第三節　小鼠神經干細胞培養

一、成年鼠神經干細胞培養

神經干細胞具有自我更新和分化成中樞神經系統不同類型細胞的能力。體外分離培養和分析神經干細胞是揭秘神經發生的細胞和分子機制的重要方法，也有助于神經系統疾病和神經損傷干細胞治療的條件優化。成年哺乳動物腦內神經發生主要集中在兩個區域：側腦室室下區（subventricular zone of the lateral ventricle，SVZ）和海馬齒狀回的顆粒下層（subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus，SGZ）。SGZ區的神經干細胞主要產生海馬齒狀回興奮性谷氨酸能神經元。SVZ區的神經干細胞產生抑制性的γ-氨基丁酸能神經元和嗅球的多巴胺能中間神經元。除了分化為不同的神經元外，這兩個區域的神經干細胞對神經營養因子、神經生理和病理刺激的反應性也不同，然而，這兩個區域神經干細胞具有不同特性的分子機制并不十分清楚。因此，比較同一個腦組織中，這兩個神經發生區域神經干細胞的特征顯得尤為重要。

近些年來，國際上相關領域的專家一直都在優化成年鼠神經干細胞的分離培養條件，但仍然存在很多的不足之處，如貼壁單層生長的細胞容易分化、所需的鼠腦數量較多等。本文將介紹一種從一只鼠腦中同時分離培養DG區和SVZ區神經干細胞的方法。

1.材料

8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠、Hank′s平衡鹽溶液（HBSS，購自Invitrogen，貨號14025-126）、Neurobasal 培養基（購自Invitrogen，貨號21103-049）、DMEM/F12培養基（購自Invitrogen，貨號11330-032）、B27添加物（購自Invitrogen，貨號17504-044），N2 添加物（購自Invitrogen，貨號17502-408，無菌分裝）、GlutaMAX（購自Invitrogen，貨號35050-038，無菌分裝）、L-谷氨酰胺（購自Invitrogen，貨號2503-081，無菌分裝）、青霉素/鏈霉素溶液（Antibiotic-Antimycotic，購自Invitrogen，貨號15240-062，無菌分裝）、堿性纖維生長因子（bFGF-2，購自PeproTech，貨號100-18B-B）、表皮生長因子（EGF，購自PeproTech，貨號100-15）、MACS神經組織分離試劑盒（購自Miltenyi Biotec，貨號130-092-628）、β-巰基乙醇（購自EM Sciences，貨號MX031OMB-1，屬劇毒品，在通風櫥中打開）、Percoll分層液（購自Amersham Biosciences，貨號17-0891-01）、10×DPBS（購自Invitrogen，貨號14200-059）、1× DPBS（購自Invitrogen，貨號14190-136）、多聚鳥氨酸（Poly-L-ornithine，購自Sigma-Aldrich，貨號P-3655）、層粘連蛋白（Laminin，購自BD Biosciences，貨號354232）、維甲酸（Retinoic acid，RA，購自Sigma-Aldrich，貨號R2625）、毛喉素（Forskolin，FSK，購自Sigma-Aldrich，貨號F6886）、二甲亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO，購自Sigma-Aldrich，貨號D2650），超純水（Mini Q）、75%酒精、4%多聚甲醛、細胞消化液（購自Accutase）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxy Uridine，Brdu）。

2.儀器

6cm和10cm直徑的細胞培養皿，離心管，1ml帶濾芯的吸頭，超低黏附6孔和24孔細胞培養板；解剖工具［眼科剪（購自Roboz，貨號RS-5840、RS-6942），眼科鑷（購自Roboz，貨號RS-5237、RS-5095）］；解剖顯微鏡；McⅡwain 組織切片機（購自The Mickle Laboratory Engineering Co.LTD，貨號10180）及刀片；MACSmix 離心管混勻器（購自Miltenyi Biotec，貨號130-090-753）；無菌試紙（購自Fisher Scientific，貨號14-959-92B）；低速離心機（購自Eppendorf，型號5702，貨號022626001）；數字相差倒置顯微鏡（購自Olympus，CK41）。

3.試劑準備

（1）堿性纖維生長因子和表皮生長因子：按照說明書將母液配制成0.1mg/ml濃度，50ml分裝后-80℃保存，使用前用Neurobasal培養基稀釋成終濃度10μg/ml，4℃保存不超過2周。

（2）溶液A：1× Hank′s平衡鹽溶液中含有30mmol/L的葡萄糖，2mmol/L的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液，26mmol/L的碳酸氫鈉，無菌過濾后4℃保存不超過4周。

（3）起始增殖培養基（initial proliferation medium，IPM）：48ml Neurobasal培養基+1ml B27添加物+0.5ml GlutaMAX+0.5ml青霉素/鏈霉素溶液（100×）+20ng/ml堿性纖維生長因子+20ng/ml表皮生長因子，4℃保存不超過2周。

（4）N2培養基：500ml DMEM/F12培養基+5ml N2添加物+5ml L-谷氨酰胺+5ml青霉素/鏈霉素溶液（100×）。使用N2培養基傳代神經干細胞以前，添加終濃度為20ng/ml堿性纖維生長因子和20ng/ml表皮生長因子，4℃保存不超過4周。

（5）β-巰基乙醇的稀釋：34.7ml β-巰基乙醇+10ml無菌雙蒸水，每次新鮮配制。

（6）消化酶混合物1：將MACS神經組織分離試劑盒中的2ml溶液2+50ml溶液1+2.5ml稀釋后的β-巰基乙醇混勻。若用兩只8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠，則溶液的量相應增加。

（7）消化酶混合物2：將MACS神經組織分離試劑盒中的溶液3+10ml 溶液4混勻。若為兩只8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠，則溶液的量相應增加。

（8）Percoll分層液：倘若分離兩只或兩只以上的8～12周雌性或雄性C57BL/6J小鼠，才需要使用Percoll分層液，22.5ml Percoll分層液+2.5ml 10×DPBS，4℃保存不超過4周。

（9）維甲酸的配制：使用二甲亞砜（DMSO）將維甲酸配制成10mmol/L的母液濃度，-20℃分裝，使用前1∶10000稀釋。

（10）毛喉素的配制：使用二甲亞砜（DMSO）將毛喉素配制成10mmol/L的母液濃度，-20℃分裝，使用前1∶10000稀釋。

（11）分化培養基：向不含生長因子的N2培養基中加入終濃度為1μmol/L維甲酸和1μmol/L毛喉素，新鮮配制；或向不含生長因子的N2培養基中加入0.5%～1.0%的胎牛血清。

（12）防凍液：含有10%二甲亞砜的N2培養基，新鮮配制。

（13）多聚鳥氨酸溶液：用無菌的MiniQ水配制成10mg/ml的母液，-20℃分裝保存，使用前用無菌的Mini Q水稀釋成10μg/ml的工作濃度，新鮮配制。

（14）層粘連蛋白溶液：用無菌的磷酸鹽緩沖溶液將其稀釋成5μg/ml的終濃度，新鮮配制。

4.操作步驟

（1）小鼠腦DG和SVZ區的顯微解剖（時間：30min）

① 用230mg/kg戊巴比妥鈉麻醉成年小鼠，深度麻醉后斷頭取腦。

② 用無菌的眼科剪和眼科鑷，依次剪開頭皮，去除頭顱骨，分離出完整的全腦，迅速將全腦移入50ml裝有20ml預冷的Hank′s平衡鹽溶液中，并置于冰上。切片前將腦移入裝有預冷20ml溶液A的10cm的培養皿中。

③ 取鼠腦以前，用75%乙醇浸泡或擦拭消毒McⅡwain組織切片機中與組織接觸的地方，并晾干。將滅菌的濾紙放在切片平臺上，將鼠腦移入濾紙上，用McⅡwain組織切片機切腦片為400μm的厚度，用無菌試紙收集含有SVZ（約6片）和海馬的腦片（約5片），移入含有5ml溶液A的6cm的培養皿中。

④ 如圖1-10所示，在解剖顯微鏡下分離SVZ區［圖1-10（a）～圖1-10（c）］和海馬的DG區［圖1-10（d）～圖1-10（f）］，將分離的區域分別移入裝有10ml溶液A的15ml的離心管中。

注意：取出鼠腦以后的過程中，盡量全程使用冰浴，以提高細胞存活率。

（2）神經干細胞的分離（時間：1～2h，室溫：20～25℃）

① 用低速離心機以200g，離心1min，第（4）步取得的腦組織。

② 在超凈工作臺內，去除上清液，每管中加入2ml的消化酶混合物1，用MACSmix離心管混勻器在室溫下旋轉20min。注意不能超過30min。

③ 每管中加30ml的消化酶混合物2，再旋轉20min。注意不能超過30min。

④ 用1ml的吸頭上下吹打10～20次，直至沒有組織團塊，加8ml N2培養基稀釋消化酶混合物，200g，離心5min，以沉淀細胞。吹打時盡量減少氣泡生成，盡量將組織塊消化成單細胞懸液，消化的時間可適當的調整。

⑤ 用10ml的N2培養基，200g，離心5min，洗滌細胞2次。

⑥ 用8ml的起始增殖培養基洗滌細胞1次。

⑦ 用1ml的起始增殖培養基重懸DG區沉淀，接種于24孔細胞培養板的1個孔中，用2ml的起始增殖培養基重懸SVZ區沉淀，接種于24孔細胞培養板的2個孔中，CO2培養箱中培養48h。

⑧ 隔天半量更換起始增殖培養基，持續培養7～14天，檢測神經球的形成情況。正常情況下1～2周形成神經球。

（3）神經干細胞的傳代

① 培養7～14天后，收集原代培養的神經球，200g，離心5min。

② 小心去除上清液，用1ml的細胞消化液重懸神經球，37℃消化10min，用1ml吸頭吹打神經球10～15次后，加8ml起始增殖培養基混勻，200g，離心5min。

③ 小心去除上清液，用1ml起始增殖培養基重懸DG區細胞，繼續接種于24孔細胞培養板的1個孔中；用2ml起始增殖培養基重懸SVZ區細胞，接種于6孔細胞培養板的1個孔中。

④ 用新鮮的起始增殖培養基隔天半量換液DG區細胞，用N2培養基隔天半量換液SVZ區細胞。第二次傳代后DG區細胞也可以使用N2培養基維持培養。第二次傳代后，細胞接種密度介于（3×104～1×105）個/ml，每2～3天傳代一次。干細胞可以在體外傳20代以上，但推薦使用2～10代的干細胞進行后續的實驗研究。

（4）神經干細胞的鑒定及增殖分析

① 神經干細胞表達Nestin蛋白，可將神經球接種于多聚賴氨酸包被的載玻片上，4%多聚甲醛固定20min、磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次后，用免疫細胞化學的方法檢測Nestin蛋白的表達情況，代表性的結果見圖1-11。

② 將單細胞懸液以2.5×104個/ml密度接種于超低黏附的細胞培養板中，完全培養基中加入2μmol/L BrdU，37℃培養24h后，免疫細胞化學方法檢測BrdU摻入陽性率，代表性的結果見圖1-11。

③ 神經干細胞的增殖分析也可直接在光鏡下拍照后，測量神經球的數量和直徑大小，代表性的結果見圖1-12。

（5）神經干細胞的分化

① 誘導分化前兩天，用工作濃度的多聚鳥氨酸包被培養板和蓋玻片，室溫孵育過夜。注意板不能風干。

② 去除鳥氨酸，用無菌MiniQ水漂洗板3次。

③ 加工作濃度的層粘連蛋白溶液，37℃孵育過夜，接種前去除多余的層粘連蛋白溶液。

④ 將消化好的神經干細胞以1×105個/ml密度接種，37℃培養過夜。

⑤ 用分化培養基半量換液細胞，每天半量更換培養基，連續4～7天。分化好的細胞可以直接裂解用于生化分析，也可用4%多聚甲醛固定后用于組化分析。神經干細胞可以分化為神經元和星形膠質細胞，通過免疫熒光檢測神經元標志物β-Ⅲ-tublin和星形膠質細胞標志物膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達情況。代表性的結果見圖1-11。

（6）神經干細胞的凍存

① 收集神經干細胞球，200g，離心5min。

② 小心去除上清液，用1～2ml的防凍液重懸沉淀細胞，并移入2ml的凍存管中。

③ 將凍存管放置于凍存盒并移入-80℃冰箱中，1～2天后，將細胞移入液氮（-180℃）中長期保持。

（7）凍存神經干細胞的復蘇

① 從液氮罐中小心取出凍存管，37℃水浴中輕輕搖動，直到防凍液完全融化。

② 將融化的細胞移入預溫的N2培養基中，200g，離心5min。

③ 小心去除上清液，用預溫的含有生長因子的N2培養基重懸細胞并接種培養。干細胞的凍存和復蘇遵循“慢凍快融”的原則。

二、新生鼠海馬神經干細胞的培養

成年鼠神經干細胞的增殖和分化能力明顯低于新生鼠，在某些實驗中需要培養海馬區的神經干細胞，因此本文也解釋新生鼠海馬神經干細胞的培養要點，新生鼠海馬神經干細胞的培養所需要的主要試劑和儀器與成年鼠神經干細胞的培養基本相同。

1.特殊試劑

木瓜蛋白酶、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）（終濃度20U/ml，購自Invitrogen）、溶解木瓜蛋白酶的平衡鹽溶液（簡稱“溶木鹽”，pH 7.2）（137mmol/L 氯化鈉+5.3mmol/L氯化鉀+1mmol/L氯化鎂+25mmol/L葡萄糖+10mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液+3mmol/L 氯化鈣）。

2.操作步驟

（1）消化液的配制：木瓜蛋白酶+脫氧核糖核酸酶Ⅰ+少許半胱氨酸+溶解木瓜蛋白酶的平衡鹽溶液，混勻后37℃，使其變澄清，使用前無菌過濾。

（2）出生當天的小鼠，用75%酒精噴試后直接斷頭取腦，將全腦移入冰冷的A溶液中，在解剖顯微鏡下分離海馬，去除腦膜。

（3）將海馬移入消化液中，37℃消化20min，每5min晃動1次。

（4）靜置沉淀后，小心棄除消化液，用10ml的N2培養基漂洗殘留的消化液2次。

（5）加入2ml的N2培養基，使用1ml帶濾芯的吸頭反復的吹打、沉淀15～20次。

（6）靜置沉淀后，小心將上清液移入另一無菌的離心管中；再次向沉淀中加入2ml的N2培養基，1ml帶濾芯的吸頭反復吹打、沉淀15～20次。重復該步驟，直至組織團塊完全消失。

（7）收集所有的上清液，200g，離心5min，棄上清液。

（8）用10ml的N2培養基漂洗細胞兩次，再用10ml的起始增殖培養基漂洗細胞1次。

（9）使用起始增殖培養基重懸神經干細胞，以每個海馬種1個6孔細胞培養板的密度接種細胞，37℃二氧化碳培養箱中培養，2～3天后第一代的神經球形成。

新生鼠海馬神經干細胞球前兩代使用起始增殖培養基培養，第三代以后可以使用N2培養基培養。

新生鼠海馬神經干細胞的傳代、分化、凍存及復蘇均與成年鼠神經干細胞相同。

三、胎鼠神經干細胞的培養

胎鼠來源的神經干細胞較新生鼠和成年鼠具有更高的增殖和分化潛能，因此很多實驗中需要培養胎鼠神經干細胞。

胎鼠神經干細胞的培養所需的試劑和步驟與新生鼠海馬神經干細胞的培養大致相同，只是取材的時間和部位不同，本文采用的是小鼠胚胎14天腦神經節的隆起處（ganglionic eminence，GE）培養胎鼠神經干細胞。GE區域的取材見圖1-13所示。

參考文獻

［1］Guo W, Patzlaff NE, Jobe EM, et al. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 2012, 7(11): 2005-2012.

［2］Chojnacki A, Weiss S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nat Protoc. 2008, 3(6): 935-940.

（張　靜）