第四節(jié)　納豆激酶生物微膠囊

生物微膠囊是將生物大分子、微生物、動(dòng)植物細(xì)胞如酶、輔酶、蛋白質(zhì)等包封在一層具有親水性的半透膜內(nèi)，形成珠狀微膠囊，可以使細(xì)胞和生物大分子阻隔在微膠囊的膜內(nèi)或膜外。而其他的小分子物質(zhì)，包括氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等可以自由通過(guò)，實(shí)現(xiàn)催化、培養(yǎng)或分離。

用于生物物質(zhì)固定化的常用生物微膠囊有海藻酸鈉類、殼聚糖類、聚丙烯酸酯類和瓊脂類等，見(jiàn)表4-11。[47]

目前研究較多的生物微膠囊主要有聚賴氨酸/海藻酸微膠囊、甲基纖維素/海藻酸鈣微膠囊、脫乙酰幾丁質(zhì)/海藻酸鈉微膠囊、聚賴氨酸/脫乙酰幾丁質(zhì)/海藻酸鈉雙層膜微膠囊、脫乙酰幾丁質(zhì)/羧甲基纖維素微膠囊、甲基丙烯酸乙基酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物微膠囊、海藻酸鈉/聚賴氨酸/海藻酸鈉微膠囊等。其中，最常用的是聚賴氨酸/海藻酸鈉微膠囊。但由于這一微膠囊制備過(guò)程比較復(fù)雜，過(guò)程涉及的物理、化學(xué)因素繁多，需要幾步化學(xué)反應(yīng)才能成囊，而制得的微膠囊性能差異很大。微膠囊的囊膜強(qiáng)度、對(duì)包囊的生物細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)的透過(guò)以及對(duì)目的產(chǎn)物的阻隔也不夠理想，尚有待進(jìn)一步研究和改善以滿足需要。

表4-11　常用的生物微膠囊[47]

注：ALG，海藻酸；PLL，聚賴氨酸；HEMA，甲基丙酯乙基酯；MMA，甲基丙烯甲酯。

一、納豆激酶產(chǎn)生菌的PDMDAAC-NaCS微膠囊

1.培養(yǎng)基

胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂均為國(guó)產(chǎn)；葡萄糖、木糖、NaCl、Na2hPO4、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.制備工藝

用去離子水配制4.0%的硫酸纖維素鈉（NaCS）溶液，用生理鹽水配制5%聚二甲基二烯丙基氯化銨（PDMDAAC）溶液。用注射器吸取NaCS溶液，滴入PDMDAAC溶液中；或者用膠囊發(fā)生器滴制。PDMDAAC溶液保持低速攪拌以加速反應(yīng)進(jìn)行。經(jīng)2h左右的反應(yīng)固化，即形成中空的NaCS-PDMDAAC微膠囊。將膠囊取出用去離子水和生理鹽水溶液充分洗滌后，存放于生理鹽水中備用。制備固定化菌體的生物微膠囊時(shí)，只需將NaCS溶液換為NaCS菌懸液（NaCS溶液和菌懸液以10：1混合）即可。

3.工藝說(shuō)明

用NaCS制備的微膠囊對(duì)溶栓酶產(chǎn)生菌進(jìn)行了試培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在不同的糖濃度條件下，2%的糖濃度是最適合培養(yǎng)菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的條件。利用不同氮源下培養(yǎng)時(shí)注意到，氮源為2%胰蛋白胨、1%酵母膏時(shí)適于培養(yǎng)菌的生長(zhǎng)。對(duì)于不同的裝液量，通過(guò)考察250mL搖瓶中裝20、30、40、50mL的培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)證明，裝液量為30mL時(shí)最適合菌體的生長(zhǎng)。在膠囊裝載量的考察中得出，膠囊裝載量20mL為較佳的培養(yǎng)條件。最后，在連續(xù)培養(yǎng)中驗(yàn)證了該條件的優(yōu)越性，最高酶活達(dá)到了2014FU/mL。[48]

二、納豆激酶產(chǎn)生菌的SA/CS-CaCl2/PMCG微膠囊

1.培養(yǎng)基

胰蛋白陳、酵母粉、瓊脂均為國(guó)產(chǎn)；葡萄糖、木糖、NaCl、Na2hPO4、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.制備工藝

用去離子水分別配制同體積5%的NaCS（CS）溶液和2.5%海藻酸鈉（SA）溶液，按體積比10：1將NaCS溶液和納豆菌懸液混合。此液再與SA液混合滴到CaCl2溶液中，反應(yīng)30min，形成實(shí)心微膠囊，用生理鹽水洗滌多次，洗去CaCl2。然后，將實(shí)心微膠囊轉(zhuǎn)入PMCG溶液中，經(jīng)PMCG與SA和CS的快速界面反應(yīng)，在實(shí)心微膠囊周圍形成一層很薄的膜。約10min后，PMCG與SA和CS在膜的附近全部反應(yīng)，形成外面覆蓋有一層膜的實(shí)心微膠囊。一方面，由于小分子物質(zhì)Ca2+的競(jìng)爭(zhēng)作用，聚陽(yáng)離子PMCG很難進(jìn)入微膠囊的內(nèi)部；另一方面，這層膜雖然很薄，但比較緊密，不能透過(guò)大分子的PMCG。因此，在微膠囊內(nèi)部空間就不存在PMCG，黏附在微膠囊外壁的PMCG則可通過(guò)反復(fù)洗滌去掉，不會(huì)對(duì)囊內(nèi)的微生物產(chǎn)生不良影響。微膠囊用生理鹽水洗滌多次，去除PMCG之后，轉(zhuǎn)入到0.05 mol/L的檸檬酸三鈉溶液中，去除膠囊液中的Ca2+，得到空心的微膠囊。

3.工藝說(shuō)明

SA/CS-CaCl2/PMCG體系中除了PMCG對(duì)微生物具有毒性之外，其他成分對(duì)微生物沒(méi)有明顯的毒性。而且PMCG不能自由進(jìn)出微膠囊，所以對(duì)囊內(nèi)微生物的生長(zhǎng)無(wú)影響。微囊化枯草桿菌的生長(zhǎng)曲線與游離培養(yǎng)具有很強(qiáng)的相似性，說(shuō)明微囊化的細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境沒(méi)有發(fā)生很大的變化，該體系具有較好的生物相容性。微膠囊具有截留生物大分子的能力，從而可以累積生物蛋白，起到濃縮的效果。微膠囊半連續(xù)培養(yǎng)可以達(dá)到普通游離培養(yǎng)的兩倍濃縮效果，減輕了后續(xù)分離工作量。但納豆激酶在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有部分失活，且在連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中，可能會(huì)積累很多雜蛋白。[48]