第三節　納豆激酶口服液

醫藥制劑中通常用到乳劑，乳劑（也可稱為乳狀液）是一類由互不相溶的液體組成的分散體系。其中一相由液滴（分散相）組成，另一相稱為分散介質（連續相）。最常見的乳狀液就是油分散在水中的體系（稱為水包油O/W）和水分散在油中的體系（稱為油包水W/O）。為了將一種液體分散到另一種互不相溶的液體中并穩定存在，必須加入乳化劑作為第三組分。表面活性劑由于在油-水界面上的定向排列而具有降低界面張力的作用，從而幫助乳劑形成并維持其穩定。表面活性劑的親水與親油能力應適當平衡。如果親水或親油能力過大，則表面活性劑就會完全溶于水相或油相中，很少存在于界面上，難以達到降低界面張力的作用。1949年，W.C.Griffin率先提出HLB表征表面活性劑親水基團與親油基團間的平衡關系。非離子表面活性劑的HLB的范圍被設定為0～20，親油性表面活性劑HLB較低，親水性表面活性劑HLB較高。親水親油轉折點HLB為10。HLB小于10為親油性，大于10為親水性。作為W/O型乳劑的表面活性劑，其HLB在3～8范圍內才具有較好的乳化能力并維持乳劑的穩定。

納豆激酶存在穩定性差、容易失活等問題，它在pH低于5的環境下很快失活（如胃液中），在高于60℃的情況下也迅速變性。[1]一般而言，納豆激酶這樣的多肽類產品，口服時會面臨腸道的三大障礙，即酶的降解、黏液層的擴散屏蔽以及黏膜的吸收屏蔽。[2]若將其制成W/O微乳，乳滴對包裹于內水相及表面活性劑層中的產品具有保護作用，使其免受胃腸道中酸和酶的降解，提高藥物在胃腸道中的穩定性。膜透過性差是蛋白多肽類藥物口服生物利用度低的另一個重要原因，將此類藥物包裹于W/O型微乳后，微乳中油相、表面活性劑等組分可通過提高膜流動性、打開細胞緊密連接[2]等機制顯著提高其透膜性能。

一、納豆激酶口服乳

1.內容物配方

制成1000支。

2.制備工藝

稱取處方量的卵磷脂（SPC）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40）、蜂蠟、脫氧膽酸鹽（DCA）、中鏈甘油三酸酯（MCT）組成油相，65℃下溶解后冷卻至室溫待用。將凝固的油相置于37℃水浴中攪拌融化，在攪拌狀態下，精密移取納豆激酶溶液緩緩注入油相中，繼續攪拌1min，即得W/O乳劑。

3.工藝考察

稱取處方量的SPC、蜂蠟、DCA和MCT共10g置于25mL燒杯中，于65℃水浴下恒溫攪拌至分散均勻，作為油相，放置室溫下冷卻待用。將凝固的油相于37℃下攪拌融化，并在攪拌狀態下將精密移取的2mL納豆激酶溶液緩緩注入油相中，繼續攪拌1min，即得W/O乳劑。

（1）油相中乳化劑用量的考察

對于乳劑來說，選擇合適的乳化劑至關重要。SPC的乳化作用強、生物相容性好，且其HLB值約為4，可作為W/O乳劑的乳化劑。因此，我們選用SPC制備納豆激酶乳劑。乳化劑可吸附于乳滴的界面，有效降低乳滴形成過程中的表面張力或表面自由能，有利于形成和擴大新的界面，使乳化體系保持一定的分散度和穩定性。

[3]

合適的乳化劑用量對乳劑的形成及穩定性至關重要。

制備不同SPC含量的乳劑，各處方的油相中蜂蠟均為5%，DCA均為1%，SPC的質量分別為油相總質量的1%、5%或10%，余量為MCT。水相用量為油相質量的20%，按以上方法制備乳劑。以制劑的外觀狀態、絮凝狀沉淀量、制劑的再分散性和放置穩定性（室溫）為指標評價處方優劣。結果見表4-1。

表4-1　SPC用量對制劑性質的影響

由表4-1可知，制劑放置7天后的分層程度隨SPC用量增大而減弱，10%SPC帶來較好的穩定性。于是，最終確定SPC的質量分數為10%。

（2）油相中蜂蠟用量的考察

蜂蠟是由蜜蜂（工蜂）腹部四對蠟腺分泌，用來構成蜂巢主要成分的蠟狀物質。[4]常用來增加油相的黏度，并能增強乳化膜的強度，防止乳滴合并，從而提高油包水型乳劑乳化體系的穩定性。預實驗表明，使用不添加蜂蠟的油相無法制備出穩定均一的乳劑，但蜂蠟過多則所制備的乳劑在37℃下也呈固態，不利于制劑在腸道的吸收。因此，需要對蜂蠟用量進行考察。

制備不同蜂蠟含量的乳劑，各處方的油相中SPC均為10%，DCA均為1%，蜂蠟的質量分別為油相總質量的0、1%、3%、5%或10%，余量為MCT；水相用量為油相質量的20%。按以上方法制備乳劑。以制劑的外觀形態、流動性（室溫、37℃）和放置穩定性（室溫）為指標評價處方優劣，結果見表4-2。

表4-2　蜂蠟用量對制劑性質的影響

由表4-2可知，蜂蠟用量為油相總質量的5%時，所制得乳劑在室溫下（20℃）呈凝固狀態。而在37℃時具有良好的流動性，且放置7天后制劑無分層現象。故將蜂蠟的質量分數定為5%。

（3）油相中DCA用量的考察

脫氧膽酸（deoxycholic acid, DCA）屬于游離型膽汁酸，是組成膽汁的重要成分（圖4-2）。由于DCA具有疏水基和親水基，是天然的生物表面活性劑。不僅如此，DCA還可與脂類如磷脂、甘油酯、脂肪酸等形成多種聚集體結構，[5]降低脂肪的表面張力，使脂肪乳化成微粒，并與脂肪酸結合形成水溶性復合物，有利于脂肪酸吸收。但DCA對消化道黏膜有一定刺激作用，其用量不宜過大?；诖颂攸c，我們對乳劑中DCA的用量進行考察。

制備不同DCA含量的乳劑，各處方的油相中SPC均為10%，蜂蠟含量均為5%，DCA的質量分別為油相總質量的0、0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%和3%，余量為MCT，水相用量為油相質量的20%。制備乳劑，以W/O乳劑在水中的自乳化效果作為評價指標，結果見表4-3。

表4-3　DCA用量對制劑性質的影響

由表4-3可知，當DCA含量由0提高到0.5%時，制劑的自乳化能力隨之增強。但隨著油相中DCA含量的進一步提高，制劑的自乳化效果不再繼續改善。同時，由不同陰離子化合物對納豆激酶活性影響考察結果可知，隨著DCA含量的增大，對酶活性的抑制作用增強。綜合考慮，確定DCA的用量為油相總質量的0.5%。

4.處方中乳化劑的進一步優化

上述實驗已經篩選出自乳化效果較好的納豆激酶口服W/O乳劑的配方。為便于服用，該乳劑需要灌裝于軟膠囊或硬膠囊內給藥。但是灌裝有乳劑的硬膠囊在室溫儲存時會出現囊壁軟化的現象。該現象是由于膠囊內容物中的游離水對囊壁的溶蝕作用所致。對于本研究中的納豆激酶W/O口服乳劑，由于酶溶液的濃度有一定的上限，所以減少水相的量會導致載藥量降低。為解決此矛盾，需要對乳化劑做進一步優化，以期通過穩定乳滴的方式將制劑中的水進行“固定”，從而減弱游離水對膠囊壁的破壞。

表面活性劑的親水親油平衡值（HLB）是決定乳劑類型的重要指標。當表面活性劑的HLB值在4～8之間時，有利于W/O型乳劑的形成。[6]而且相比于單一的表面活性劑，表面活性劑復配時的協同效應有利于提高乳化效率。[7]基于此，我們使用復合乳化劑來提高乳劑中乳滴的穩定性。

（1）復合乳化劑的選擇

分別以RH40、TPGS、Tween80、Span80或甘油作為附加乳化劑，與SPC復配制備乳劑。各處方中SPC、附加乳化劑和DCA的質量均分別占油相質量的10%、2.5%和0.5%，余量為MCT。水相質量為油相質量的20%。按以上方法制備乳劑。蜂蠟的作用是增加油相的黏稠度，從而提高乳劑的穩定性，但其加入會在一定程度上干擾我們對乳劑成型性的判斷，故在實驗中未加入，其量以MCT補足。因為未加入蜂蠟，所以所制備乳劑有絮凝出現。我們以乳劑的成乳能力及絮凝后再振蕩時的恢復性作為篩選附加乳化劑的指標。結果見表4-4。

表4-4　復合乳化劑種類對制劑成乳的影響[6]

注：以*數量代表各指標所達到的程度，*數量越多，表示此項指標程度越深。

由表4-4結果可知，SPC與RH40作為混合乳化劑時，成乳能力較強且所形成的乳劑性質較穩定，絮凝后也最容易恢復，故選擇二者作為納豆激酶口服乳的復合乳化劑，并對它們的配比進行進一步考察。

（2）混合乳化劑的配比考察

向3個10mL西林瓶中各加入0.30g SPC，并分別加入0.04、0.08和0.15g RH40。之后分別向各瓶中滴加MCT至總質量為3.00g，并于65℃混勻后冷卻作為油相。取1.00g油相于37℃水浴中攪拌融化，并在攪拌狀態下，移取納豆激酶溶液200μL緩緩注入油相中，繼續攪拌1min，即得澄清的油狀液。觀察靜置一天后的W/O乳劑的分層程度與絮凝狀態，并再次振搖，結果見表4-5。

表4-5　復合乳化劑的配比對制劑成乳的影響

注：以*數量代表各指標所達到的程度，*數量越多，表示此項指標程度越深。

從表4-5可知，在較短的觀察時期內各處方的成乳能力差別不大，但SPC：RH40=4：1（m/m）時，所得乳劑絮凝后振蕩均勻度最佳，且由以下公式[8]計算混合HLB值：

其中，m為溶劑質量。通過計算可知，SPC：RH40=4：1（m/m）所得復合乳化劑的HLB為6.2，較其他RH40的配比更有利于W/O乳劑的穩定。因此，確定復合乳化劑組成為SPC：RH40=4：1（m/m）。

5.以膠囊最大含水量作為指標評價復合乳化劑

合適的乳化劑可通過穩定乳滴等方式降低乳劑中的“游離水”，從而減弱膠囊壁的溶蝕。本實驗旨在驗證SPC與RH40所形成的復合乳化劑是否有此作用。

（1）復合乳化劑（SPC與RH40）納豆激酶乳劑膠囊的制備

配方中SPC、RH40、DCA和蜂蠟的質量分別占油相質量的10%、2.5%、0.5%和5%，余量為MCT。加入不同質量的納豆激酶溶液以使水相質量分別為油相質量的5%、10%、15%、20%、25%、30%。按以上方法制備乳劑并灌裝膠囊，獲得一系列水相含量遞增的納豆激酶膠囊。

（2）單一乳化劑（SPC）納豆激酶乳劑膠囊的制備

配方中SPC、DCA和蜂蠟的質量分別占油相質量的10%、0.5%和5%，余量為MCT。加入不同重量的納豆激酶溶液以使水相質量分別為油相質量的5%、10%、15%、20%、25%、30%。依法制備乳劑并灌裝膠囊，獲得一系列水相含量遞增的納豆激酶膠囊。

上述每個配方制備50枚0號腸溶膠囊，分別裝入玻璃瓶中密封，并于室溫下放置30天。每天觀察并記錄膠囊壁的開始軟化時間和軟化膠囊的數量。結果見表4-6。

表4-6　納豆激酶口服乳膠囊最大含水量的考察結果

注：以*的數量代表囊壁軟化程度，數量越多，表示囊壁軟化越明顯。

由表4-6可知，當使用SPC與RH40作為復合乳化劑時，相比與僅使用SPC作為乳化劑，膠囊能夠穩定保存的最大含水量明顯提高。所以確定優化后的乳化劑質量比為SPC：RH40=4：1（m/m）。

6.乳劑對納豆激酶熱穩定性的影響

分別取酶活度為1000、100FU/mL的納豆激酶溶液和1000FU/mL的納豆激酶W/O乳劑于70℃下放置0.17、0.5、1、3h。放置后的乳劑使用1%Tween80的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L, pH 7.4）進行水化。將乳劑水化物和納豆激酶溶液分別進行體外溶解血凝塊實驗，記錄各個時間點的溶栓率，以評價納豆激酶制備為乳劑后在熱穩定性方面的改善，結果見圖4-3至圖4-6。

由圖4-3可知，放置0.17h后，溶液的溶栓速率在前4h內比乳劑稍快。這可能是由于溶液和制劑在高溫中放置時間很短，二者的酶活性喪失均很少。乳劑水化后，相比于溶液，其中的酶需要經過一定的釋放過程才能作用于血凝塊，故溶栓速率在前4h表現得延遲。當溶液和乳劑在70℃下的放置時間延長到0.5h時，乳劑的溶栓速率在前8h均快于溶液（圖4-4）；隨著放置時間延長到1h時，納豆激酶溶液的10h溶栓率為9.2%，而乳劑10h溶栓率則為50.6%（圖4-5）；當放置時間進一步延長到3h時，納豆激酶溶液中的酶已經完全失活，而乳劑的10h溶栓率為31.5%（圖4-6）。上述結果表明納豆激酶制備為乳劑后，其熱穩定性有明顯改善。

7.乳劑對納豆激酶放置穩定性的影響

配制相同酶活性的納豆激酶溶液與納豆激酶W/O乳劑，將溶液與乳劑分別于4℃或室溫（20℃）下放置。30天后，運用纖維蛋白平板法測定酶的活性，評價制備乳劑對納豆激酶放置穩定性的影響。結果見圖4-7。

由圖4-7可知，納豆激酶溶液在室溫下放置1個月后殘余酶活為13.7%，在4℃則為60.0%；納豆激酶乳劑在室溫下放置1個月后殘余酶活為61.0%，在4℃條件下則高達94.0%。說明制備為乳劑能夠顯著提高納豆激酶的放置穩定性。

8.納豆激酶W/O口服乳劑的抗血栓作用

將所制備的納豆激酶乳劑或不含藥空白乳劑（使用蒸餾水代替納豆激酶溶液）灌入小鼠專用腸溶小膠囊，得到納豆激酶乳劑膠囊和空白乳劑膠囊。納豆激酶凍干粉用玉米淀粉以質量比為1：1的比例與納豆激酶混合均勻后，灌入小鼠專用腸溶小膠囊，得到納豆激酶粉末膠囊。

將健康雄性Wistar大鼠35只，稱重后隨機分7組，每組5只，組內編號。各組分別為：空白組、灌服與給藥組數目相同的空膠囊、納豆激酶乳劑膠囊高劑量組（NK-ECa-H，14.4 kU/kg）、納豆激酶乳劑膠囊低劑量組（NK-ECa-L，7.2 kU/kg）、納豆激酶凍干粉膠囊高劑量組（NK-PCa-H，14.4 kU/kg）、納豆激酶凍干粉膠囊低劑量組（NK-PCa-L，7.2 kU/kg）、納豆激酶乳劑直接灌胃組（NK-E，14.4 kU/kg）、空白乳劑膠囊組（ECa，給藥劑量與乳劑高劑量組相同，但制劑中未加入納豆激酶）。

每日給藥1次，連續10日，隔日稱重，觀察記錄大鼠的活動、精神狀態、食欲、肛門周圍干燥與否等情況。在給藥后第11日進行手術造栓，計算相對栓重。最后處死動物，摘取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、結腸，對臟器進行稱重并制作病理切片。

（1）體重變化

根據下式計算各組大鼠的體重增長百分率In%。

In%=（mn-mi）/mi×100%

式中：mn為給藥后第n天大鼠的平均體重；mi為第1天給藥時大鼠的平均體重。

各組大鼠活動、精神情況均正常，無蜷縮、毛發脫落及死亡現象。與對照組相比，各試驗組大鼠進食及排便等未見異常。以體重增長百分率為縱坐標對給藥后天數作圖，結果見圖4-8。

由圖4-8可知，隨著時間的延長，各組大鼠體重均有所增加。在所有觀察的時間點上，各組之間在體重增長無顯著性差異（p＞0.05）。

（2）抗栓率的計算

給藥后第11天，將大鼠以3.5%水合氯醛進行腹腔麻醉（1mL/100g），手術分離雙側頸總動脈。在雙側頸總動脈下各墊一條1.0cm×3.0cm的塑料薄片，用浸漬有50μL FeC13溶液（10%，m/v）的濾紙條（1.0cm×1.5cm）覆蓋雙側頸總動脈。20min后取下濾紙條，剪下變色區域用生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分后測量其長度，并用分析天平精密稱重。

單位長度血栓的質量記為相對栓重（mg/cm），并以下述公式計算抗栓率。

抗栓率%=（mn-mS）/mn×100%

式中：mn為對照組平均相對栓重；mS為給藥組平均相對栓重。

計算抗栓率，并對結果進行統計學分析，結果見表4-7。

表4-7　不同給藥組抗栓率結果及統計學分析

結果表明，與ECa組相比，各種納豆激酶制劑（NK-ECa、NK-PCa和NK-E）均有顯著的抗栓效果（p＜0.05）。NK-ECa和NK-PCa的抗栓效果均顯著強于NK-E（p＜0.05）。NK-ECa的抗栓效果顯著強于NK-PCa（p＜0.05）。對于劑量不同的給藥組，NK-ECa-H的抗栓效果顯著優于NK-ECa-L（p＜0.05）。但NK-PCa-H的抗栓效果與NK-PCa-L相同（p＞0.05）。

實驗證明，NK-ECa的抗栓活性可能是因為納豆激酶在腸道吸收[9，10]的緣故。納豆激酶W/O乳劑進入胃中后即會釋放藥物，這些藥物在酸性環境中產生了降解，導致進入腸道并被吸收的納豆激酶量顯著降低。相比于納豆激酶粉末膠囊，納豆激酶W/O乳劑膠囊顯示出更優的抗栓活性。推測納豆激酶W/O乳劑的這種增效作用主要歸功于其處方中的磷脂和膽酸鹽對消化道黏膜的結構和流動性的改變。[11]一方面，磷脂等脂類可以擾亂小腸上皮細胞表面的黏液保護層，改變腸道黏膜的流動性，[12]從而幫助藥物吸收。另一方面，膽酸鹽能夠溶解磷脂膜，通過調節腸上皮細胞間的緊密連接，為藥物打開進入體內的通道。[13]膽酸鹽能促進蛋白多肽類物質的腸道吸收已有大量文獻報道。如：①甘膽酸鈉可促進鮭魚降鈣素從大鼠的小腸吸收，血鈣降低程度由不加甘膽酸鈉的5.2%增至22.1%；[14]②1%牛磺膽酸鈉可使鮭魚降鈣素體外透過大鼠腸黏膜能力增加14倍；[15]③大鼠空腸在體實驗表明，1%熊脫氧膽酸鹽（UDCA）和1%的鵝脫氧膽酸鹽（CDCA）可促使生長抑素八肽的吸收分別增大17倍和77倍。[16]因此，納豆激酶W/O乳劑膠囊中的膽酸鹽也可能通過類似機制促進納豆激酶的腸道吸收。

納豆激酶W/O乳劑膠囊比納豆激酶粉末膠囊療效更好的原因還可能在于，W/O乳劑進入體內后所產生的包裹作用，這可以改善蛋白多肽類物質的口服吸收生物利用度。[17]將納豆激酶W/O乳劑于37℃下用pH 6.8的人工腸液[3]進行水化，立即使用顯微鏡觀察（圖4-9）。可發現粗大（渾濁）的粒子，其粒徑約為15μm，并且粒子內部分布著水相區域和油相，即類似于W/O/W的結構。由于鏡下觀察難以維持37℃的環境，因此，粒子內部相對固化。推測W/O/W形式的乳滴粒子可能是納豆激酶W/O乳劑進入腸道后的第一種轉化形式，它有助于納豆激酶在小腸環境中的穩定和吸收。而納豆激酶粉末腸溶膠囊在腸道中則不存在這種保護及促吸收的機制。

上述機制還可以解釋：為何納豆激酶W/O乳劑膠囊高、低劑量組之間有藥效學上的差異，但納豆激酶粉末膠囊高、低劑量組間卻沒有觀察到差異。即納豆激酶粉末進入腸道后，只能通過有限的吸收途徑（如細胞間隙和細胞吞噬）吸收，而口服低劑量的納豆激酶粉末膠囊可能就已經使這種吸收途徑飽和。但到達腸道的納豆激酶W/O乳劑卻能借助膽酸鹽的吸收促進作用和W/O/W形式的乳滴粒子包裹作用等實現更大程度的吸收。

二、W/O乳劑表面活性劑的選擇及制劑穩定性

在實驗研究中，我們所采用的SPC的HLB約為4，所以可用于W/O型乳劑的制備。當使用SPC與RH40作為復合乳化劑時，所制得乳劑的穩定性優于僅使用SPC者。一方面，這可能是由于復合乳化劑的HLB約為6，更加接近MCT的HLB（約為8），從而更易使乳劑穩定。另一方面，SPC作為親油性表面活性劑，其在乳化過程中或乳化之后會逐漸轉移到油相直至平衡，而附加表面活性劑（RH40）可以延緩這種平衡的建立或改變平衡點，從而有助于乳劑的穩定。[18]

我們在實驗中發現，相比于甘油、Span80和Tween80，RH40作為附加乳化劑時能提供最好的穩定效果。這可能是因為RH40分子結構中包含3條較長的親水鏈段，并且其親水鏈末端還連接有較長的疏水脂肪鏈（圖4-10）。因此，可以牢固“吸附”于W/O乳劑的界面區（圖4-11），降低表面自由能，幫助維持乳滴粒子的穩定。[19]而甘油為小分子，不具有此作用；Span80僅有1個疏水區和1個親水區；Tween80的4條親水鏈中只有1條末端連接有疏水區。因此，甘油、Span80和Tween80均沒有RH40穩定乳劑的作用強。

在乳劑的連續相（即油相）中添加蜂蠟作為增稠劑，從而降低了乳劑的分層/沉降，也減輕了進一步的絮凝。通過控制蜂蠟的比例（占油相質量的5%），所制備出的W/O乳劑為在室溫（20℃）下黏度較大的半固體，而在37℃下為流動性很好的液體，這樣既能使乳劑在放置時更加穩定，又保證其被口服后在胃腸道能夠較好地水化。

三、制備為W/O乳劑后納豆激酶穩定性提高的可能原因

蛋白質分散于水中時，其表面的親水基團會吸引水分子在其外層包裹而形成一個約3個水分子厚度的水復合膜。膜的各層水分子運動速度不同，由外至內逐漸變慢，緊貼蛋白質表面的一層水分子與蛋白分子以氫鍵或靜電力結合在一起，厚度約為0.3～0.4 nm。[20]蛋白分子表面的水復合膜是其在水中穩定存在的重要條件。[21]而在蛋白質結構的內部，存在有空隙，即蛋白分子內部體積的25%仍未被氨基酸占據，蛋白質通過疏水作用力進行折疊從而對維持其空間穩定起著重要作用。蛋白質的分子構象是指蛋白質分子中所有原子在三維空間中的排布，也即為蛋白質分子的空間結構。多肽鏈中的一切原子，由于主鏈骨架上單鍵的旋轉，產生了不同的空間排列，就是多肽鏈的不同構象，蛋白的功能可由其構象決定。在加熱等情況下，多肽鏈會產生旋轉，使得蛋白的構象發生改變，從而影響了蛋白的功能（活性），并且這種熱變性往往是不可逆轉的。[22]同樣，在加熱的情況下，蛋白表面水復合膜中的水分子動能增強，離去趨勢增加，使得蛋白分子易于受到溶液中的離子攻擊而導致二級或三級結構改變。[23]此外，對于蛋白溶液而言，氣液界面的存在也會通過暴露蛋白疏水區等方式導致蛋白結構損傷。[24]

納豆激酶分子的結構如圖4-12所示，其活性中心在分子內部的疏水區。[25]因此，該疏水區如果因為氣液界面等方式被損傷后，活性將大大降低。

將納豆激酶包裹于W/O乳劑中后，其熱穩定性大大加強。原因可能有以下幾點：①納豆激酶包封于乳劑內部后，相比于溶液形式，不存在空氣-水界面，蛋白不會受到氣液界面的損傷；②W/O乳劑中乳滴的內表面有RH40形成的親水鏈段，這些鏈段對蛋白分子具有保護作用。[24，26]油-水界面上的磷脂頭部與納豆激酶分子間有一定的氫鍵作用[27]和電荷作用（水相pH為6.5，該條件下SPC荷負電，納豆激酶荷正電，彼此有電荷作用力），更加深入到水相中的RH40分子的親水鏈則會“絡合”納豆激酶分子。兩方面的作用可能使納豆激酶分子更多地聚集于界面上被錨定，從而在受熱的情況下不容易發生三級結構的改變（圖4-13）。另一方面，RH40

還會阻礙溶液中離子對納豆激酶的進攻，從而減少納豆激酶的降解。

四、荷負電物質對納豆激酶體外溶栓活性的影響

納豆激酶為荷正電的絲氨酸蛋白酶，其表面有較多的堿性氨基酸基團，因此可能與荷負電的陰離子化合物通過靜電力結合?；诖?，我們通過體外血栓溶解實驗考察陰離子化合物加入對納豆激酶活性的影響，為制劑中輔料篩選提供重要的參考依據。

1.納豆激酶磷脂復合物的體外溶栓研究

（1）不同配方的納豆激酶磷脂復合物的制備

65℃水浴中，分別用1mL叔丁醇溶解口服SPC（100mg）、PS（100mg）或混合磷脂（口服SPC：PS=50mg：50mg）。待磷脂完全溶解后，于37℃攪拌條件下以約0.8mL/s的速度向此體系中注入2mL預熱至相同溫度的納豆激酶溶液（20 000FU/mL），孵育5min，制得不同配方的納豆激酶磷脂復合物粗品。將這些粗品進行真空冷凍干燥，即得不同配方的納豆激酶磷脂復合物。

（2）不同配方納豆激酶磷脂復合物的體外溶栓活性檢測

將所得的納豆激酶磷脂復合物凍干粉精密稱重，換算其單位質量所含的酶活度。取一定量的復合物粉末溶于生理鹽水，配成相應的酶活力（500FU/mL）的溶液。以500FU/mL的納豆激酶凍干粉溶液作為對比，進行體外血凝塊溶解實驗，結果見圖4-14。

由圖4-14可知，納豆激酶制成磷脂復合物后，其體外溶栓活性略微下降，且不含PS的復合物活性下降幅度大于含有PS的。

2.小分子陰離子化合物

配制十二烷基硫酸鈉（SDS）、癸酸鈉（SC）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）或脫氧膽酸鈉（SD）濃度分別為2%（m/v）和0.2%（m/v）的納豆激酶溶液（500FU/mL），見表4-8。將所配制納豆激酶溶液于體外進行血凝塊溶解實驗，比較陰離子化合物的加入給納豆激酶溶栓活性帶來的影響，結果見圖4-15和圖4-16。

表4-8　添加物的濃度、相對分子質量及與納豆激酶的物質的量（摩爾）之比

由圖4-15及4-16可知，陰離子化合物在0.2%的濃度下，抑制能力為SDS＞EDTA-2Na＞SD≈SC。2%的濃度下，抑制能力為SC＞SDS＞EDTA-2Na＞SD。0.2%的SD和SC對納豆激酶的活性基本無影響，它們對納豆激酶的活性抑制能力隨其濃度的上升而顯著提高。SDS和EDTA-2Na的酶活抑制作用亦隨濃度的上升而提高。

3.高分子陰離子化合物

（1）納豆激酶與不同濃度的肝素結合

將500FU/mL納豆激酶溶液分別與50IU/mL、500IU/mL、5000IU/mL的肝素溶液混合，將所得到的一系列混合溶液進行體外血栓溶解實驗，比較肝素的加入對納豆激酶酶活性的影響，結果如圖4-17所示。

表4-9　肝素的活度、相對分子質量及與納豆激酶物質的量（摩爾）之比

肝素為多聚陰離子物質，具有增強抗凝血酶 Ⅲ活性、激活肝素輔助因子 Ⅱ、促進纖溶系統激活及抗血小板聚集的作用，常用于血栓性疾病的治療。[28]在體外，由于離體血凝塊中缺乏肝素的作用底物凝血酶，故無法溶解血凝塊。由圖4-17可知，隨著肝素分子與納豆激酶物質的量（摩爾）之比例的增大（最高達到1：700），納豆激酶的溶栓能力顯著下降。原因可能是大量肝素所帶的負電荷作用于納豆激酶分子上的正電荷，尤其是與賴氨酸殘基結合，所形成的保護層阻礙了納豆激酶與外界的接觸。

（2）納豆激酶與不同濃度的聚谷氨酸結合

配制不同濃度的高分子聚谷氨酸（PGA-H，相對分子質量500 000～800 000）納豆激酶溶液或低分子聚谷氨酸（PGA-L，相對分子質量10 000～100 000）納豆激酶溶液，其中納豆激酶酶活度為500FU/mL，溶液中PGA的濃度及與納豆激酶的摩爾比見表4-10。將各溶液于體外進行血栓溶解實驗，比較不同相對分子質量和濃度的PGA對納豆激酶酶活性的影響，結果如圖4-18和圖4-19所示。

表4-10　聚谷氨酸的濃度、相對分子質量及與納豆激酶物質的量（摩爾）之比

聚谷氨酸溶液的黏度很高，且與其相對分子質量成正比。PGA-L為低分子聚谷氨酸、PGA-H為高分子聚谷氨酸。由圖4-19可知，PGA-L濃度為0.5mg/mL、5mg/mL時，納豆激酶與它的物質的量（摩爾）之比在1：1～10時，納豆激酶活性基本不變，表明PGA對納豆激酶基本沒有活性抑制作用。當濃度增大，物質的量（摩爾）之比增大時，多個PGA-L分子聚集包裹在納豆激酶分子周圍；同理，如圖4-19所示，高聚合度的PGA-H與納豆激酶物質的量（摩爾）之比在1：1左右時，能對納豆激酶起到極強的包裹作用，使得納豆激酶的釋放減慢。由于聚谷氨酸分子對納豆激酶的酶活抑制作用較弱，而聚谷氨酸分子側鏈的陰離子羧基又可能通過電荷作用包裹在納豆激酶分子周圍，防止酸、微生物與金屬離子等對酶的進攻，對酶起到保護作用。

五、實驗因素（血凝塊法）對納豆激酶體外溶栓活性的影響

1.不同凝血與放置條件下血凝塊對納豆激酶、尿激酶體外溶栓活性的影響

現在已知的納豆激酶的溶栓機制（圖4-20）主要有以下4點：[29]

注：PAI-1是凝血酶原激活因子的抑制因子

①將交聯纖維蛋白直接水解成小肽和氨基酸發揮溶栓作用；

②促進血管內皮細胞產生組織型纖溶酶原激活劑（t-PA），t-PA催化纖溶酶原轉變成纖溶酶，溶解血栓。

③促使體內尿激酶原轉變為尿激酶，從而激活纖溶酶原，所生成的纖溶酶可溶解血栓。

④在體外具有降解纖溶酶原激活劑的抑制劑PAI-1的作用。PAI-1可通過水解t-PA而減少纖溶酶的生成。PAI-1的失活導致t-PA增加，使生成纖溶酶的量增加，從而加速血栓溶解。

其中，納豆激酶所具備的直接降解交聯纖維蛋白的特性對于其體外溶栓作用貢獻最大。而尿激酶的溶栓活性的發揮則主要依賴于其對纖溶酶原的直接激活，但陳舊血栓中缺乏纖溶酶原，所以納豆激酶對陳舊血栓的溶解效果遠較尿激酶強。[30]

室溫下自然放置的血凝塊被空氣中氧、微生物等降解，其中的交聯纖維蛋白網會變性而導致致密程度降低，有利于溶栓藥物的進入。所以血凝塊放置時間越長，納豆激酶對其溶解作用越強。對于尿激酶的溶栓過程而言，除了以上的原因，還可能是血塊變得疏松有助于釋放血塊中原有的纖溶酶原，尿激酶激活纖溶酶原產生更多的纖溶酶，從而使溶栓效果加強。

比較尿激酶對室溫和37℃下自然凝固血塊的溶解能力，發現尿激酶對37℃下生成并保存的血塊溶解作用較弱。但經過了抗氧抑菌處理之后，兩溫度下的這種差距明顯減小。分析產生這一現象的主要原因是，即使在體外凝血與溶栓的動態平衡也依然存在。37℃比室溫更有利于凝血與溶栓的進行，新血塊內外的纖溶酶原也在此適宜的溫度中被消耗得更完全，尿激酶缺少反應底物，故溶栓效果弱。

納豆激酶對室溫下放置20h和5天的血凝塊溶栓作用之間的差距在通過抗氧抑菌處理后基本被消除。這說明，在室溫下，影響血凝塊性質的主要因素是氧和微生物。然而在37℃下，通過抗氧抑菌處理后，納豆激酶對新舊血凝塊溶解效果的差距不僅沒有消除反而進一步加大，而且是舊血凝塊更加難以被溶解。說明在37℃下，除了氧和微生物對血塊性質的影響外，還有更復雜的因素會改變血凝塊的性質。另一方面，過于復雜的影響因素也不利于我們進行納豆激酶溶栓活性的體外評價。因此，在之后的實驗中選擇室溫作為血凝塊的生成及保存條件。

2.溫度和pH對納豆激酶體外溶栓結果的影響

對于酶催化反應來說，溫度起著重要作用。溫度對酶促反應的影響主要有兩個方面：一是溫度對酶穩定性的影響，即酶熱變性失活作用；二是溫度對酶促反應本身的影響。一般情況下，隨著溫度的升高，酶催化反應速度加快，這與一般的化學反應一樣。但是酶作為一種有活性的蛋白，具有特定的空間結構，溫度過高，則蛋白質的空間結構難以維持，會導致熱變性。所以，在一定的溫度范圍內，酶反應達到最大的速率的溫度，則為酶促反應的最適溫度。[31]另一方面，選擇37℃作為反應溫度可模擬人體內部環境。然而對于納豆激酶的體外溶栓，底物不同，反應的各項參數也不同。董志奎[32]研究發現，納豆激酶以TAME（對甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯）為底物時的最適反應溫度為37℃，而高大海[33]以纖維蛋白平板法、倪劍鋒[34]以Folin顯色法考察了納豆激酶的活性，發現其在55℃時的相對酶活最高。我們通過血凝塊溶解實驗發現，納豆激酶體外溶栓的最適溫度為37℃。

同樣，酶促反應的pH也是影響酶活力的重要因素。在納豆激酶體外溶栓實驗中，pH的選擇既要符合酶自身的活性酸堿范圍，又要能與體內反應相關聯。文獻報道，納豆激酶體外酶促反應的最適pH在8.6左右，[32]而人體血液的正常pH一般在7.35～7.45，腫瘤組織周圍微環境中的pH一般在6.5左右，癌癥病人的血液則幾乎均呈酸性。[35]因此我們考察了納豆激酶在pH 6.0、pH 7.4和pH 9.0三個pH環境中的溶栓率，發現納豆激酶在pH 7.4和pH 9.0環境中的溶栓活性并沒有顯著差異（圖4-21）。

3.磷脂復合物對納豆激酶酶活性影響結果的分析

納豆激酶制成磷脂復合物后，不含PS的復合物其活性略低于含PS的復合物，原因可能在于復合物制備過程對酶活性有一定的破壞，而荷負電的PS可通過靜電作用與荷正電的納豆激酶結合，從而在加熱或冷凍過程中對酶的空間結構進行保護，減少酶活性的下降。但PS與納豆激酶的結合也會在一定程度上減弱納豆激酶對底物的催化作用，也許由于PS與納豆激酶的結合在空間上沒有對納豆激酶的活性位點造成大的阻礙，所以這種削弱作用并不明顯。也有另一種可能，即納豆激酶-PS復合物與底物作用時，納豆激酶與磷脂的結合被打開，重新與親和力更強的纖維蛋白作用，即磷脂與納豆激酶的結合是一種可逆性結合。猜測這種可逆性結合可能是通過荷正電的納豆激酶與荷負電的PS之間的靜電力以及納豆激酶分子與磷脂分子間的范德華力，[36]當復合物與酶的底物反應時，這種結合就能被替換，而不會掩蔽酶的活性基團導致酶活下降。

綜上可見，磷脂復合物的形成可以減弱納豆激酶在制劑過程中被破壞并維持其活性。

4.考察聚谷氨酸對納豆激酶活性影響的意義

很多大分子化合物已證明具有穩定蛋白質的作用。其穩定機制可能包括大分子的表面活性、優先排除、與蛋白分子相互作用的空間隱蔽、黏度提高限制蛋白質運動等。[37]

聚谷氨酸是一種天然的水溶性極強的陰離子聚合物（圖4-22），易被生物降解，[38]故可用于增稠劑、保護劑[39]、緩釋材料、藥物載體[40]、生物黏合劑固化[41]、可生物降解的纖維、高水吸收的水凝膠、生物高分子絮凝劑[42]以及重金屬吸收劑[43]等多個領域。

γ-聚谷氨酸作為納豆激酶發酵液中的黏性副產物，[44]在食用納豆時對納豆激酶免受胃中強酸破壞起保護作用，故可知聚谷氨酸本身對納豆激酶活性沒有破壞作用。此外，作為一種堿性絲氨酸蛋白，納豆激酶表面具有多個荷正電的氨基酸殘基，而γ-聚谷氨酸側鏈上存在大量陰離子羧基，二者通過靜電力結合。聚谷氨酸在納豆激酶周圍形成保護層，其表面大量的親水基，能與水形成牢固的水化膜，[45]阻止消化道中的強酸和酶對納豆激酶結構的破壞以及分子之間的相互聚集，從而維持納豆激酶的空間構象，保持納豆激酶的活性。同時，聚谷氨酸在體內的生物可降解性[46]也能很好地實現被包裹的納豆激酶的順利釋放，不影響納豆激酶到達靶位點的吸收。