第三節 細菌的接種法

一、目的與要求

（1）掌握微生物各種分離、接種的方法。

（2）掌握無菌操作的基本環節。

（3）完成一定數量的微生物接種任務。

二、原理

在自然界中，各種微生物是在互為依賴的關系下共同生活的。因此，為了取出特定的微生物進行純培養，必須把它們分離出來。將一種微生物移到另一種滅菌的培養基上稱為接種。

分離培養微生物時，要考慮微生物對外界的物理、化學等因素的影響，即選擇該類微生物最適合的培養基和培養條件。在分離、接種、培養過程中，均需嚴格的無菌操作，防止雜菌侵入，所用的器具必須經過滅菌，接種工具使用前后都要經過火焰滅菌，且在無菌室或無菌箱中進行。

（1）菌種：大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌。

（2）緩沖葡萄糖肉湯培養基試管垂直；緩沖葡萄糖肉湯固體培養基試管斜面；緩沖葡萄糖肉湯固體培養基平板；察氏培養基試管斜面；察氏培養基平板。

（3）接種環，接種針，接種鉤，鑷子，酒精燈，火柴，酒精棉，試管架，糨糊，標簽紙，恒溫培養箱等。

三、操作方法

細菌經分離培養出單個菌落后，常需再移種至其他培養基中，以進一步鑒定或保存菌種。根據接種培養基之物理性狀，純種細菌接種法可分為斜面培養基接種、液體培養基接種和半固體培養基穿刺接種法三類。

1．斜面培養基接種法

斜面培養基接種法一般用于純培養。從平板上挑取單個菌落接種至斜面培養基上，培養后獲得大量純種細菌（有菌苔生長），可進一步對細菌進行鑒定或作為菌種保存。

（1）左手持菌種管與待接種的培養管，將兩管并列，略傾斜，瓊脂的斜面均向上。

（2）右手持接種環，在火焰上燒灼滅菌，待冷。

（3）以右手掌與小指、小指與無名指分別撥取并挾持兩管蓋塞，將兩管口迅速通過火焰滅菌。

（4）用無菌冷卻了的接種環伸入菌種管，從斜面上刮取菌苔少許，立即移入待接種的培養基管，自斜面底部向上劃一直線，然后再由底部向上蜿蜒劃線。取出接種環，管口通過火焰滅菌，塞回蓋塞。做好標記后培養。次日觀察細菌菌苔生長情況。

2．液體培養基接種法

液體培養基接種法，主要用于增菌培養或細菌鑒定。若接種于肉湯培養基，經37℃培養18～24小時后，可觀察細菌的不同生長現象。其他的液體培養基，如葡萄糖蛋白胨水、各種單糖發酵管等，接種后大多供測定細菌生化反應之用。

（1）取接種環火焰燒灼滅菌，冷卻。

（2）按照上述“雙管接種法”一樣的操作手法，左手持細菌斜面菌種和肉湯培養基兩支試管。

右手持接種環，按無菌操作取少量細菌，在傾斜的管壁與液面交界處輕輕地研勻，試管直立時黏附管壁上的細菌浸入液體中，管口火焰滅菌，塞瓶塞，接種后放于37℃溫箱中培養18～24小時后取出。

3．半固體穿刺接種法

半固體穿刺接種法，主要用于保存菌種或檢查細菌有無動力，無動力的細菌在半固體培養基中沿穿刺線生長，有動力的細菌在半固體培養中呈擴散生長，甚至使培養基變得混濁。另外，此法也可用于細菌生化反應的檢測，如接種于醋酸鉛培養基、明膠培養基等。

（1）將接種針經火焰燒灼滅菌冷卻后，從斜面培養物上蘸取細菌。

（2）用無菌操作穿刺接種，將接種針刺入半固體培養基的正中央，深度達距管底0.5cm處為止，然后順原路退出，穿刺時要直進直出。接種針經火焰滅菌后放回原處。

（3）管口經火焰滅菌后，塞回蓋塞，培養于37℃, 18～24小時后觀察結果。

思維聚焦

比較斜面培養基接種法、液體培養基接種法和半固體穿刺接種法的原理及適用范圍。

知識拓展

（1）大腸桿菌是人和動物腸道中最著名的一種細菌，主要寄生于大腸內，約占腸道菌中的1%，是一種兩端鈍圓、能運動、無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。大腸桿菌能合成維生素B和維生素K，正常棲居條件下不致病；若進入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。大腸菌群數常作為飲水、食物或藥物的衛生學標準。

（2）酒精燈是以酒精為燃料的加熱工具，用于加熱物體。酒精燈由燈體、燈芯管和燈帽組成。酒精燈的加熱溫度為400～500℃，適用于普通的微生物實驗。