- 金釵石斛研究
- 乙引 陳玲 張習敏主編
- 7479字
- 2018-12-28 13:23:22
第1章 石斛屬植物研究概述
石斛屬(Dendrobium Sw.)為蘭科(Orchidaceae)最大的屬之一,全球約有1500種,主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)至太平洋島嶼,西起斯里蘭卡,東至太平洋塔希提島,北至印度的西北部及尼泊爾、錫金、不丹和喜馬拉雅山一帶,經緬甸向東北到我國南方并遠至朝鮮南部沿海島嶼和日本的九州、四國以及琉球群島,南達大洋州南邊的塔斯馬尼亞島(吉占和,1980)。我國石斛屬植物有76種2 變種,產于秦嶺諸省區(qū),主要分布在云南、廣西、貴州、廣東和臺灣(陳心啟等,1998;吉占和,1999)。從緯度而言,大多數種類都集中在北緯15°30′~25 °12′之間,向北種類逐漸減少,最北界不超過34°24′。從垂直高度看,海拔100m~3000m范圍都有分布(吉占和,1980)。
石斛屬植物為多年生草本植物,在生長發(fā)育良好的條件下才能形成花芽,于次年開花,花期為10~15 天。由于借助昆蟲異花傳粉,開花雖然多,但一般授粉不良,結果甚少(盧炯林,1991)。每個蒴果可含100 萬粒種子,種子細如粉塵,每粒重0.3~0.4毫克,種胚處于球形胚階段并存在后熟現象。由于種子無胚乳,在自然條件下常常需要特殊真菌的幫助才能萌發(fā),繁殖率極低,且不易發(fā)育成植株,群體的增殖主要依靠其自身的分蘗繁殖(盧炯林,1991;張明,2000)。除個別為陸生(我國不產)外,其余均為附生植物,生境較為獨特,對小氣候環(huán)境要求極為嚴格,喜生于熱帶和亞熱帶高溫、高濕叢林的樹上或林下巖石上,要求相對濕度85~95%、折射光光照強度為600~800lux的環(huán)境條件(趙天榜等,1994;吉占和,1980);常群居分布,上有林木遮蔭,下有溪溝水源,冬春季節(jié)稍耐干旱,但嚴重缺水時常葉片落盡,以裸莖度過不良環(huán)境,到溫暖季節(jié)重新萌發(fā)枝葉;常與地衣、苔鮮植物以及其他一些生境要求相似的植物混生,依賴于伴生植物供應水分和養(yǎng)分(彭銳等,2001)。
石斛屬植物主要有兩方面的應用價值。一方面是觀賞:大約有四分之一的石斛屬植物可供觀賞,石斛與蝴蝶蘭、萬代蘭、卡特蘭并列為觀賞價值最高的四大觀賞蘭類(盧思聰,1994)。另一方面是藥用:從古至今,石斛一直被認為是中草藥的上品。石斛作為一種名貴中藥在《神農本草經》中就有記載,是我國栽培歷史最悠久的蘭科植物之一。在《本草綱目》中,李時珍認為石斛是“本經上品,甘,淡,微咸。主治傷中,除痹下氣,補五臟虛勞羸瘦,強陰益精。”《中華人民共和國藥典》(2000版)對藥用石斛原植物的描述如下:本品為蘭科植物環(huán)草石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe.)、馬鞭石斛(Dendrobium fimbriatum Hook. Var. oculatum Hook.)、黃草石斛(Dendrobium chrysanthun Wall.)、鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.)或金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl.)的新鮮或干燥莖。藥用石斛具有益胃生津,滋陰清熱等功效。用于陰傷津虧,口干煩渴,食少干嘔,病后虛弱,目暗不明等癥(中華人民共和國藥典,2000)。現代研究發(fā)現石斛具有抗癌、抗腫瘤、抗血小板凝集、提高人體的免疫力、防止衰老等一系列功效,在臨床及中藥復方中被廣泛應用(徐紅等,2001),如復方中藥“石斛夜光丸”、“清睛粉”等對治療白內障、青光眼、視神經炎等均有較好療效;“復方脈絡寧注射液”有清熱養(yǎng)陰、活血化瘀等功效,臨床用于治療閉塞性周圍血管炎;復方“清咽寧”沖劑治療慢性咽炎,療效顯著;加減“益胃湯”對肋痛厭食、腹脹和泄瀉均有顯著療效(王康正等,1997)。
作為經濟價值極高的觀賞植物和傳統(tǒng)名貴中藥,目前國內外市場對石斛的需求量越來越大。但是由于石斛對生長環(huán)境要求苛刻,生長緩慢,自然繁殖率極低,再加上環(huán)境污染和大量采伐樹木,石斛賴以生存的野生生境遭到破壞,過度采挖野生石斛,人工栽培成活率低,產量低等原因,致使石斛資源嚴重匱乏,產量驟減,其中不少種類已處于瀕危狀態(tài)(曾宋君等,1996)。近年來,為解決需求增加與資源枯竭日益尖銳的矛盾,國內外對藥用石斛的研究進入了一個高潮,涉及的研究范圍廣泛,主要集中在藥用石斛原植物的鑒定、有效成分及藥理作用、組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)等幾個方面。
在我國的中藥古籍中,作為中藥石斛的原植物種類相當復雜,如李時珍在《本草綱目》中將入藥的石斛分為石斛和木斛,《證類本草》中還有溫州石斛和春州石斛的附圖,各書中都記載了不同種類的石斛在藥效上均有明顯的差異。近年來,國內外學者曾對石斛類藥材開展了大量的生藥鑒定研究(沙文蘭,1980;Carlsward,1997;馮德強,1999)。目前在我國藥材市場上藥用商品石斛的原植物共有45 種之多(李滿飛等,1986,1991;馬國祥等,1996),而且不同來源的石斛在化學成分種類、含量及藥理活性等方面均存在一些差異(王艷等,1995),這使得藥用石斛原植物的鑒定顯得格外重要。但遺憾的是,迄今為止,對商品石斛及其原植物鑒定還沒有規(guī)范標準。
在石斛屬植物化學成分的研究方面,自日本人鈴木秀干等于1932 年首次從金釵石斛中獲得石斛堿(Dendrobine)以來(王憲楷等,1986),國內外學者已經對石斛屬37 種植物進行了化學成分及其藥理活性的研究(林萍,2003),總的情況是石斛屬植物所含的化學成分種類繁多,但是其活性成分主要為生物堿和多糖兩大類。生物堿是藥用石斛重要的活性物質,具有降血壓,治虛熱,止痛退熱等功效(金蓉鶯,1981)。到目前為止,從石斛屬植物中共分得32 種生物堿,其中倍半萜類生物堿19 種、四氫吡咯類生物堿3 種、苯酚四氫吡咯類生物堿3 種、吲哚聯啶類生物堿5 種、咪唑類生物堿2 種(張光濃,2003)。金蓉鸞等(1981)對11 種石斛的總生物堿進行了測定,發(fā)現凡性狀鑒別時具有苦味的,生物堿含量較高,其中金釵石斛總生物堿含量達0.41%~0.64%,遠比其他種類石斛高。石斛多糖具有增強T細胞及巨噬細胞免疫活性的作用,是一種免疫增強劑(王康正等,1997)。對于中藥石斛的質量,傳統(tǒng)的標準為:“質重,嚼之粘牙,味甘,無渣者為優(yōu)”,表明多糖含量在石斛品質中的重要性。一些研究表明,石斛生理活性的強弱與其多糖含量呈正相關(林萍,2003)。李滿飛等(1990)對25 種石斛屬植物的36 個樣品進行了多糖含量測定,發(fā)現凡達到傳統(tǒng)優(yōu)品的樣品種類,其多糖含量均高于30%,而廣西產一級楓斗的多糖含量高達45.98%。石斛的糖類成分不僅對動物和人體有生理活性,而且它是組織培養(yǎng)研究中經常使用的一種重要調節(jié)劑,如鐵皮石斛多糖能促進滇紫草合成紫草素,鐵皮石斛寡糖素有利于西洋參細胞的生長和皂甙含量的提高(王康正等,1997)。除了生物堿和多糖以外,研究還發(fā)現中藥石斛中其他的有效成分,如Stilbenoids類、菲類和聯芐類物質具有抗癌活性(陳曉梅等,2000),從環(huán)草石斛的甲醇提取物中分離鑒定的化合物石斛酚(Moscatilin)二醋酸鹽具有抗血小板凝集作用(Chen,1994)。現代藥理研究表明,中藥石斛煎劑對豚鼠離體腸管和活動有興奮作用,能促進胃液分泌,對人的胃酸分泌有明顯的促進作用,能改善甲亢型小鼠的虛弱癥狀。這些藥理作用與中藥石斛的功效是相符合的,但至今還未能從石斛屬植物中發(fā)現具有這些作用的化學成分(陳曉梅,2000)。目前,對石斛屬植物化學成分及藥理作用的研究偏重于低極性、小分子的物質,對極性高、大分子物質的研究較少。隨著對已知化合物的藥理活性和藥用價值的進一步深入研究,探索活性成分的作用機理和構效關系、以活性成分為先導化合物的結構修飾和改造,特別是酶學等生物技術在化學合成方面的應用以及指紋圖譜的研究等都將具有良好的前景。
在石斛屬的組織培養(yǎng)方面,自Kundson在1930年用 Laelia cattleya的雜種種子經過無菌培養(yǎng)使其萌芽長成植株以來,蘭花組織培養(yǎng)技術發(fā)展迅速(何靜波,1982)。Morel在1960年通過蘭花莖尖培養(yǎng)獲得了原胚體并分化成植株,從而實現了蘭花栽培的工廠化和商品化(何靜波,1982)。自石斛屬莖尖組織培養(yǎng)無病毒植株的無性繁殖技術創(chuàng)立以來,石斛屬組織培養(yǎng)技術逐步走向成熟,成為解決石斛屬資源短缺、緩解藥材市場供需矛盾的重要手段。我國石斛組織培養(yǎng)研究起步較晚,直到20 世紀70 年代末,胡忠等(1979)才首次用黑節(jié)草(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.)種子通過組織培養(yǎng)獲得原胚體并分化形成小苗,但小苗的栽培一直沒有得到滿意的結果。此后,相繼有人報道利用鐵皮石斛、束花石斛、兜唇石斛等的莖尖、葉尖或種胚獲得了再生植株(王康正,1998)。近年來,已摸索出了一些石斛種類的組織培養(yǎng)最佳條件,包括光照、溫度、pH值以及外植體的選擇、激素的組合等,并利用組培技術研究石斛種子萌發(fā)過程中的生理生化變化,在石斛的離體開花、人工種子、轉基因石斛等方面都先后取得了成功。目前,很多研究以種子做外植體進行無菌播種產生原球莖(Protocorm),進而分化發(fā)育成完整植株。石斛種子盡管在自然界的萌發(fā)和成苗率極低(一般只有1~5%),但在培養(yǎng)基中萌發(fā)較容易,有很高的萌發(fā)率,并且只要培養(yǎng)條件適宜,多數都能在無菌條件下成苗(李銘宗,1999)。此外,除以種子進行組培快繁外,通過莖段、莖尖、芽、節(jié)、葉片、幼根等適宜外植體也可以誘導形成擬原球莖(Protocorm-like bodies,PLBs)或叢生芽進行離體培養(yǎng)獲得再生植株。到目前為止,尚未見以花及花藥為外植體的組織培養(yǎng)的報道(張明,2000)。以往的研究表明,基本培養(yǎng)基并不是制約石斛離體培養(yǎng)的最重要因素,植物組培中常用的許多培養(yǎng)基均可用于石斛組織培養(yǎng),其中MS培養(yǎng)基被廣泛地用于石斛種子、莖段、葉片等的培養(yǎng)。使用不同的培養(yǎng)基,效果也不同。譬如,張治國(1992)研究了6種基本培養(yǎng)基(1/2MS、MS、N6、B5、KC、VW)對鐵皮石斛原球莖增殖的影響。結果表明,不同的基本培養(yǎng)基對原球莖增殖影響十分明顯,其中以1/2MS培養(yǎng)基最適宜原球莖的增殖。此外,在不同培養(yǎng)階段,選擇不同的培養(yǎng)基對培養(yǎng)效果也有較大的影響(張艷等,2000)。植物生長調節(jié)物質雖然用量極小,但在石斛組織培養(yǎng)中卻起著重要和明顯的調節(jié)作用。生長素的主要作用在于誘導愈傷組織的形成、胚狀體的產生以及試管苗的生根,更重要的是配合一定比例的細胞分裂素誘導腋芽及不定芽的發(fā)生,常用的生長素有2,4-D、NAA、IAA和IBA等;細胞分裂素有促進細胞分裂和分化、延遲組織衰老、增強蛋白質合成、抑制頂端優(yōu)勢、促進側芽生長及顯著地改變其他激素作用的特點,常用的細胞分裂素有KT、6-BA、ZT和2ip等(曹孜義等,1999)。研究發(fā)現,不同材料作為外植體各有利弊,以繼代苗段增殖長勢快,但原植株需要量大,生產基數小;莖段作為外植體,成株快,但也需要大量原植株,也存在生產基數小的缺陷;種子無菌播種繁殖系數雖然高,但增殖生長周期長,培養(yǎng)的試管苗莖細,苗弱,需反復壯苗,脫瓶移栽成活率極低(楊聯河,1998)。目前,有關石斛試管苗移栽的文獻報道較多,但普遍存在移栽成活率低的問題(王康正,1998),莖段外植體苗移栽成活率多為60~76.7%(陳薇,2002;朱艷,2004),而種子苗的成活率往往更低。因此,如何提高試管苗移栽的成活率就成為當前石斛組培快繁研究的熱點問題。
石斛屬植物組織中存在大量內生菌,它們能夠影響宿主植物生理生化代謝,促進植物的生長發(fā)育,從植物組織中分離和篩選出促進植株生長的菌株是解決問題的關鍵。已報道的內生真菌絕大部分屬于半知菌亞門和擔子菌亞門,還有少數屬于子囊菌亞門(郭順星等,1990)。1994 年吳靜萍和鄭師章從密花石斛根部直接分離到一株真菌,經鑒定為鐮刀屬(Fusarium)菌株。2000 年,郭順星等從我國云南、四川等地采集的野生石斛品種上分離到內生菌根真菌,經鑒定分屬于柱孢霉屬(Cylindrocarpon)、瘤菌根菌屬(Epulorhiza)、蝕絲霉屬(Myceliophthoreae)、頭孢霉屬(Cephalosporium)、角菌根菌屬(Ceratorhiz a)、簡梗孢霉屬(Chromosporium)、絲核菌屬(Rhizoctomia)、粘帚霉屬(Gloiocladium)、念珠菌根菌屬(Moniliopsis)、盤多毛孢屬(Pestalotina)以及石斛小菇(Mycena dendrobii)和蘭小菇(Mycena orchidiocla)(Guo等,2000;郭順星等,1999)。將25 種內生真菌分別與鐵皮石斛種子、鐵皮石斛及金釵石斛無菌苗共培養(yǎng)測定其生物活性,其中5 種真菌對促進鐵皮石斛種子萌發(fā),7種真菌可與鐵皮石斛和金釵石斛幼苗形成共生關系,但僅有3 種真菌對幼苗有促生作用(郭順星等,2000)。高微微等(2002)采用植物無菌原球莖及試管苗與真菌進行雙重培養(yǎng),觀測原球莖增殖及苗的生長情況,發(fā)現開唇蘭小菇、石斛小菇、蘭小菇等3 種小菇屬內生真菌能提高鐵皮石斛生長量3~5 倍,同時對鐵皮石斛原球莖增殖也有明顯促進作用。宋經元等(2004)研究瘤菌根菌屬(Epulorhiza)真菌AR-18 對鐵皮石斛和金釵石斛生長的影響,結果表明在離體培養(yǎng)條件下選擇合適的基質和控制真菌的適度生長是建立穩(wěn)定的共生平衡系統(tǒng)、促進金釵石斛生長的重要條件。吳靜萍等(1994,2000)、陳曉梅等(2000)、張集慧等(1999)從物質角度探討內生真菌促進其生長發(fā)育的機制,為闡明內生真菌促進蘭科藥用植物生長發(fā)育的作用機制提供證據(見表1.1)。此后,國內外學者不斷深入研究,尤其是在種子萌發(fā)和幼苗生長階段,發(fā)現菌根真菌與石斛屬植物生長發(fā)育密切相關。內生真菌能促進蘭科植物種子的萌發(fā),并參與幼苗的生長。石斛屬植物種子胚中所儲存的養(yǎng)分在胚最初的幾次細胞分裂中就已消耗殆盡,無法繼續(xù)提供種子萌發(fā)所必需的養(yǎng)分。從種子能量耗盡到幼葉開始光合作用的這段時期內,它們只有依靠真菌維持營養(yǎng)供給生存下去。目前,有關蘭科植物與內生真菌的關系還有許多問題尚未搞清。相關研究工作有的涉及真菌誘導子對石斛生理代謝的刺激作用(潘超美等,2004),有的則側重于共生體系中植株生長及其多糖和總生物堿累積相關性(陳曉梅等,2005)。此外,分子生物學方面的工作也剛剛開始(Chen等,2005)。
表1.1 幾種石斛宿主植物及其內生真菌代謝產物

為解決中藥材對野生和栽培的依賴,利用藥用植物組織及細胞生產有用次生代謝產物也是行之有效的方法。自從兩位美國學者Routien和Nickell在1956年提出植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)作為工業(yè)化生產植物次生代謝產物的一條途徑以來,該研究領域已經取得了相當大的進展。到目前為止,研究的植物種類已達250 種以上,從細胞培養(yǎng)物中獲得的次生代謝產物超過500 種,其中,10 余種植物的大規(guī)模細胞培養(yǎng)相繼進入了工業(yè)化生產或進入了中試階段(張泓,1994)。這些事實充分說明,一個植物的活細胞在離體培養(yǎng)條件下不僅具有形成完整再生植株的能力,而且也具有合成與原植物同樣的次生代謝產物的能力(唐建軍,2002)。在植物中,次生代謝往往是某些特化的細胞或組織特有的生理現象(吳曉玲,2002)。在離體培養(yǎng)條件下,在一定程度上形態(tài)分化的外植體細胞又脫分化,使原有的形態(tài)結構發(fā)生很大變化。隨著其形態(tài)特征發(fā)生改變,細胞的生理生化特性也發(fā)生相應的變化,從而可能使培養(yǎng)細胞合成某種次生代謝產物的合成能力提高、下降或喪失(張泓,1994)。研究表明,液體培養(yǎng)方式可以加速細胞的生長和提高次生代謝產物的積累(胡之壁,1998)。在生長迅速、高度分散的細胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中,細胞所處的環(huán)境既無極性也無梯度,可以迅速獲得較大的生物量;與之相反,在慢速生長,已經分化或部分分化的組織或細胞團卻能積累較多的次生代謝產物(任志華,2003)。三十多年來植物細胞大量培養(yǎng)的研究結果證明,大多數植物的培養(yǎng)細胞,在生長周期的后期才開始大量合成次生代謝產物。這可能是由于當細胞處于迅速分裂和生長階段時,需要合成大量的核酸、蛋白質和糖類等物質,此時初級代謝占絕對優(yōu)勢。而次生代謝與細胞的生長和分裂無直接關系,往往與代謝廢物的排泄、抗性物質或特殊分泌物的形成有關,所以常發(fā)生在細胞停止分裂和緩慢生長的時期(張泓,1994)。縱觀前人的研究結果,細胞的生長與次生代謝產物積累之間的相關性有如下3 種模式:①次生代謝產物的積累在細胞生長的靜止期;②次生代謝產物的積累高峰在細胞生長的指數生長期;③次生代謝產物的積累動態(tài)和細胞生長動態(tài)呈平行關系,只是產物的形成略落后于細胞的生長(張泓等,1994)。這種次生代謝與細胞生長之間的復雜性表明,在離體培養(yǎng)的情況下,與次生代謝有關的基因表達并不完全與整體植株中的情況相一致。同時,也給大規(guī)模的細胞培養(yǎng)生產帶來許多困難。Hoelsstra等(1988)指出,從生物技術的觀點出發(fā),懸浮培養(yǎng)體系仍然是大規(guī)模生產次生代謝產物最有效的方法。因此,可通過改變理化培養(yǎng)條件、篩選高產細胞株或施加誘導子,使脫分化細胞與次生代謝有關的遺傳基因得以表達(張泓等,1994)。愈傷組織源自于自然生長的植物受損傷時在愈合傷口處長出的一團瘤狀突起,瘤狀突起內的細胞相對于植物體成熟細胞已發(fā)生脫分化的變化;在植物組織培養(yǎng)領域,愈傷組織是指從外植體的內部或切口表面形成的一團沒有分化的組織,這種組織具有再分化的能力;松散的愈傷組織是進行懸浮培養(yǎng)最適合的材料,稍經機械振蕩,即可使組織分散成單細胞或少數幾個細胞組成的小細胞團,在培養(yǎng)中能夠較快增殖;而堅實愈傷組織細胞間被果膠質緊緊地貼著,因而往往不能形成良好的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),誘導形成的愈傷組織如果在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),細胞將不可避免地發(fā)生分化,產生新的結構(薛慶善,2001)。因此,研究以愈傷組織顆粒為代表的細胞團生長、細胞分化規(guī)律,已成為進一步提高次生代謝物產量的有效途徑之一(于樹宏,1998)。
近年來,人們對石斛屬植物的組織培養(yǎng)物替代原藥材使用或者生產活性成分進行了一定的探索。何靜波等(1982)通過液體旋轉培養(yǎng),使由種子產生的原胚體連續(xù)增殖,試圖以培養(yǎng)的原胚體的有用成分代替黑節(jié)草制成的商品“西楓斗”;魏小勇(2004)首次報道了鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)系的建立,為鐵皮石斛大規(guī)模培養(yǎng)開創(chuàng)了新途徑;羅建平等(2003)考察了霍山石斛原球莖在液體培養(yǎng)中增殖、水溶性多糖與總生物堿的特征;黃民權等(1998)對鐵皮石斛愈傷組織培養(yǎng)物和原植物之間多糖含量、多糖的單糖化學組成以及在藥理方面對一些免疫指標的影響做了比較,發(fā)現兩者在這幾方面都存在著明顯的相似性,從而證明了將組織培養(yǎng)物代替原植物做藥用的可行性。這些研究結果為藥用石斛有效成分的產業(yè)化開發(fā)所需原料的來源開辟了新途徑,充分展現了用石斛愈傷組織、原球莖等組培物代替其原植物直接作為藥用的誘人前景。但是,目前涉及到石斛組織培養(yǎng)次生代謝產物方面的研究還很少(徐紅等,2001),并且研究對象主要是鐵皮石斛和霍山石斛,在液體懸浮培養(yǎng)方面也主要是針對原球莖的液體懸浮培養(yǎng)體系,涉及愈傷組織誘導的報道不多(曾宋君,1996;周月坤,1989;王光遠,1995;張艷,2001),而有關愈傷組織懸浮培養(yǎng)系建立等方面的研究至今未見報道。
綜上所述,我們可以看到對藥用石斛進行離體快速繁殖,是目前解決生產中種苗來源問題的主要方法,已在多種石斛中成功地培育出試管苗,而且在培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基的選擇、激素的使用等一系列技術問題都得到了進一步的優(yōu)化。在種子的試管萌發(fā)、由外植體獲得再生植株、擬原球莖(PLBs)及叢生芽的誘導和增殖、試管苗的壯苗生根方法等諸方面均有大量的報道。然而,目前仍然存在著外植體苗繁殖系數低,種子苗纖弱,試管苗移栽成活率低等問題(王康正,1998)。從試管苗到大田栽培的中間環(huán)節(jié)成為制約石斛大面積人工栽培的主要障礙。此外,在進行組織培養(yǎng)研究時,直接以組織培養(yǎng)物替代原藥材使用或者生產活性成分也是解決石斛資源短缺的重要方法,然而目前涉及這方面的研究還很少(徐紅等,2001)。內生真菌的多樣性及其產物的多樣性對植物生長發(fā)育具有重要調節(jié)作用,研究結果有望將內生真菌應用到石斛屬植物的繁殖中去,解決菌劑技術應用于現實生產的關鍵問題。