第二節　新生小鼠中腦多巴胺能神經元培養

中腦或腹側被蓋區多巴胺能神經元的培養用于研究多巴胺能神經元的發育和功能，也用于研究不同的多巴胺能的調節機制。本節主要介紹在單層星形膠質細胞表面培養新生鼠多巴胺能神經元的方法。星形膠質細胞的存在能夠為多巴胺能神經元的生長提供與在體類似的環境，對于多巴胺能神經元各種特性的產生很關鍵。本節介紹兩種新生鼠中腦多巴胺能神經元的培養方法。一種是基本方法，包括三個關鍵步驟：①包被玻片；②原代單層星形膠質細胞的培養；③原代中腦多巴胺能神經元的培養。這種方法建立起多巴胺能神經元與中腦內的其他類型神經元相互聯系的神經元網絡。該方法適用于多巴胺能神經元功能與機制的生理、藥理、生化和分子等層面的研究。另外一種方法是準備一個微細胞培養環境，這種方法適用于研究單個或幾個多巴胺能神經元，它們之間形成突觸聯系，研究人員可以分析各種突觸結構與物質運輸機制。

一、單層皮質星形膠質細胞表面培養新生鼠中腦多巴胺能神經元

選取出生后0～3天的小鼠進行星形膠質細胞的培養，將小鼠麻醉后剝離頭皮和背側顱骨，獲得腦組織，分離獲得前腦。酶消化、機械分離組織、懸浮細胞，涂片之后在培養皿中孵育24h。然后用預冷的液體振搖，去除其余類型的神經元和小膠質細胞。細胞之間一旦接觸生長，則收集星形膠質細胞，接種在事先用膠原-多聚賴氨酸包被的玻片上，并等待星形膠質細胞在玻片上聚集接觸。第二步是培養多巴胺能神經元，選取出生后0～2天的小鼠，按照如上星形膠質細胞的方法獲得小鼠腦，切取部分中腦和黑質與腹側被蓋區腦組織。酶消化之后、機械分離組織、收集細胞，重懸，以合適的濃度種植。

第二天，向培養基中加入有絲分裂抑制劑阿糖胞苷（Ara-C），抑制星形膠質細胞和小膠質細胞增殖。

整個過程在培養箱（37℃，5%CO2）中進行。具體操作見圖1-2。

（一）材料準備

（1）試劑：12mol/L的濃鹽酸；無菌過濾水；95%和70%的乙醇；膠原溶液1；多聚賴氨酸溶液；MEM培養基（Invitrogen）；分離溶液；木瓜蛋白酶；有絲分裂抑制劑阿糖胞苷；EDTA（Invitrogen）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；0.5%胰蛋白酶；0.4%臺酚藍；條件培養基；氟尿苷；犬尿喹啉酸；75%酒精。

（2）器材：直徑1.5cm的玻片；分離器械（Fine Science Tools）：眼科剪（2把）、眼科鑷（2把）、7號彎鑷1對、7號和5號彎鉗、刀片、酒精燈；90mm孔徑的濾紙（紫外燈消毒）；0.2μm孔徑的注射器過濾器；紫外線燈；100mm×15mm和35mm×10mm培養皿；10ml注射器；高壓滅菌鍋；5ml和10ml移液管；鋁箔紙；倒置顯微鏡；3個25cm2的培養瓶；175cm2培養瓶；可放入15ml離心管的離心機；血細胞計數器，電烙鐵。

（二）操作步驟

1.包被玻片

（1）將玻片放入12mol/L濃鹽酸浸泡24h。

（2）用無菌過濾水沖洗3遍，之后在無菌水中浸泡1h。

（3）95%乙醇洗3遍，最后浸泡到乙醇中至使用前取出（玻片置于盛有95%乙醇的密閉容器中可放置幾周，如果發現液體變黃，則要將玻片丟棄）。

（4）用7號彎鉗將玻片逐一從95%乙醇中取出，放到新鮮的95%乙醇中浸泡后用酒精燈烤干。

（5）小心地將玻片放到100mm×15mm無菌培養皿中用紫外燈消毒過的無菌濾紙上（注意觀察玻片是否透明，如果不透明則丟棄，否則細胞不易爬片）。

（6）用10ml注射器吸一滴新鮮的膠原溶液1，通過0.2μm孔徑的過濾器滴到每一個玻片上，用7號彎鉗夾住吸頭將其鋪勻，直至晾干。

（7）按照滴加膠原溶液1的方法將65ml多聚賴氨酸溶液滴加到玻片上，放入密閉的玻璃皿中1h（注意此過程中多聚賴氨酸不能晾干）。

（8）將玻片依次放入3個盛有無菌細胞培養水的燒杯中，然后將它們分別放到用紫外燈消毒過的無菌濾紙上，向每張玻片上滴加65ml無菌水，蓋好培養皿，靜置1h，同樣方法重復一次，吸干玻片上多余的無菌過濾水至玻片完全晾干。

（9）每個35mm×10mm的培養皿中放入兩個玻片并用電烙鐵在培養皿上畫一條中線以免兩張玻片重疊（圖1-3）。

注意：（7）～（9）要在一天內完成，包被的玻片要在一周內使用完。

（10）在接種星形膠質細胞之前，提前至少3h在玻片上滴加100ml MEM培養基。

2.培養單層星形膠質細胞

（1）器械和操作臺的準備

① 用高壓滅菌鍋滅菌器械或用70%乙醇浸泡之后烘干備用。

② 向35mm×10mm的培養皿中加入2ml分離溶液，并置于冰上備用。

③ 準備抑制劑和5ml木瓜蛋白酶。

④ 將2根5ml的玻璃吸管放到酒精燈上燒至其口徑分別變小為1.5mm和0.5mm。

（2）分離組織

① 將新生鼠放到碎冰上的鋁箔紙上麻醉，一旦小鼠停止活動，用70%乙醇消毒其頭顱，然后用吸水紙吸干；如圖1-4所示，用眼科剪從頸部開始，以圓形走形剪開頭皮和背側顱骨；用7號彎鑷去除皮膚和顱骨，暴露腦，用2ml分離溶液沖洗腦組織，用燒至彎曲的玻璃吸管將腦組織輕輕拉出，放入盛有預冷的分離溶液的培養皿中。

② 將腦組織放到倒置顯微鏡下，背側向上，用5號彎鉗夾住腦，用刀片切下前腦。

③ 小心分離出中腦，將腦膜連同所有血管剝下。

④ 將前腦切成許多組織塊，以便均勻消化。用10ml的無菌玻璃吸管將組織塊轉移到盛有事先激活的木瓜蛋白酶的15ml離心管中，將其放到可以入水的磁力攪拌器上于37℃溫水中水浴50min（攪拌過程可以借助向燒杯中加入幾個磁力轉子來加大攪拌力量）。注意在轉移組織塊時盡量少的吸取分離溶液，以免其將木瓜蛋白酶稀釋。

（3）分離星形膠質細胞

① 使組織塊自然下沉，將木瓜蛋白酶小心吸出，用2.5ml的抑制劑沖洗組織塊2次。

② 用2ml的MEM培養基沖洗組織塊2次，之后向離心管中加入1ml MEM培養基，用1.5mm口徑的5ml玻璃移液管反復吹打組織塊20次，之后換用0.5mm口徑的5ml玻璃移液管吹打40次，若發現仍有組織塊未完全消化，則分離細胞懸液和沉淀，將懸液吸取到另一個15ml的離心管放到培養箱保存，向剩余沉淀中加入1ml MEM培養基再次像之前一樣吹打，至均勻將其與細胞懸浮液混勻。

③ 向上述的細胞懸浮液中加入MEM培養基至體積為25ml，吸取15ml平均分到3個25cm2的培養瓶中，剩余10ml加入到175cm2的培養瓶中過夜。前三者用于提供中腦多巴胺能神經元生長所需的星形膠質細胞單層，后者用于形成MEM條件培養基。

（4）預冷

① 細胞分離后的第二天，將培養瓶中的培養基吸出，25cm2和175cm2的培養瓶分別加入2ml和10ml１×MEM培養基洗2次，左后分別加入5ml和100ml MEM培養基即可。

② 之后將培養瓶放入細胞培養箱中至細胞接觸生長，這個過程一般需要7天，然后將星形膠質細胞轉移到玻片上。

③ 準備胰蛋白酶：向25cm2的培養瓶中加入7ml預熱的EDTA溶液和2ml磷酸鹽緩沖液。

④ 酒精燈上燒5ml的玻璃吸管至其口徑減少至0.5mm。

⑤ 準備0.5%的胰蛋白酶。

⑥ 吸出每個培養瓶中的培養基棄去，分別加入2ml EDTA溶液，輕輕吹打十余次。然后棄去EDTA，再分別加入2ml的EDTA。此步是為了去除血清蛋白，以免其干擾胰蛋白酶對星形膠質細胞的分離，根據經驗，在用胰蛋白酶消化之前，用EDTA處理比用磷酸鹽緩沖液處理更能增加其消化效果。

⑦ 棄去EDTA溶液，向每個25cm2的培養瓶中加入2ml提前激活的0.5%的胰蛋白酶，孵育5min后觀察細胞是否分離；若沒有分離則繼續孵育至分離。

⑧ 向每個培養瓶中加入2ml的EDTA溶液將胰蛋白酶稀釋，然后用0.5mm口徑的10ml玻璃管輕輕吹打十余次。

⑨ 將細胞懸液轉移到15ml的離心管中，向培養瓶中加入1ml EDTA覆蓋剩余的細胞，然后將其轉移到15ml的離心管中。

⑩ 三步離心法：室溫下以200g離心2min，300g離心2.5min，900g離心30s。此三步的目的是將離心時間和機械損傷降到最小，同時有效分離出上清液以及細胞碎片。因此，前兩步離心是將細胞碎片分離出，最后一步是將其沉淀，分離出上清液。

? 棄去上清液，向每個離心管中加入1ml MEM培養基，用0.5mm口徑的5ml玻璃移液管輕輕吹打二十余次。

? 用血細胞計數器和臺盼藍計數細胞。

? 將細胞懸液稀釋到需要的濃度：1×105cells/ml。

? 向每個事先包被過的玻片上涂布130ml的細胞懸液，孵育3h；這3h的孵育是為保證在將玻片轉移到含有2.5 ml培養基的培養皿之前，使細胞附著玻片的同時還防止其干燥。

? 向培養皿中加入含MEM培養基和MEM條件培養基各一半的溶液共2.5ml，繼續孵育，注意此步要小心操作，以防止貼壁的細胞分離。

? 細胞成功貼壁并且接觸生長之后，向培養皿中加入12.5ml的氟尿苷。氟尿苷是一種抗腫瘤藥，它的作用是延緩膠質細胞增殖，以便其形成單層，使神經元細胞附著。此步驟是否需要進行取決于新生小鼠的出生日期，氟尿苷加入之后可以使膠質細胞在幾天內保持單層，如果神經元細胞恰好也培養好，則不需要此步便可直接涂片在星形膠質細胞單層上。

3.在星形膠質細胞單層培養中腦多巴胺能神經元

（1）器械與超凈臺準備

① 分離器械在高壓滅菌鍋滅菌或用70%的乙醇浸泡后烘干。

② 酒精燈上將2根5ml的玻璃吸管燒至口徑分別為2mm和0.5mm。

③ 向35mm×10mm培養皿中分別加入2ml分離溶液，每個培養皿中加入兩個腦組織，并置于冰上操作。

④ 用10ml注射器吸滿分離溶液備用，每個腦組織5ml。

⑤ 準備離心用溶液（5ml/5個腦組織），研磨液（10ml/5個腦組織）和MEM培養基（2.5ml/2個玻片）。

⑥ 每5個腦組織準備5ml激活的木瓜蛋白酶溶液。

（2）解剖分離

① 取出生后0～2天的新生鼠按照培養單層星形膠質細胞的分離組織的方法①分離腦組織。

② 將腦組織腹側面向上置于倒置顯微鏡下（圖1-5），頭端以中腦皺褶為參照，尾端以Willis環為參照，在冠狀面切下大約1mm厚的薄片（圖1-6），大體位置如圖1-7所示。

③ 用刀片切下腹側被蓋區和黑質部分。

④ 將腦組織塊收集到預冷的分離溶液中，按此操作準備5個腦組織。

⑤ 用10ml的玻璃吸管將腦組織塊轉移到盛有提前激活的木瓜蛋白酶的15ml離心管中，將離心管放到37℃水浴鍋中攪拌水浴。確保在轉移組織塊的過程中，盡量少的吸取分離溶液，以免將木瓜蛋白酶稀釋。

注意：細胞的存活率與操作速度是相關的，建議兩個人一起操作，一人負責取腦組織，另一個負責分離中腦。

（3）分離細胞

① 使組織塊自然下沉，小心吸出木瓜蛋白酶，用室溫下的分離溶液沖洗組織塊兩次。

② 再用2ml的研磨溶液沖洗組織塊2次，之后向離心管中加入1ml研磨溶液，用1.5mm口徑的5ml玻璃吸管研磨組織塊20次之后換用0.5mm口徑的5ml玻璃吸管研磨40次。若發現仍有組織塊未完全消化，則參照培養單層星形膠質細胞的分離組織的方法②，只是將MEM培養基換成研磨溶液。

③ 將含有5個經酶消化過的腦組織的細胞懸液小心地滴加到5ml的離心溶液中，確保每根管的體積相同。然后以下面轉速離心：室溫下200g，離心2min，300g，離心3min。本操作的目的同前。

④ 棄去上清液，每根管加入500ml研磨溶液，重懸細胞。

⑤ 用血細胞計數器和臺酚藍計數細胞。

⑥ 稀釋細胞懸液到所需要的濃度：一般是（1～3）×105cells/ml。

⑦ 用7號彎鉗將培養有單層星形膠質細胞的玻片從培養皿中夾出，放在用紫外燈消毒過的濾紙上將底面液體吸干，然后將其放到紫外燈消毒過的新的10mm×35mm的培養皿中，用如前所述的方法在培養皿中央用電烙鐵畫一條線，將兩個玻片分隔開，最后向每個玻片上滴加65ml的中腦多巴胺能神經元細胞懸液，培養箱中孵育3h。為防止已經貼壁的單層星形膠質細胞干燥，此步要兩個人來完成，一次性擺好5個培養皿，不時地用移液管吹打剩余的細胞懸液而防止其形成沉淀。

⑧ 孵育完成之后，向每個培養皿中加入2.5ml的Neurobasal-A+/MEM+培養基過夜，注意此步小心操作，以免將細胞分離。

⑨ 之后向每個培養皿中加入12.5ml氟尿苷，以減慢膠質細胞進一步增殖，由于此時的細胞懸液中包括膠質細胞和神經元兩種，所以加入氟尿苷防止其增殖是很有必要的。

⑩ 接種上神經元后的第7天，向培養皿中加入10ml犬尿喹啉酸，防止其與谷氨酸受體結合以及興奮性谷氨酸中毒，然后加入500ml Neurobasal-A+/MEM+培養基，防止蒸發，繼續孵育。

? 之后每周都要向培養皿中加入500ml Neurobasal-A+/MEM+，以防止液體蒸發。此培養持續60天，細胞貼壁期間都可以通過免疫細胞化學法檢測酪氨酸羥化酶的濃度以測定多巴胺能神經元的比例（圖1-8）。正常情況下，應該保持在20%～25%。

二、單層星形膠質細胞表面培養新生鼠中腦多巴胺能神經元及形成神經突觸

該方法是在小部分星形膠質細胞表面培養多巴胺神經元?？傮w方法是在玻片上噴灑膠原基質，形成星形膠質細胞可以附著的微滴。這樣多巴胺能神經元就可以附著在星形膠質細胞上生長。在這種模型中，孤立的神經元可以與其細胞體和樹突形成突觸聯系，稱為“自身突觸”。這種模型可以用來進行突觸結構與功能的定量研究。

（一）補充材料（與單層皮質星形膠質細胞表面培養新生鼠中腦多巴胺能神經元相比需要的材料）

多聚鳥氨酸溶液，0.15%瓊脂糖溶液，膠原溶液2，薄層色譜試劑噴霧器（Kimble/Kontes）。

（二）操作步驟

⒈包被玻片

（1）同單層皮質星形膠質細胞表面培養新生鼠中腦多巴胺能神經元包被玻片的（1）～（5）。

（2）把100ml新鮮配制的多聚鳥氨酸溶液滴加在每個玻片上，用7號彎鉗夾住移液管，利用其末端將溶液展開使其覆蓋在玻片的整個表面。在37℃下培養24h。

（3）吸出多聚鳥氨酸溶液，代之為100ml水，室溫下放置5min。重復清洗，在開始下一步之前，將其放到用紫外燈消毒過的濾紙上靜置24h。

（4）用巴斯德移液管把加熱過的0.15%瓊脂糖溶液滴加到玻片上，一次5張玻片。吸出多余的0.15%瓊脂糖溶液，僅僅只留下薄薄的一層。在開始下一步之前晾干24h。

注意：0.15%瓊脂糖溶液在使用之前，為了減少它的黏度必須加熱，這樣才能更容易地鋪成薄薄的一層。當0.15%瓊脂糖溶液開始變得越來越黏稠的時候，有必要對其進行重復加熱。

（5）在接種星形膠質細胞的前一天，要用膠原溶液2處理玻片；將薄層色譜試劑噴霧器的氣壓設置為45psi。盛有玻片的培養皿放在噴霧器的50cm以外、比它低20cm以下的位置。最后，膠原溶液2垂直地落在玻片上形成小圓點。見圖1-9。

（6）紫外燈照射玻片消毒30min并干燥。每一個紫外燈消毒過的35mm×10mm的培養皿中放置兩個玻片，然后將100ml MEM培養基滴加在玻片上。

2.玻片上培養少量星形膠質細胞

（1）重復單層皮質星形膠質細胞表面培養新生鼠中多巴胺能神經元的培養單層星形膠質細胞（1）的①至（4）的?。

（2）稀釋細胞懸液到需要的濃度（6×104cells/ml）。

星形膠質細胞的量至關重要，但無需過多，形成平滑稀薄的一層即可，這對細胞成像等技術很重要。

（3）重復單層皮質星形膠質細胞表面培養新生鼠中多巴胺能神經元的培養單層星形膠質細胞（4）的?和?。

（4）一旦神經膠質細胞延伸覆蓋在整個玻片表面后，一般是在涂片后一天，立即添加12.5ml氟尿苷溶液。

3.星形膠質細胞表面培養新生鼠中腦多巴胺神經元

（1）重復單層皮質星形膠質細胞表面培養新生鼠中多巴胺能神經元的在星形膠質細胞單層中培養腦多巴胺能神經元（1）的①至（3）的⑤。

（2）稀釋細胞懸液到所需的濃度（80000cells/ml）。

（3）重復單層皮質星形膠質細胞表面培養新生鼠中多巴胺能神經元的在星形膠質細胞單層中培養腦多巴胺能神經元（3）的⑦至（3）的?。

這種培養可以保持15天以上。

三、本節實驗中使用到的試劑和溶液

（1）0.15%瓊脂糖溶液［20ml水、30mg瓊脂糖（購自Sigma）］：在微波爐上加熱至出現沸騰的氣泡，然后攪拌至瓊脂糖粉溶解。

（2）多聚-L-賴氨酸硼酸鹽溶液［50ml水、155mg硼酸（購自Sigma）、238mg硼砂（四硼酸鈉+水合物）（購自Sigma）］：用1mol/L的鹽酸調整pH值為8.5，使用0.2μm過濾器過濾，4℃下保存3周。

（3）多聚-L-鳥氨酸硼酸鹽溶液［50ml水、2.38g硼酸（購自Sigma）、1.27g四硼酸鈉水合物（購自Sigma）］：使用0.2μm過濾器過濾，4℃下保存3周。

（4）離心分離溶液［5ml Neurobasal-A+、50mg胰蛋白酶抑制劑、50mg 98%的牛血清白蛋白、11.9mg羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液，最低濃度99.5%］：用1mol/L的氫氧化鈉調整pH為7.4，使用0.2μm 過濾器過濾，置于二氧化碳保溫箱加熱到37℃，現用現配。

（5）膠原溶液1［7.25ml水、250ml PureCol（3.0mg/ml；購自Inamed Biomaterials）］：現用現配，可用于包被方法1中的至少100張玻片。

（6）膠原蛋白溶液2［3ml 125mmol/L醋酸、1ml PureCol（3.0mg/ml；購自Inamed Biomaterials）］ ：現用現配，可用于包被方法2中的至少100張玻片。

（7）MEM+條件培養基（MEM條件培養基和10% 胎牛血清培養基）：按照方法2中的步驟在175cm2的燒瓶中接種星形膠質細胞。則條件培養基在合適的條件下經14天將逐漸形成。

（8）D-葡萄糖MEM培養基［50ml最基本的培養基、18.02g D-葡萄糖（購自Sigma）］：使用0.2μm過濾器過濾，37℃下保存3個月。

（9）分離介質（6.39g硫酸鈉、2.62g硫酸鉀、590mg氯化鎂六水合物、18.4mg氯化鈣二水合物、1.19g羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、1.80g D-葡萄糖）：

① 加水至總體積為500ml，在磷酸鹽緩沖液中加入0.5%的酚紅溶液。

② 用1mol/L 氫氧化鈉調整pH為7.4，使用0.2μm過濾器過濾，4℃下保存1個月。

硫酸鈉、硫酸鉀、氯化鎂、氯化鈣、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、D-葡萄糖、酚紅均購自Sigma公司。

（10）氟尿苷溶液（203ml基本培養基、100mg 5-氟-2脫氧尿苷、198mg尿苷）：使用0.2μm過濾器過濾。分裝成每管1ml可在-20℃下儲存一年。

（11）抑制劑（5ml MEM+培養基、12.5mg胰蛋白酶抑制劑、12.5mg 98%的牛血清白蛋白、23.8mg 最低濃度99.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液）：用1mol/L氫氧化鈉調整pH值為7.4，用0.2μm過濾器過濾，把溶液放置在二氧化碳保溫箱中加熱到37℃，現用現配。

（12）125mmol/L犬尿喹啉酸（10ml水、236.5mg犬尿喹啉酸）：加入5mol/L氫氧化鈉直到粉末溶解。使用0.2μm過濾器過濾。分裝成200ml 每管-20℃儲存一年。

（13）MEM+培養基（MEM/10% 胎牛血清介質）［85.7ml基本培養基、1ml D-葡萄糖MEM、1ml青霉素/鏈霉素（購自Invitrogen）、1ml GlutaMAX（購自Invitrogen）、1ml 100mmol/L的丙酮酸鈉、100ml MITO+］：在 DPBS中加入200ml 0.5%的酚紅溶液。使用0.2μm過濾器過濾。10ml胎牛血清。37℃下保存一周。

（14）MITO+［5ml水、1瓶MITO+血清添加物配成5L的培養基（購自BD Biosciences）］：分裝成100ml每管，-20℃下儲存一年。

（15）Neurobasal-A+培養基（Neurobasal-A和10% 胎牛血清）［86ml Neurobasal-A培養基 1×（無L-谷氨酰胺）、1ml青霉素-鏈霉素、1ml GlutaMAX、2ml B27補充物、10ml胎牛血清］：使用0.2μm過濾器過濾，37℃下保存一周。

（16）Neurobasal-A+/MEM+培養基（66ml Neurobasal-A+、33ml MEM+條件培養基）：37℃下保存一周。

（17）木瓜蛋白酶溶液［5ml分離溶液、2.25mg L-半胱氨酸鹽酸鹽化合物（購自Sigma）］：用1mol/L氫氧化鈉調整pH值為7.4。100U木瓜蛋白酶（購自Worthington）。不晃動使其在37℃下活化15min，然后連接到直徑26mm注射器上的0.2μm SFC過濾器過濾并在37℃下最多儲存30min，現用現配。

（18）多聚-L-賴氨酸（5ml硼酸緩沖聚-L-賴氨酸、5mg多聚左旋賴氨酸）：分裝成每管200ml。在-20℃下儲存兩年。

（19）多聚賴氨酸溶液（1.8ml硼酸緩沖聚-L-賴氨酸、200ml L-半胱氨酸鹽酸鹽等分）：現用現配。

（20）多聚-L-鳥氨酸（2.5ml水、25mg多聚-L-鳥氨酸）：分成每管30ml。在-20℃下儲存兩年。

（21）多聚-L-鳥氨酸溶液（用75蓋玻片）（6.72ml水、750ml多聚-L-鳥氨酸硼酸鹽溶液、30ml多聚-L-鳥氨酸）：現用現配。

（22）研磨溶液（20ml Neurobasal-A+、20mg胰蛋白酶抑制劑、20mg 98%的牛血清白蛋白、47.6mg最低濃度99.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液）：用1mol/L氫氧化鈉調整pH值為7.4，使用0.2μm 過濾器過濾。把溶液放置在二氧化碳保溫箱中加熱到37℃，現用現配。

（23）0.5%胰蛋白酶溶液［10ml 37℃的磷酸鹽緩沖溶液、5mg胰蛋白酶（1∶250，購自Invitrogen）］：使用0.2μm 過濾器過濾并在37℃下放置5min，現用現配。

四、注意事項

（1）盡快地進行解剖和活體組織的分離?？焖俳馄屎吞幚斫M織將確保游離神經元的高存活率，并產生高比例的存活多巴胺神經元。因此，以兩人為一組的形式有利于執行所有關鍵步驟。

（2）動物的年齡。雖然出生后0～3天的小鼠均可使用，但是為了獲得更高比例的多巴胺能神經元和一個更長的生存期，使用出生后0～1天的更優。另外，為獲得高比例的多巴胺能神經元（50%以上），準備一個稍微更薄和最佳區域的中腦切片。

（3）培養基中所用的血清。大量的劣質血清可降低出生后小鼠多巴胺神經元的存活率。當預備進行出生后小鼠的多巴胺神經元的培養時，有一個好辦法是先測試多個血清，并選擇其能達到多巴胺能神經元最長存活期的血清。

五、常見問題及解決方案

最常見的問題是多巴胺能神經元的存活率低。使用本節中描述的基本數據，一般可獲得25%～ 30%的多巴胺神經元。如果所得比例遠遠低于此值，則操作過程值得探究。

這通常有以下四個可能的原因：

（1）解剖分離時間過長。

解決方法：兩人一起操作共同獲得部分腦組織。

（2）轉移神經元懸浮液到星形膠質細胞玻片上的使用過長時間。

解決辦法：如上所述，團隊合作。此外，每次準備少量的載玻片。

（3）過高或低的細胞密度。平鋪星形膠質細胞時密度過高或過低都會導致神經元的生存率無法達到理想結果。

解決辦法：嚴格遵守本報告中的建議。

（4）實驗動物月齡過大。使用月齡過大的動物進行實驗時，盡管可以優化酶消化法和機械分離法的條件，但目前的實驗表明，出生0～2天的大鼠或小鼠幼崽是最為適合使用的動物年齡。使用月齡較大幼崽將會導致多巴胺神經元的生存率降低。

除此之外，多巴胺能神經元的比例過低也可能因為解剖分離腦組織時并沒有正確分離出中腦。

六、預期結果

通過方法1每個玻片有200～500個多巴胺神經元。其中較成熟的神經元之間能夠形成一個復雜的軸突和樹突網絡。方法2會產生單個多巴胺神經元或一小部分神經元。每個玻片上有10～20個多巴胺神經元。

七、時間因素

經過24h的濃鹽酸浸泡，酒精燈烘烤和包被后，玻片可以使用 6～10h，具體取決于準備了多少。對于微量細胞培養的玻片，需要額外的48h來進行孵育和干燥。然后，麻醉動物、分離皮質、分離細胞、將星形膠質細胞接種至燒瓶中需要2h。星形膠質細胞經過 1 周孵育后，需要4～6h準備玻片和接種星形膠質細胞，加入培養基需要額外的3h的孵育時間。星形膠質細胞在標準玻片（3～5天）或微量細胞培養玻片（24h）還需要一定的時間。最后，培養多巴胺能神經元，用3h分離5～10只動物腦組織，包括麻醉、分離組織、分離細胞、接種，在加入培養基之前再孵育另外3h。每只動物分離腦組織和中腦的最佳時間不應超過1.5min，以減少多巴胺能神經元的死亡。

參考文獻

Fasano C, Thibault D, Trudeau LE. Culture of postnatal mesencephalic dopamine neurons on an astrocyte monolayer. Curr Protoc Neurosci. 2008, Chapter 3: Unit 3.21.

（宋　悅　潘曉東）