第四節 細菌的分離與培養
想一想，議一議：
1．無菌操作過程中應該注意哪些問題？
2．為什么冷卻后才能在培養基上劃線？
一、目的與要求
（1）掌握微生物的各種分離、培養方法。
（2）掌握無菌操作的基本環節。
（3）完成一定數量的微生物分離、培養任務。
二、原理
在自然界中，各種微生物是在互為依賴的關系下共同生活的。因此，為了取出特定的微生物進行純培養，必須把它們分離出來。將一種微生物移到另一種滅菌的培養基上稱為接種。
分離培養微生物時，要考慮微生物受外界的物理、化學等因素的影響，即選擇該類微生物最適合的培養基和培養條件。在分離、接種、培養過程中，均需嚴格的無菌操作，防止雜菌侵入，所用的器具必須經過滅菌，接種工具無論使用前后都要經過火焰滅菌，且在無菌室或無菌箱中進行。
細菌的生長條件包括：①營養物質；②適宜溫度；③一定的酸堿度；④適當的氣體環境等。我們可根據細菌對營養、pH、滲透壓的要求制備細菌培養基。把細菌接種于培養基后，放恒溫箱（一般為37℃）內培養一定時間（通常18～24小時），細菌便可大量繁殖，可進一步觀察和研究其生物學特性。
在接種和分離培養細菌時，常用接種環來蘸取細菌或標本，接種針則主要供作穿刺培養和挑取單個菌落之用。在使用接種環或接種針時，一般用右手以執筆式較為方便，左手可持培養基進行配合。
接種環和接種針結構
接種程序通常分為：①滅菌接種環（針）；②待冷；③蘸取細菌或標本；④進行接種；⑤滅菌接種環（針）5個步驟。不同的培養基，接種方法不盡相同，生長現象也各異：若細菌在液體培養基中生長，可表現為液體均勻混濁、出現菌膜或沉淀等不同現象；若在固體培養基上生長，可觀察到菌苔（斜面培養）或菌落（平板分離培養）；在半固體培養基中可見擴散生長或沿接種線生長。
三、材料與儀器
吸管，培養皿，試管，接種環，接種針，培養基。
四、操作步驟
瓊脂平板培養的方法很多，現以分區劃線接種法為例。此方法可通過劃線分離，充分利用培養基表面，分離出單個生長的菌落。
（1）在平板的底部用記號筆寫上組別、標本名稱或編號、日期等記號。
（2）右手握持接種環（執筆式）通過火焰滅菌，冷卻后，取一接種環上述細菌混合液。
（3）再以左手握持平板培養基，使平板略呈垂直方向，并靠近火焰周圍，以免空氣中雜菌落入。然后將蘸有菌液的接種環，先在培養基一角涂成薄膜（涂膜面約占整個培養基表面1/10的①區）。
（4）燒灼接種環，以殺死環上剩余的細菌。冷卻后，將接種環再通過①區薄膜處作連續劃線（使環面與平板表面成30～40°角，以腕力在平板表面進行劃線，注意勿將培養基劃破），劃出約占總表面積1/5的②區，同法，再分別劃出③區、④區、⑤區。注意⑤區勿與①區接觸。
平板分區劃線分離法
分區劃線接種法及培養后菌落分布示意圖
（5）將劃好的平板倒置于37℃培養箱，培養18～24小時后觀察菌落的形狀、大小、邊緣、顏色、濕潤度、透明度等，比較兩種菌落的差異。
思維聚焦
使用涂布平板法和劃線法如何能得到單菌落？
知識拓展
接種環是在生命科學試驗中常用的一種實驗室工具，廣泛應用在微生物檢測、細胞微生物、分子生物學等眾多學科領域。接種環按材質不同一般可分為一次性的塑料接種環（塑料制成的）和金屬接種環（鋼、鉑金或者鎳鉻合金）。
接種環的使用途徑：
（1）劃線法。用接種環粘取含菌材料，在固體培養基表面劃線。
（2）點植法。用接種環在固體培養基表面接觸幾點。
（3）傾注法。取少許含菌材料放入無菌培養皿中，傾注已融化的48℃左右的瓊脂培養基，搖勻冷卻。
（4）穿刺法。用接種環粘取微生物穿刺而進入半固體培養基深層培養。
（5）侵洗法。用接種環挑去含菌材料，在液體培養基中沖洗。