第四節(jié)　原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細(xì)胞，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞具有支持和引導(dǎo)神經(jīng)元遷移，參與神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)和再生的作用。星形膠質(zhì)（astrocyte）細(xì)胞還具有營(yíng)養(yǎng)作用，協(xié)助神經(jīng)元的代謝；星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)血管周足和突起連接毛細(xì)血管與神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)元起到運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和排除代謝產(chǎn)物的作用。少突膠質(zhì)細(xì)胞的主要功能是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)、協(xié)助神經(jīng)電信號(hào)的跳躍式高效傳遞，維持和保護(hù)神經(jīng)元的正常功能。小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia）是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種免疫細(xì)胞，相當(dāng)于腦和脊髓中的巨噬細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的一道免疫防線。

一、星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

星狀膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)膠質(zhì)中體積最大，胞體呈星形，胞核大，呈圓形或卵圓形，染色較淺。由胞體伸出許多突起，其中有幾個(gè)較粗的突起末端膨大（稱(chēng)腳板），貼附于毛細(xì)血管壁上，或附著在腦和脊髓表面形成膠質(zhì)界膜。這種細(xì)胞在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)目多、功能多樣。其重要功能是參與神經(jīng)遞質(zhì)的代謝。此外，星狀膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中離子平衡及神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育都有重要作用。本節(jié)介紹應(yīng)用新生鼠（1～3天以內(nèi)），采用急性分離、木瓜蛋白酶消化的方法培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象

胎鼠［孕（18±2）天］、新生鼠出生0～2天。

2.實(shí)驗(yàn)材料

（1）器械：無(wú)菌培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、離心管、吸頭、手術(shù)器械一套（眼科剪、眼科鑷、顯微鑷等）。顯微鑷購(gòu)于上海金鐘，其余為常規(guī)耗材，無(wú)特別。

（2）試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基（含有L-谷氨酰胺和15mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，較高質(zhì)量）、多聚賴氨酸（Poly-D-lysine，購(gòu)自Sigma，貨號(hào)P-1274）、青霉素/鏈霉素溶液（100×，購(gòu)自Hyclone，貨號(hào)SU30010）、木瓜蛋白酶（Papain，購(gòu)自Worthington），EDTA（100mmol/L，pH=7.2）、溶解木瓜蛋白酶的平衡鹽液（137mmol/L氯化鈉，5.3mmol/L氯化鉀，1mmol/L氯化鎂，25mmol/L葡萄糖，10mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液，3mmol/L氯化鈣，pH=7.2，以上生化試劑均購(gòu)自Sigma公司）、75%酒精、4%多聚甲醛。

（3）試劑配制

① 培養(yǎng)基（500ml）：DMEM/F12培養(yǎng)液（450ml）加入胎牛血清（50ml）和青霉素/鏈霉素溶液（100×，5ml）。

② 木瓜蛋白酶溶液：以一只小鼠為例，配制1.5 ml溶解木瓜蛋白酶的平衡鹽液+25ml木瓜蛋白酶 +30ml EDTA+少量的DNAase和左旋半胱氨酸，無(wú)菌過(guò)濾后，放于4℃冰箱中備用。

3.操作步驟

（1）包被：用多聚賴氨酸（25μg/ml）鋪于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，使其完全覆蓋底面，置于培養(yǎng)箱37℃包被2h或過(guò)夜，用超純水清洗培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板3遍，置培養(yǎng)箱中待其干燥。星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)也可以不用包被。

（2）取腦：75%酒精全身消毒胎鼠或新生鼠，斷頭處死，無(wú)菌條件下分層剪開(kāi)頭皮、顱骨，用眼科鑷?yán)_(kāi)腦區(qū)視野，小心取出全腦，放于盛有冰冷溶解木瓜蛋白酶的平衡鹽液的培養(yǎng)皿中。

（3）分離海馬、皮質(zhì)：以腦中線為起點(diǎn)，小心撥開(kāi)大腦顳葉皮質(zhì)，暴露出新月?tīng)詈ｑR回，小心夾出海馬組織，分離皮質(zhì)，在顯微鏡下用顯微鑷分離腦膜、血管膜。

（4）消化和分散：將皮質(zhì)或海馬組織置于裝有木瓜蛋白酶溶液的離心管中，37℃培養(yǎng)箱消化20min，每10min晃動(dòng)1次。吸棄消化液，用含血清的培養(yǎng)基洗3遍，再加入3～4ml培養(yǎng)基吹打10～15次，靜置1min后，吸取上清液至另一干凈的離心管中，再加3～4ml培養(yǎng)基吹打、沉淀10～15次，依次吹打直至沉淀完全分散成單細(xì)胞懸液。

（5）計(jì)數(shù)和接種：混勻吹打后的上清液，取少量細(xì)胞懸液以臺(tái)酚藍(lán)染液觀察存活率并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞種入預(yù)先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中［（1～5）×106/ml，常規(guī)2對(duì)皮質(zhì)可接種1～2個(gè)75cm2的大瓶］，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃，5%二氧化碳，飽和濕度）。24h以后換液，之后每周換液2次。

星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：分散培養(yǎng)的單細(xì)胞，在接種1h后即可貼壁，細(xì)胞呈單個(gè)圓形或橢圓形。2～3天后細(xì)胞明顯增大，突起長(zhǎng)出。原代細(xì)胞培養(yǎng)10～14天后，顯微鏡下可觀察到底層多角形、扁平、多個(gè)細(xì)長(zhǎng)或粗短突起的細(xì)胞大多為星形膠質(zhì)細(xì)胞。原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞每周更換培養(yǎng)液2次，在體外可維持培養(yǎng)很長(zhǎng)時(shí)間。也可消化后接種于新的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞接種于蓋玻片中，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，胞漿著色，可見(jiàn)90%以上細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，圖1-14、圖1-15中為典型的星形膠質(zhì)細(xì)胞染色。

（葉　冰　張　靜　潘曉東）

二、新生鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)

小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具免疫學(xué)性質(zhì)的細(xì)胞種類(lèi)，數(shù)量為腦細(xì)胞總量的10%～12%。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥在阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化等神經(jīng)變性疾病中起到重要作用，然而其確切的功能仍然不清楚。

盡管已經(jīng)構(gòu)建了多種永生化的小膠質(zhì)細(xì)胞系如BV-2細(xì)胞或N9細(xì)胞，但在科學(xué)研究中，分離和培養(yǎng)新生鼠小膠質(zhì)細(xì)胞是依然是研究該細(xì)胞各種屬性的非常重要的手段。本節(jié)主要就介紹從新生1～3天的小鼠中急性分離獲得混合膠質(zhì)細(xì)胞體系，然后通過(guò)“振搖法”純化獲得小膠質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)該方法獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞純度在92%～98%。

1.操作步驟

（1）無(wú)菌條件下分離獲得新生1～3天小鼠的大腦皮質(zhì)和（或）海馬。同時(shí)進(jìn)行尾部活組織檢查以確定小鼠基因分型。

（2）木瓜蛋白酶試劑，購(gòu)自沃新頓（Worthington）公司，每瓶113～125U，加入20ml經(jīng)過(guò)濾管過(guò)濾的DM試劑。加入0.1mol氫氧化鈉至顏色變成橘紅色。

注：DM試劑的配方如下。

（3）于顯微鏡下在HBSS或者無(wú)血清DMEM中剝除腦膜并將腦組織切碎。

（4）用刀片或尖鑷將腦組織切成小塊，并且于37℃下木瓜蛋白酶溶液（每個(gè)腦組織1ml）中孵育40min。

（5）加入等量的含有10%胎牛血清和 1%青霉素/鏈霉素溶液（100U/ml 青霉素，0.1μg/ml 鏈霉素）的DMEM終止消化。

（6）400g，離心5min，棄上清液，加入含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的新鮮DMEM培養(yǎng)基。

（7）用移液管重懸組織：先用10ml的移液管吹打8～10次，然后再用1ml的小頭的移液管吹打30次。

（8）以每瓶2.5（2～3）個(gè)腦組織的密度將細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中（每只培養(yǎng)瓶規(guī)格為底面積175cm2，75T），向其中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

（9）37℃下在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3h，去除所有的培養(yǎng)基和成纖維細(xì)胞，更換新培養(yǎng)基。7天后半量換液一次，并將細(xì)胞置于混合神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天。

（10）體外培養(yǎng)14天后，室溫下以200轉(zhuǎn)/分在搖床上搖45min，將小膠質(zhì)細(xì)胞從混合培養(yǎng)細(xì)胞層里分離出。

（11）收集細(xì)胞上清細(xì)胞懸液，4℃，500g，離心8min（4℃最好，室溫也可以）。

（12）在含有5%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。

（13）用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)分離到的小膠質(zhì)細(xì)胞的總數(shù)（產(chǎn)量1），然后將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿或者進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

（14）根據(jù)研究目的接種不同密度的細(xì)胞懸液

① 如果做免疫組化，則接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中底部已包被的蓋玻片，每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，每個(gè)蓋玻片上加200ml細(xì)胞懸液。

② 如果做蛋白印跡，則向12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種（4～5）×105個(gè)細(xì)胞；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種（1～1.5）×106個(gè)細(xì)胞。

③ 如果提取RNA用，則向48孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞；12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞。

④ 如果做MTT或者熒光多孔板分析，則向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞。

（15）向混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入含有10%胎牛血清和 1%青霉素/鏈霉素溶液的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)一周，再次收集小膠質(zhì)細(xì)胞（產(chǎn)量2）。此后可以再重復(fù)一次作為產(chǎn)量3。

2.注意事項(xiàng)

（1）小鼠年齡不能超過(guò)出生5天，出生5天不容易剝除血管和腦膜，出生當(dāng)天得到的小鼠腦組織量少、產(chǎn)量低。

（2）選擇商品化的培養(yǎng)瓶或者自己用0.01g/L多聚-L-賴氨酸包被至少2h。

（3）37℃下消化組織30～50min，消化成為棉花狀或黏液狀。

（4）對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)（ICC、WB、PCR），細(xì)胞的接種密度都很關(guān)鍵。

（5）對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞維持培養(yǎng)基，血清的濃度不要太高，低血清濃度較好，3%～5%為宜，不能超過(guò)5%。許多實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)基不含血清。

（潘曉東　魏　振）

三、成年鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

雖然可以用許多不同的方法從新生鼠的大腦中分離培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，但是從成年鼠腦分離小膠質(zhì)細(xì)胞具有一定的挑戰(zhàn)性，其往往產(chǎn)量低、分離困難。本文介紹一種從成年鼠大腦分離小膠質(zhì)細(xì)胞的優(yōu)化的方案。該方案先進(jìn)行機(jī)械分離，然后在含有中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和脫氧核糖核酸酶Ⅰ中的培養(yǎng)基中進(jìn)行酶解分離。通過(guò)不同密度梯度的細(xì)胞分離液（Percoll分層液）實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離。使用該方法分離的小膠質(zhì)細(xì)胞可以培養(yǎng)后用于細(xì)胞功能測(cè)定，包括小膠質(zhì)細(xì)胞分泌因子、趨化以及吞噬功能的檢測(cè)，也用于細(xì)胞免疫組化、免疫熒光檢測(cè)，以及流式細(xì)胞儀分析、分離RNA用于實(shí)時(shí)PCR或微陣列測(cè)定基因表達(dá)（基因芯片）、抽提蛋白質(zhì)并通過(guò)蛋白印記檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。

1.背景知識(shí)

小膠質(zhì)細(xì)胞起源于骨髓單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，發(fā)育過(guò)程中遷徙至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的巨噬細(xì)胞，在大腦免疫監(jiān)視、環(huán)境應(yīng)激和免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理或病理事件可以通過(guò)募集周?chē)h(huán)中的巨噬細(xì)胞刺激祖細(xì)胞分化遷徙或局部駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖分化誘導(dǎo)大量的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，并同時(shí)導(dǎo)致血腦屏障的通透性增加。急性的小膠質(zhì)細(xì)胞活化誘導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌，如神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族配體（GFLs），這類(lèi)因子通過(guò)保護(hù)受損傷的神經(jīng)元、協(xié)助修復(fù)減輕組織損傷。然而，異?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的前列腺素、趨化因子、細(xì)胞因子和活性氧（ROS）和活性氮（RNS），包括一氧化氮（NO），通過(guò)增強(qiáng)氧化應(yīng)激并激活細(xì)胞凋亡途徑而對(duì)神經(jīng)元存活產(chǎn)生有害的影響。如果小膠質(zhì)細(xì)胞活化長(zhǎng)期持續(xù)繼發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，將導(dǎo)致組織損傷。

本方案介紹一種從成年鼠大腦完整分離小膠質(zhì)細(xì)胞的方法（對(duì)原有的培養(yǎng)方法進(jìn)行改良）。使用這種方法分離的小膠質(zhì)細(xì)胞，適用于在體外研究小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性活性兩者間的調(diào)節(jié)平衡機(jī)制。

2.材料

用冷磷酸鹽緩沖溶液灌注的成年鼠大腦（＞8周）：50ml灌注、Hank′s平衡鹽溶液（不含鈣和鎂）、Hank′s液體（10×Hank′s平衡鹽溶液）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）（終濃度20U/ml，購(gòu)自Invitrogen）、中性蛋白酶Ⅱ（Dispase Ⅱ，終濃度1.2U/ml，購(gòu)自Roche）、木瓜蛋白酶（1mg/ml，購(gòu)自Sigma-Aldrich，或125U/vial，購(gòu)自Worthington）、青霉素/鏈霉素溶液（100×，組織培養(yǎng)級(jí)）、Percoll分層液。

3.培養(yǎng)基和溶液

（1）培養(yǎng)基（50ml）：49.5ml Hank′s平衡鹽溶液+0.5ml青霉素/鏈霉素溶液（100×）（使用前或者混合后無(wú)菌過(guò)濾）。

（2）葡萄糖：準(zhǔn)備含葡萄糖0.45g/ml磷酸鹽緩沖溶液（100×），取450ml加入50ml磷酸鹽緩沖溶液中使終濃度4500mg/L。

（3）無(wú)血清培養(yǎng)基（50ml）：49ml DMEM/F12培養(yǎng)基+0.5ml青霉素/鏈霉素溶液（100×）+0.5ml葡萄糖（100×）。

（4）中和培養(yǎng)基（50ml）：44ml DMEM/F12培養(yǎng)基+0.5ml青霉素/鏈霉素溶液（100×）+0.5ml葡萄糖（100×）+ 5ml加熱滅活的胎牛血清。

（5）培養(yǎng)基（50ml）：44.5ml DMEM/F12培養(yǎng)基+0.5ml青霉素/鏈霉素溶液（100×）+ 5ml加熱滅活的胎牛血清。

（6）中性蛋白酶Ⅱ：將凍干的酶溶解于羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液（50mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液/氫氧化鉀pH 7.4，150mmol/L氯化鈉）（10mg/ml）使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到2.4U/ml。不推薦高于2.4U/ml的工作濃度。0.22μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。

注：（1）～（6）中所有的培養(yǎng)基和溶液在使用前或混合后需無(wú)菌過(guò)濾。

（7）分離培養(yǎng)基：脫氧核糖核酸酶、中性蛋白酶（DDP）試劑備用。（①0.028g木瓜蛋白酶，終濃度1mg/ml；②14ml DMEM/F12培養(yǎng)基；③14ml預(yù)制的中性蛋白酶，終濃度1.2U/ml）保存于-20℃。使用前立刻加入脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）溶液（終濃度20U/ml）。

（8）準(zhǔn)備細(xì)胞分離液 SIP，90% Percoll分層液，即9份細(xì)胞分離液和1份10× HBSS，如1ml 10×HBSS+9ml Percoll分層液，不同濃度梯度的分離液的配方見(jiàn)表1-1。

4.操作步驟

（1）新鮮灌注的成年鼠腦放入裝有2ml無(wú)血清培養(yǎng)基的35mm×10mm培養(yǎng)皿中。然后用15T#手術(shù)刀片盡可能精細(xì)地切碎。

（2）將切碎的組織移入裝有3ml分離培養(yǎng)基的15ml試管中。

（3）在組織培養(yǎng)箱輕輕搖晃細(xì)胞懸液20min，或者每隔5min顛倒1次試管。

（4）往分離培養(yǎng)基中加入5ml中和培養(yǎng)基，以中和其中的酶。

（5）在室溫下，250g，離心5min。

（6）緩慢取出培養(yǎng)基（要非常小心，以免弄渾沉淀物，因?yàn)槌恋砦锖苋菀妆晃胍埔汗埽?/p>

（7）把沉淀物置于5ml無(wú)血清的培養(yǎng)基中。重復(fù)步驟（5）和（6）。

（8）加入3ml DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，用拋光大號(hào)帶孔的巴斯德移液管上下吹打混勻，直到大塊組織都溶解。靜置1min，待大塊組織沉淀。把上層清液（含有游離細(xì)胞）移入新的15ml錐形試管內(nèi)，并將它保存在冰箱里。

（9）加入3ml DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，用拋光的巴斯德移液管（中號(hào)帶孔）上下吹打，混勻，直到大塊組織都溶解。靜置1～2min直到大塊組織沉淀下來(lái)。把上層清液倒入事先裝有細(xì)胞懸液的收集管，保存在冰箱里。

（10）加入2ml DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，用拋光的巴斯德移液管（小號(hào)帶孔）吹打，混勻組織。靜置1min，直到大塊組織沉淀。

（11）將上層清液（含有游離細(xì)胞）跟事先準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液混勻。

（12）用2ml DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液潤(rùn)濕70μm細(xì)胞過(guò)濾器，然后用細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞懸液。

（13）250g，離心4min。

（14）將細(xì)胞置于5ml DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中，250g，離心4min，去除上層清液。

（15）再將細(xì)胞團(tuán)置于37% Percoll分層液。

（16）將4ml 37%SIP［從第（4）步開(kāi)始］加入15ml錐形試管并緩慢地將4ml 70%細(xì)胞分離液襯于下層［見(jiàn)注釋?zhuān)?）］，然后緩慢地用移液管將4ml 30%細(xì)胞分離液加在37%液的上面，再將2ml HBSS加在它上面。

（17）用梯度離心機(jī)300g不間斷離心40min（18℃）。確保離心機(jī)工作不會(huì)中斷，這樣細(xì)胞間的界面才不會(huì)被打亂。

（18）用移液管緩慢地移除細(xì)胞碎片，收集2.0～2.5ml的70%Percoll分層液至37%Percoll分層液的中間相細(xì)胞并置于干凈的15ml錐形試管中。

（19）每2ml的中間相細(xì)胞加入6ml HBSS，這樣可以確保含中間相細(xì)胞的細(xì)胞分離液被稀釋3倍。

（20）4℃，500g，離心7min。

（21）將細(xì)胞團(tuán)重新溶解于500ml HBSS，移至小的0.6ml或者1.5ml EA管中，用500ml的液體在微型離心機(jī)上4℃，800g，離心清洗3遍。

（22）用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞種植在培養(yǎng)基上，便于免疫細(xì)胞分析和功能分析［見(jiàn)注釋?zhuān)?）～（4）］。

成年鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞分離梯度設(shè)置原理見(jiàn)圖1-16。

（潘曉東）