第三節(jié)　滅菌方法與無菌操作

一、概述

滅菌與無菌操作的主要目的是：在最大限度地保證藥物制劑安全性和臨床療效的同時，盡可能殺滅或除去微生物繁殖體和芽孢。根據(jù)各種制劑或生產(chǎn)環(huán)境對微生物的限定要求不同，可采取不同的措施進(jìn)行處理，如滅菌、除菌、防腐、消毒和無菌操作。

滅菌（sterilization）系指采用物理或化學(xué)方法將所有微生物、繁殖體和芽孢全部殺滅的技術(shù)。

除菌（debacteria）系指利用過濾介質(zhì)或靜電法將細(xì)菌截留而除去的技術(shù)。

防腐（antisepsis）即抑菌，系指采用化學(xué)藥品或低溫防止和抑制微生物生長與繁殖的技術(shù)。

消毒（disinfection）系指采用物理或化學(xué)方法殺滅病原微生物的技術(shù)。

微生物的種類不同，滅菌方法不同，滅菌效果也會有差異。細(xì)菌的芽孢具有較強(qiáng)的抗熱能力，因此滅菌的效果常以殺滅芽孢為準(zhǔn)，但不能保證物料絕對無菌。無菌操作工藝只用于某些特定產(chǎn)品的生產(chǎn)，從藥品、人員、器具、空氣和環(huán)境等制劑生產(chǎn)過程中的各個環(huán)節(jié)應(yīng)保持沒有微生物污染的嚴(yán)格無菌狀態(tài)。

無菌藥品包括無菌制劑和無菌原料藥，按生產(chǎn)工藝可分為采用最終滅菌工藝的最終滅菌產(chǎn)品和采用無菌生產(chǎn)工藝的非最終滅菌產(chǎn)品。在物料允許的條件下，要盡可能采用最終滅菌工藝。滅菌的方法分類如圖3-3所示。

二、滅菌工藝參數(shù)

藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對于保證藥品質(zhì)量具有重要的意義，但是無菌檢驗(yàn)方法存在一定的局限性。充分了解滅菌動力學(xué)，可以更好地設(shè)計滅菌方法并對其進(jìn)行合理的驗(yàn)證，以提高滅菌的質(zhì)量水平。以下介紹幾個重要的滅菌參數(shù)。

（一）D值與Z值

1.D值

在一定溫度下，殺滅90%微生物（或殘存率為10%）所需的滅菌時間。研究表明，滅菌時微生物死亡的速度可以用一級動力學(xué)過程來描述：

　　（3-1）

或

　　（3-2）

式中，N0為原有微生物數(shù)；Nt為滅菌時間為t時殘存的微生物數(shù)；k為殺滅速度常數(shù)。

lgNt對t作圖得一直線，，令斜率的負(fù)倒數(shù)為D值，即：

　　（3-3）

由式（3-3）可知，當(dāng)lgN0-lgNt=1時，D=t，即D值為被滅菌物品中微生物數(shù)降至原來的1/10或降低一個對數(shù)單位（lg100降至lg10）所需的時間，如圖3-4所示。

D值越大，表明該溫度下微生物的耐熱性越強(qiáng)；微生物的種類、所處環(huán)境、滅菌方法、滅菌溫度不同，D值也不同；在其他條件固定的情況下，D值隨滅菌溫度的升高而降低。見表3-8。

2.Z值

在控制滅菌溫度時，為了確保滅菌的效果，必須了解該溫度下微生物的D值，同時也應(yīng)了解溫度變化對于D值的影響。當(dāng)滅菌溫度升高時，速度常數(shù)k增大，而D值（滅菌時間）隨溫度的升高而減少。在一定溫度范圍內(nèi)（100～138℃），lgD與溫度T呈線性關(guān)系。

令

　　（3-4）

由式可知，Z值為降低一個lgD值所需升高的溫度數(shù)，即滅菌時間減少到原來的1/10所需升高的溫度，或在相同滅菌時間內(nèi)，殺滅99%的微生物所需提高的溫度，如圖3-5所示。如Z=10℃，意思是滅菌時間減少到原來滅菌時間的10%，且具有相同的滅菌效果，所需升高的滅菌溫度為10℃。式（3-4）可以改寫為：

　　（3-5）

設(shè)Z=10℃，T1=110℃，T2=121℃，則D2=0.079D1。即110℃滅菌1min與121℃滅菌0.079min，滅菌效果相當(dāng)。若Z=10℃，滅菌溫度每增加1℃，則D1=1.259D2，即溫度每升高1℃，滅菌速率相應(yīng)提高25.9%。Z值越大，微生物對滅菌溫度變化的敏感性越弱，期望通過提高溫度來減少滅菌時間的效果越不明顯。

（二）F值與F0值

為了保證終產(chǎn)品的無菌效果，目前多采用F與F0值來驗(yàn)證滅菌的可靠性。

1.F值

為在一定溫度T下，給定的Z值產(chǎn)生的滅菌效果與參比溫度T0下產(chǎn)生的滅菌效果相同時所相當(dāng)?shù)臅r間（equivalent time），以min為單位。即整個滅菌過程的效果相當(dāng)于溫度T0下F時間的滅菌效果。其數(shù)學(xué)表達(dá)式：

　　（3-6）

式中，Δt為測量被滅菌物品溫度的時間間隔，一般為0.5～1.0min或更小；T為每個時間間隔Δt所測量被滅菌物品的溫度；T0為參比溫度。

2.F0值

在濕熱滅菌時，參比溫度為121℃，以嗜熱脂肪芽孢桿菌作為微生物指示菌，該菌在121℃時，Z值為10℃。即：

　　（3-7）

式中，F0為在一定滅菌溫度T、Z值為10℃所產(chǎn)生的濕熱滅菌效果與121℃、Z值為10℃所產(chǎn)生的滅菌效果相同時所相當(dāng)?shù)臅r間，min。也就是說，不管溫度如何變化，t時間產(chǎn)生的滅菌效果相當(dāng)于溫度在121℃下滅菌F0（min）的效果，即它把所有溫度下的滅菌效果都轉(zhuǎn)化為121℃下滅菌的等效值。因此稱F0值為標(biāo)準(zhǔn)滅菌時間（min）。按式（3-7）定義的F0值又稱為物理F0值，目前F0值常用于熱壓滅菌。

滅菌過程中，只需記錄被滅菌物品的溫度和時間，就可算出F0。假設(shè)記錄的數(shù)據(jù)如表3-9所示，Δt為1min，即每分鐘測量一次溫度。

用式（3-7）計算如下：

計算結(jié)果表明，44min內(nèi)一系列溫度下的滅菌效果相當(dāng)于在121℃滅菌8.49min的滅菌效果。

影響F0值的因素主要有：①容器大小、形狀及熱的穿透性；②被滅菌物品溶液的性質(zhì)、填充量；③容器在滅菌器中的數(shù)量及分布等。

為了確保滅菌效果，還應(yīng)注意兩個問題，根據(jù)F0=D121×（lgN0-lgNt）可知，若N越大，即被滅菌物中微生物越多，則滅菌時間越長，故生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量減少微生物的污染，應(yīng)采取各種措施使每個容器的含菌數(shù)控制在10個以下（即lgN0≤1）。其次，考慮到安全因素，在計算F0值時，一般增加50%的F0值，如規(guī)定F0為8min，則實(shí)際操作應(yīng)控制F0為12min。

三、物理滅菌法

物理滅菌法系指采用加熱、射線和濾過等物理手段殺滅或者除去微生物的技術(shù)。

（一）熱力滅菌法

該法采用加熱的方法破壞蛋白質(zhì)和核酸中的氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性凝固，核酸破壞，酶失去活性，最終導(dǎo)致微生物死亡，是最常用和最可靠的滅菌法。熱力滅菌法又可分為干熱滅菌法和濕熱滅菌法。

1.干熱滅菌法

干熱滅菌法系指利用干熱空氣或火焰進(jìn)行滅菌的方法，即分為干熱空氣滅菌法和火焰滅菌法。該法適用于耐高溫但不耐濕熱的物品和用具的滅菌，如金屬、玻璃及瓷器、纖維制品和液體石蠟等。

（1）干熱空氣滅菌法　系指在高溫干熱空氣中滅菌的方法。在干燥條件下，微生物的耐熱性較強(qiáng)，所以必須延長受高熱的時間才能實(shí)現(xiàn)滅菌的目的。《中國藥典》現(xiàn)行版規(guī)定，干熱空氣滅菌條件一般為160～170℃ 120min以上，170～180℃ 60min以上，250℃ 45min以上，也可采用其他溫度和時間參數(shù)。250℃滅菌45min可除去產(chǎn)品中的熱原。采用干熱滅菌時，為保證滅菌的均一性和有效性，被滅物品不能排列過密。無論采用何種滅菌條件，均應(yīng)保證滅菌后物品的SAL≤10-6。本法的缺點(diǎn)是對滅菌溫度的要求較高，穿透力弱，滅菌時間較長，不適用于橡膠、塑料及大部分藥品。

（2）火焰滅菌法　系指直接在火焰中灼燒滅菌的方法。該法滅菌迅速、可靠、簡便，適用于耐火焰材質(zhì)的物品與用具的滅菌，不適用于藥品的滅菌。

采用干熱滅菌法滅菌時應(yīng)注意以下問題：①滅菌的玻璃器皿上不可有水，否則干熱滅菌的過程中容易炸裂；②被滅菌物品不能裝得太滿，以保證滅菌溫度均勻上升；③降溫操作時，應(yīng)待溫度自然降至60℃以下才能打開箱門取出物品，否則驟然降溫易導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。

2.濕熱滅菌法

濕熱滅菌法系指用飽和水蒸氣、沸水或流通蒸汽進(jìn)行滅菌的方法，以高溫高壓水蒸氣為介質(zhì)，由于蒸汽潛熱大，穿透力強(qiáng)，容易使蛋白質(zhì)變性或凝固，最終導(dǎo)致微生物的死亡，所以該法的滅菌效率比干熱滅菌法高，是熱力滅菌中應(yīng)用最廣泛的方法，也是國內(nèi)制藥工業(yè)普遍采用的方法。

濕熱滅菌的條件通常為126℃ 15min、121℃ 30min、116℃ 40min。但也可采用其他溫度和時間參數(shù)，無論采用哪種參數(shù)，都必須要確保物品滅菌后的SAL≤10-6。對熱穩(wěn)定的物品，滅菌工藝首選過度殺滅法；對熱不穩(wěn)定的物品，滅菌工藝的確定要依賴于其耐熱性和滅菌前微生物的污染水平。

（1）熱壓滅菌法　系指采用高壓飽和水蒸氣加熱殺滅微生物的方法。由于蒸汽的潛熱大、穿透力強(qiáng)，能殺死所有的細(xì)菌繁殖體和芽孢，因此具有很好的滅菌效果。凡能耐高壓蒸汽的制劑和容器均可用此法。常用的熱壓滅菌器有手提式熱壓滅菌器、立式熱壓滅菌器和臥式熱壓滅菌柜。國內(nèi)大多數(shù)注射劑車間配備的滅菌器在滅菌過程中已實(shí)現(xiàn)自動化，可自動記錄滅菌溫度和時間，計算出F0值，判斷是否滅菌完全。表3-10為不同熱壓條件和達(dá)到過度殺滅所需的時間。

（2）流通蒸汽滅菌　系指在常壓下使用100℃流通蒸汽加熱殺滅微生物的方法。滅菌時間通常為30～60min，此法適用于不耐高熱的物品滅菌，這種方法不能殺滅所有的芽孢，一般作為不耐熱無菌產(chǎn)品的輔助滅菌手段。

（3）煮沸滅菌法　系指將待滅菌物品放入沸水中加熱滅菌的方法。煮沸時間一般為30～60min，該法滅菌效果差，在用其進(jìn)行注射器和注射針等器皿的消毒時，常需加入抑菌劑，如苯酚、甲酚、三氯叔丁醇等，以提高滅菌效果。

（4）低溫間歇滅菌法　系指將待滅菌的物品置于60～80℃的水中或流通蒸汽中加熱1h，在室溫下放置24h，使殘存的芽孢發(fā)育成繁殖體，再次進(jìn)行加熱將其殺滅。如此反復(fù)進(jìn)行多次，直至殺滅所有芽孢。該法適用于不耐高熱的物品滅菌。其缺點(diǎn)是：費(fèi)時低效、對芽孢的殺滅效果不理想，必要時要加適量的抑菌劑。

影響濕熱滅菌的因素有以下幾個方面。①滅菌溫度和時間：一般來說，滅菌的溫度和時間與藥物的分解速度有關(guān)。溫度升高，時間延長可提高滅菌效果，但藥物的分散速度隨之加快。為保證藥物的穩(wěn)定性和有效性，應(yīng)在達(dá)到有效滅菌的前提下選擇較低的滅菌溫度和較短的滅菌時間。②蒸汽的性質(zhì)：蒸汽有飽和蒸汽、濕飽和蒸汽和過熱蒸汽三種。飽和蒸汽的潛熱大、穿透力強(qiáng)、滅菌效果好。濕飽和蒸汽熱含量較低、穿透力差，滅菌效果不好。過熱蒸汽溫度高，但穿透力差，因此滅菌效果也不好。③微生物的種類、發(fā)育階段和數(shù)量：微生物的種類和發(fā)育階段不同，其耐熱性能存在很大的差異，如芽孢的耐熱壓性比其繁殖體和衰老體都大得多。④各類制劑的介質(zhì)性質(zhì)：制劑中的各類營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、蛋白質(zhì)的含量越高，微生物耐熱性越強(qiáng)。介質(zhì)的pH對細(xì)菌的生存能力也會有影響，微生物在中性環(huán)境中的耐熱性最強(qiáng)，在堿性環(huán)境中次之，在酸性環(huán)境中最不利于微生物的生長。

（二）射線滅菌法

射線滅菌法系指采用輻射、微波和紫外線殺滅微生物和芽孢的方法。根據(jù)射線源的不同可分為輻射滅菌法、微波滅菌法和紫外線滅菌法。

1.輻射滅菌法

輻射滅菌法系指采用放射性同位素（60Co或137Cs）發(fā)出的γ射線殺滅微生物和芽孢的方法。輻射可以使分子直接發(fā)生電離，產(chǎn)生影響微生物正常代謝的自由基，導(dǎo)致生物大分子物質(zhì)分解，從而殺滅微生物。其特點(diǎn)是：不升高滅菌產(chǎn)品的溫度，穿透力強(qiáng)，適用于不耐熱藥物的滅菌，滅菌效率高；但設(shè)備費(fèi)用較高，對操作人員存在潛在的危險性，須注意安全防護(hù)；可能會使一些藥物的藥效降低，不適于蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子藥物的滅菌，還有可能產(chǎn)生毒性和發(fā)熱物質(zhì)等。我國已將60Co輻射應(yīng)用于藥品滅菌中，但目前僅作為中藥滅菌的輔助手段。輻射滅菌在應(yīng)用于藥品或食品前都要經(jīng)過安全測試，以保證滅菌時吸收的輻射量在安全范圍之內(nèi)。

2.微波滅菌法

微波滅菌法系指利用微波照射產(chǎn)生的熱能和電場殺滅微生物和芽孢的方法。微波是一種高頻電磁波，頻率為300MHz～300GHz。其滅菌的作用機(jī)制包括熱效應(yīng)和強(qiáng)電場破壞作用，微生物中的水分子吸收微波中的能量并且隨著微波電場方向的變化高速轉(zhuǎn)動，分子之間相互摩擦，被滅菌物品溫度迅速升高；此外，微波產(chǎn)生的強(qiáng)電場可以破壞微生物的活性結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致微生物的死亡。

該法適用于液體制劑、中藥飲片和固體物料的滅菌，且對固體物料具有干燥作用。其特點(diǎn)是：微波能穿透到介質(zhì)和物料的深部，可使介質(zhì)和物料表里均勻地加熱；具有高效、快速、能耗低、無污染、易操作、易維護(hù)等特點(diǎn)。

3.紫外線滅菌法

紫外線滅菌法系指用紫外線照射殺滅微生物和芽孢的方法。用于滅菌的紫外線波長一般為200～300nm，滅菌力最強(qiáng)的波長為254nm。紫外線能使核酸蛋白變性，還能使空氣中的氧氣產(chǎn)生微量臭氧，產(chǎn)生協(xié)同殺菌作用。該法適用于物品表面的滅菌、無菌室空氣及蒸餾水的滅菌等，不適于藥液的滅菌及固體物料深部的滅菌。此外，紫外線穿透能力弱，并能被普通玻璃吸收，裝于玻璃容器中的藥物也不能用紫外線滅菌。

（三）濾過除菌法

濾過除菌法系指基于細(xì)菌不能通過致密具孔濾材的原理除去制劑中細(xì)菌的方法。繁殖型細(xì)菌大小一般>1μm，芽孢≤0.5μm，除菌過濾器的孔徑一般小于0.22μm，濾過除菌法的優(yōu)點(diǎn)是可以保證藥物的穩(wěn)定性，但是濾過除菌并不可靠（不適用于芽孢），一般僅適用于對熱相當(dāng)不穩(wěn)定的藥品溶液、氣體的滅菌。

除菌用的過濾介質(zhì)應(yīng)能有效地除去物料中的細(xì)菌，濾材與濾液不發(fā)生相互交換，濾器易清洗，有較高的濾過效率。濾過除菌法的實(shí)施需要嚴(yán)格控制其潔凈度，應(yīng)在無菌環(huán)境中進(jìn)行過濾操作。常用的除菌濾器有垂熔玻璃漏斗、微孔薄膜濾器和砂濾棒過濾器等。垂熔玻璃漏斗可耐高溫及強(qiáng)酸，其型號以G表示，大體上分為1～6號，G6號可用于濾過細(xì)菌。

四、化學(xué)滅菌法

化學(xué)滅菌法系指用化學(xué)藥品直接作用于微生物而將其殺死的方法，包括氣體滅菌法和液體滅菌法。殺菌劑僅對繁殖體有效，不能殺死芽孢。化學(xué)滅菌的目的在于減少微生物的數(shù)量，控制無菌水平。理想的殺菌劑應(yīng)易溶于水、毒性低、作用迅速、殺菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、有效殺菌濃度低。殺菌劑的殺滅效果主要取決于微生物的種類與數(shù)量、物體表面的光潔度或多孔性以及殺菌劑的性質(zhì)等。

1.氣體滅菌法

氣體滅菌法系指采用氣態(tài)殺菌劑進(jìn)行滅菌的方法。氣體滅菌法適用于空氣和環(huán)境的消毒，適用于不耐熱的藥品、醫(yī)用器具、設(shè)備和設(shè)施等的消毒。用于藥物滅菌的氣體應(yīng)具備以下要求：在室溫下能形成氣體或蒸氣；穿透力強(qiáng)；毒性低，低濃度就具有殺菌作用；無腐蝕性、爆炸性和刺激性。常用的氣態(tài)殺菌劑有環(huán)氧乙烷、甲醛、臭氧等，環(huán)氧乙烷的擴(kuò)散和穿透能力強(qiáng)，但是易燃易爆，可產(chǎn)生吸入毒性，因此使用時應(yīng)該要注意；甲醛的殺菌力更強(qiáng)，但穿透力稍差，并且會產(chǎn)生二次污染；臭氧擴(kuò)散性較高，殺菌能力強(qiáng)，是公認(rèn)的綠色滅菌劑。

2.液體滅菌法

液體滅菌法系指通過液態(tài)殺菌劑溶液進(jìn)行滅菌的方法。常用的液態(tài)殺菌劑有75%乙醇、1%聚維酮碘溶液、0.1%～0.2%新潔爾滅溶液（苯扎溴銨）、2%左右苯酚或煤酚皂溶液等。該法常作為其他滅菌法的輔助措施，適用于皮膚、無菌器具和設(shè)備、潔凈區(qū)環(huán)境等的表面消毒。

五、無菌操作

無菌操作系指整個操作過程在無菌環(huán)境中制備無菌制劑的方法和技術(shù)，主要包括無菌分裝和無菌凍干技術(shù)。在無菌凍干的生產(chǎn)工藝中，必須采取濾過除菌法來去除微生物。采用無菌生產(chǎn)工藝時，應(yīng)對生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控，以保證在生產(chǎn)工藝過程中對潔凈度的要求，此外，還需嚴(yán)格監(jiān)控?zé)o菌操作過程，包括對操作人員的衛(wèi)生要求，對設(shè)備、容器、包裝材料、膠塞等進(jìn)行滅菌，并且保證滅菌之后不會發(fā)生二次污染，還須定期對無菌生產(chǎn)工藝進(jìn)行檢驗(yàn)，包括對環(huán)境空氣過濾系統(tǒng)的有效性驗(yàn)證及培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)等。

在藥物制劑中，采用無菌生產(chǎn)工藝制備的劑型有注射液、眼用溶液劑或眼用軟膏劑等。按此種方法制備出的制劑，最后一般不再滅菌，但必須按照《中國藥典》規(guī)定的“無菌檢查法”進(jìn)行微生物檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后方能使用。

（一）無菌操作室的滅菌

在進(jìn)行無菌生產(chǎn)之前，需采用適宜的方法對制備的用具、材料以及環(huán)境進(jìn)行滅菌。為使無菌保證水平符合要求，多采用滅菌和除菌相結(jié)合的方式。對于流動和靜止環(huán)境的空氣一般采用不同的滅菌方式，前者采用濾過除菌法，而后者采用氣體滅菌法。

除應(yīng)定期對無菌室的空間進(jìn)行徹底滅菌之外，還要對室內(nèi)的一切物體、器材、地面、墻壁等進(jìn)行滅菌，可以用75%乙醇等液態(tài)殺菌劑進(jìn)行噴灑或擦拭。其他用具盡量用熱壓滅菌法或干熱滅菌法滅菌。每天工作前，須在無菌室無人的狀態(tài)下開啟紫外線燈照射1h，中午休息也要開0.5～1h，以保證在無菌狀態(tài)下進(jìn)行生產(chǎn)。

（二）無菌操作注意事項(xiàng)

①在執(zhí)行無菌操作時，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。

②執(zhí)行無菌操作前，先戴帽子、口罩，洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。

③夾取無菌物品，必須使用無菌持物鉗。

④進(jìn)行無菌操作時，凡未經(jīng)消毒的手、臂均不可直接接觸無菌藥品或超過無菌區(qū)取物。

⑤無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi)，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一打開即不能視為絕對無菌，應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回?zé)o菌容器內(nèi)。

⑥無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的櫥柜內(nèi)，并保持清潔干燥，與非無菌包分開放置，并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否過量。