表達的分泌型重組納豆激酶和經過復性的包涵體型重組納豆激酶均有溶栓活性。另有研究報道，分泌型和包涵體型不能獲得活性。也有人將前導肽和成熟肽的納豆激酶原基因克隆并在大腸桿菌、枯草桿菌和酵母菌中實現可溶性、包涵體型和分泌型表達，表達產物均有活性（表2-2）。[9]

表2-1　納豆激酶成熟肽基因的表達比較[9]

注：所有基因均為成熟肽。

表2-2　納豆激酶原基因的表達比較[9]

注：所有基因均為原基因。

二、納豆激酶分子結構

納豆激酶屬于絲氨酸蛋白酶家族中的枯草桿菌蛋白酶類。在酶學分類上稱為枯草桿菌蛋白酶NAT（Subtilisin NAT），是一種堿性蛋白酶。根據納豆激酶基因的DNA序列推導出其氨基酸序列的一級結構，可知納豆激酶的前體為編碼381個氨基酸的蛋白產物。此前體切除N端的106個氨基酸殘基后成為275氨基酸殘基的成熟納豆激酶（酶學編號EC 3.4.21.62）（圖2-2）。

N端106個氨基酸殘基片段包括兩部分：一部分是信號肽，另一部分為前導肽（propeptide）。信號肽是由N端29個氨基酸殘基組成的，它是帶3個正電荷的親水氨基端和一段不帶電荷的疏水殘基序列，其切割位點在Ala-Glu-Ala保守序列之后。信號肽的作用是使納豆激酶分泌到細胞外。

前導肽為信號肽與成熟肽之間的氨基酸序列，它具有幫助納豆激酶正常折疊形成活性構象的功能。前導肽序列是納豆激酶不同于多數原核基因所編碼蛋白質的特點，而這種特征與真核細胞內蛋白酶分泌需要前導肽是一致的。在很多情況下，真核細胞在分泌蛋白酶之前，先在胞內合成無活性的酶原，分泌到胞外后，被酶水解，切斷前肽部分成為有活性的蛋白酶，但這種分泌現象在原核生物中是比較罕見的。目前已發現一些與納豆激酶基因同源的枯草桿菌素蛋白及鏈激酶有與此相似的前肽區域。去除信號肽的納豆激酶蛋白前體的產物（含前導肽和成熟肽）稱為納豆激酶原（pro-nattokinase）。

純化的納豆激酶在SDS-PAGE凝膠上只顯示出一條帶，說明納豆激酶是一單鏈多肽酶，無二硫鍵。納豆激酶的序列中含有8個賴氨酸殘基，但沒有半胱氨酸殘基，且內肽酶可將其水解成9個小肽，成熟肽的單鏈氨基酸序列組成與氨基酸序列測定得到的結果也相符（圖2-3）。[10]

三、納豆激酶與其他枯草桿菌蛋白酶的同源性比較

納豆激酶同其他枯草桿菌蛋白酶具有較高的同源性，其氨基酸序列同枯草桿菌蛋白酶E和枯草桿菌蛋白酶J比較，分別僅有2個和4個氨基酸不同。納豆激酶成熟區域的一級結構同枯草桿菌蛋白酶E、枯草桿菌蛋白酶A分別具有99.5%和99.3%的同源性。同其他枯草桿菌蛋白酶比較，納豆激酶表現出與枯草桿菌蛋白酶Carlsberg有69%的同源性；與枯草桿菌蛋白酶BPNc有85%的同源性；與枯草桿菌蛋白酶DY有70%的同源性，其同源序列都在氨基酸活性中心周圍。因此，普遍認為，枯草桿菌蛋白酶有啟動并指導枯草桿菌孢子形成的功能，推測其可能在協助細胞裂解，釋放孢子過程中發揮作用。盡管這些枯草桿菌蛋白酶一級結構非常一致，但它們卻在一些酶動力學參數以及底物特異性上不同，估計與空間構象不同有關。[11，12]

根據納豆激酶的氨基酸序列，可預測出它的二級及三級結構，并可利用同源模建技術構建出納豆激酶分子的三維空間結構模型（圖2-4）。納豆激酶的成熟肽主要是由12個β折疊和6個α螺旋構成，6個β折疊片組成的折疊桶和2個α螺旋主要構成其內部結構。活性中心位于α螺旋和β片層構成的疏水袋狀結構中，包括一個催化三聯體（由天冬氨酸Asp-32、組氨酸His-64和絲氨酸Ser-221組成）、負氧離子洞（oxyanionhole，由Asn-155側鏈和絲氨酸Ser-221主鏈的氨基共同形成）和底物結合位點（在絲氨酸Ser-125，亮氨酸Leu-126，甘氨酸Gly-127處，位于底物結合口袋的底部）。[13]

（a）納豆激酶的空間結構圖；（b）含活性中心的納豆激酶與H-D-VLK-pNA結合的三維模式圖