第四節　體外毒理學試驗方法

一、細胞毒性實驗

細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于凋亡或壞死的細胞死亡機制。有時需要進行特定物質細胞毒性的檢測，比如藥物篩選。

細胞毒性檢測主要是根據細胞膜通透性發生改變來進行的檢測，常用以下幾種方法：細胞增殖度法、MTT比色法、XTT法、CCK-8法、熒光素發光法，具體檢測原理是利用線粒體內部酶的活性，可以將特定的四唑鹽類進行轉化，然后通過酶標儀進行檢測。

1.細胞增殖度法

細胞增殖度法是我國自20世紀80年代就開始運用的細胞毒性試驗方法，已廣泛應用于目前醫療器械的生物安全性評價中。該方法主要是將細胞接觸樣品浸提液后，對存活細胞的數量進行測定，用細胞增殖率來推斷樣品對細胞的毒性作用。

（1）實驗方法：

參照文獻進行細胞增殖度法，每支細胞培養瓶分別加入一定濃度的細胞懸液，置37℃、5% CO₂培養24小時后棄去原培養液。培養瓶加入不同濃度的實驗樣品溶液，置37℃、5% CO₂培養箱中繼續培養7天。細胞形態學觀察和計數：在更換細胞培養液的當天，以及于第2、4、7天進行細胞形態觀察和細胞計數。根據各組細胞濃度按下式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）^［5］：

（2）優缺點：

該方法存在對細胞和耗材的消耗較多、實驗操作誤差較大、試驗周期長、耗時多等缺點^［6-7］。

2.MTT比色法

自1983年Mosmann建立MTT比色法以來，由于其簡單、經濟、無放射性污染等特點，MTT比色法已經成為細胞生物學領域測定細胞生長及增殖情況的常用方法。MTT比色法的原理：活細胞的琥珀酸脫氫酶能使外源性黃綠色的MTT還原降解形成不溶于水的藍紫色的結晶物質甲?（formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解細胞中的甲?結晶成溶液，用酶標儀在490nm波長處測定其吸光度。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的數量值與細胞數成正比。根據測得的吸光度，來判斷活性細胞數量，吸光度越大，表明細胞活性越強。

（1）實驗方法：

首先將配制好的細胞懸液接種于96孔細胞培養板（每孔100μl）上，置37℃培養24小時后，棄去原培養液。加入含有不同濃度樣品溶液的新鮮培養液進行交換，每孔100μl，置37℃培養48小時后觀察細胞形態。棄去培養基，每孔加入含有MTT的培養基，繼續培養4小時后吸除原液，加入DMSO，置振蕩器上振蕩10分鐘。用酶標儀在490nm處測定其吸光度，計算細胞的RGR^［8-9］。

（2）優缺點：

與增殖度法相比，MTT比色法由于實際檢測所需的細胞量相對較少，試驗步驟相對簡便，誤差小，檢測周期短，因此具有一定的優越性，值得推薦作為細胞毒性檢測方法^［5］。另外，中藥提取物含大量的黃酮類化合物容易干擾比色結果，所以要注意增設對照組，并進行重復試驗。

由于MTT經還原所產生的甲?產物不溶于水，需被溶解后才能檢測，這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲?的有機溶劑對實驗者的健康也有損害^［10］。為了克服MTT比色法檢測的不足之處，近些年又陸續出現了一些新的檢測方法，如MTS 法、WST-1 法、XXT 法、Cell Counting Kit（CCK-8）法等，其中 CCK-8 法是應用得相對比較廣泛的方法之一^［11］。

3.CCK-8法

是用于測定細胞增殖或毒性實驗中活細胞數目的一種高靈敏度、無放射性的比色檢測法。CCK-8法應用非常廣泛，如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。可直接進行測定，實驗誤差比較小。

CCK-8法的原理：該試劑中含有WST-8，其在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被活細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性、能溶解于組織培養基中的橙黃色甲?染料，用酶標儀在450nm波長處測定其OD值。

（1）實驗方法：

將配制好的細胞懸液接種于96孔細胞培養板（每孔100μl）上，置37℃培養24小時后，棄去原培養液。加入含有不同濃度樣品溶液的新鮮培養液進行交換，每孔100μl，置37℃培養48小時后觀察細胞形態。棄去培養基，每孔加入含CCK-8試劑培養基，培養1～4小時，用酶標儀測定各孔在450nm的OD值。利用公式計算細胞存活率：cell viability（%）=（OD-OD）÷（OD-OD）×100%，并利用改良寇氏法計算IC^［10］。

_{樣品空白對照空白50}

（2）CCK-8法的影響因素及確定最佳實驗條件^［12］

1）實驗細胞貼壁率影響細胞增殖檢測（CCK-8法）結果，最佳細胞貼壁率應控制在50%～80%之間。

2）加入CCK-8試劑后，孵育時間影響細胞增殖檢測（CCK-8法）結果，加入CCK-8后最佳孵育時間應控制在1～4小時之間。

3）其他實驗條件：①CCK-8的加入量為培養基的10%，由于加入的CCK-8量比較少，有可能會因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，所以在加完試劑后應輕輕敲擊孔板以幫助混勻；②當在培養箱內培養時，孔板最外一圈的最容易揮發，一般情況下，最外圈的孔只加培養基，不作測定孔用。

（3）優缺點：

目前已有報道認為CCK-8法是相對MTT比色法更為簡便、快捷且應用成熟的細胞增殖毒性檢測的方法，如侯春梅等^［13］在懸浮細胞的增殖檢測實驗中發現CCK-8法重復性好、靈敏度高，明顯優于MTT比色法；檢測氟尿嘧啶和奧沙利鉑在WiDr、SW620和HT-29等3種癌細胞株中的抗增殖研究中也發現CCK-8法是更靈敏的檢測方法^［14］。

1）從實驗的條件、操作及試劑的毒性等方面將兩種方法進行比較，CCK-8法相對MTT比色法有下面這些優勢^［10］：

a.CCK-8法中生成的是水溶性的甲?，可以直接檢測；而MTT比色法中生成的是不溶于水的甲?結晶，需要在加入MTT溶液孵育后吸棄培養液，再加入DMSO來溶解甲?，繼而進行檢測。這不僅使操作變得煩瑣，也會因吸棄培養液時導致甲?損失或甲?溶解程度不完全等原因對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲?的DMSO也有一定毒性，對實驗者健康會有危害。

b.加入CCK-8試劑孵育時間是1～4小時，通常經過實際實驗摸索，0.5～1小時就可以產生較穩定的橙黃色甲?，即可進行檢測。而加入MTT溶液孵育的時間一般需要4小時，相比CCK-8法而言更費時。

c.CCK-8試劑本身毒性小，對細胞的毒性也相當低，細胞在CCK-8法檢測后還可以用于其他細胞增殖的檢測實驗，如結晶紫檢測法、中性紅檢測法或DNA熒光檢測法等。而MTT溶液毒性較大且有致癌性，對實驗者的健康有危害，操作時要格外小心，并且MTT比色法檢測對細胞是有損傷的，細胞在檢測后不能再用于其他實驗。

CCK-8法檢測的精密度和準確度較MTT比色法更高，而且CCK-8法操作更為簡便和快速，對實驗者和環境危害低。因而，CCK-8法值得在細胞增殖和藥物毒性檢測等實驗中推廣應用。

2）缺點是CCK-8試劑價格較為昂貴，且試劑顏色為淡紅色，與含有酚紅的培養液顏色極其相似，加入試劑之后不會立即顯色，因此很容易造成漏加或者多加，并且CCK-8試劑加入量很少，如果不小心沾到壁上，很可能會導致結果的可重復性不是很好^［15］。

4.熒光素發光法

熒光素發光法原理：腺苷酸激酶（adenylate kinase，AK）存在于所有真核和原核細胞的胞漿中，AK具有激活ADP生成ATP的作用。當細胞受損后，細胞膜發生破損，AK會釋放到培養液上清液中。該試劑盒利用熒光素酶和熒光素在ATP作用下可以發光，通過化學發光儀可以定量檢測細胞生存能力。

（1）實驗方法：

實驗時，取對數期生長的細胞在6孔板中培養24小時，棄去培養液，加入含有樣品的培養基，培養24小時后，將細胞在含熒光素PBS中洗滌。隨后，在室溫下避光孵育，熒光素可透過細胞膜并積蓄在活細胞內，用來進行活細胞染色。使用熒光倒置顯微鏡拍照。熒光素在激發和發射波長測定熒光吸光度^［16］。

（2）特點：

簡單、快速；板式檢測，可進行高通量。

二、肝切片毒性篩選實驗

精密肝切片技術介于器官與細胞水平之間，肝切片包含肝組織內所有類型細胞，保存了完好的細胞基質和細胞間的相互作用，代謝能力比較接近整體器官，在闡明藥物與毒物代謝轉化、預測藥物毒性及比較不同種屬間藥物作用差異等方面發揮著重要作用^［17］。

實驗方法^［18］如下。

1.肝切片的制備

將大鼠斷頭處死。在無菌條件下取出肝臟，置于預先以氧飽和的冰Kerbs-Henseelti（HK）緩沖液中，持續通氧（95% O₂，5% CO₂）^［15］。于肝右葉中間部位切取一塊約20mm×15mm×4mm的肝組織。將肝組織塊置于6孔板中，用2%瓊脂糖包埋。用生物膠將包埋的肝組織塊固定于振蕩切片機的切片臺上，將切片臺置于含HK緩沖液的切片機標本槽中。調整刀片角度18°左右，將刀的前進速度調至最低，振幅調至最大，切片厚度200～400μm，進行肝切片，并用循環泵將緩沖液溫度保持在2～4℃。選取完整的肝切片，用6mm打孔器打成大小一致的圓形肝片，用于培養。

2.肝切片活性的檢測

（1）MTT 還原能力：

將肝切片置于 12 孔板中，1 片 /孔，每孔中加 1g/L MTT 1.0ml，37℃振蕩孵育1小時，棄上清液，每片肝切片再加1.0ml DMSO，37℃振蕩溶解1小時，上清液于570nm處測吸光度，肝切片稱重，計算吸光度除以肝切片質量，將0小時的數值記為100%，其余時間點的數值除以0小時的數值，作為各個時間點的MTT還原能力的變化百分率。

（2）生化指標：

肝切片用生理鹽水制成2%的肝組織勻漿液，參照試劑盒說明書，BCA法測定蛋白含量，全自動生化分析儀連續監測法測定不同培養時間點上清液及組織勻漿液中 GPT、GOT、LDH、GGT 酶活濃度，計算每微克蛋白中 GPT、GOT、LDH、GGT 的漏出率。

（3）影響因素

1）培養液對肝切片活力的影響：曾報道肝切片在BPM培養液中，通過動態培養，其存活時間長達96小時^［17］。也有實驗研究發現，不同種類的培養液對精密肝切片活力的影響較大，BPM培養液中肝切片的活性明顯高于DMEM及2種Waymouth's培養液，分析原因可能是肝切片需要的營養成分較復雜，僅靠血清供給不足以滿足肝細胞的生長要求。而且隨著培養時間的延長，肝細胞漿內糖原含量減少，細胞可能處于缺氧狀態^［18］。

2）肝切片厚度對肝切片活力的影響：肝切片厚度一般在200～300μm存活時間較長。有研究發現，較薄的肝切片（200μm）MTT還原能力明顯高于300μm、400μm厚度的肝切片^［18］。

3）培養液的pH對肝切片活力的影響：培養液的pH對肝切片活力亦會產生一定影響，隨著培養時間的延長，肝切片在弱酸性環境中較耐受，培養24小時，與弱堿性培養液中的肝切片活力比較有顯著性差異。

4）不同的培養溫度對肝切片活力影響不大。

【評價】 與體內試驗相比，精密肝切片培養表現出簡單、快速、經濟的特點，可以作為一種新的快速敏感的技術手段用于藥物肝毒性早期預警的實驗研究。精密肝切片培養的主要缺點之一是新鮮的肝切片存活時間相對較短，一般都在6小時之內，但中藥一般作用緩慢而持久，短時間培養可能較難檢測出變化，目前國外有報道通過改良培養基使肝切片的存活時間長達 96 小時^［19］。

三、器官灌流毒性篩選實驗

以肝臟灌流為例，肝臟灌流技術在現代藥理毒理學研究中已廣泛應用。利用灌流方法可以提供在體和離體肝臟所必需的營養成分和生理環境。與肝組織勻漿、肝組織切片、肝細胞分離、肝細胞膜以及肝細胞酶提取等研究方法相比，肝臟灌流方法的特點是肝臟的組織結構和門脈系統、肝血竇及Dise間隙等參與物質轉運的結構均不受影響。該技術可用于藥物毒性、藥物相互作用、膽汁排泄和轉運等研究。

1.實驗方法

（1）實驗動物：

牛、豬、豚鼠、犬、蛙、小鼠、兔子和大鼠均可選用。進行在位的肝臟灌流宜選用大鼠，因為大鼠缺乏膽囊，可以連續地收集膽汁；另外大鼠肝臟大小適中，不需高的灌流速度即可維持灌流；價格經濟。

（2）在位肝臟灌流手術程序：

手術是進行肝臟灌流的關鍵。①用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，劑量為50mg/kg。②仰位固定麻醉大鼠。③下腹部做一切口，向兩側延至膈肌水平，呈“V”形，上翻皮瓣暴露腹腔臟器。④結扎幽門靜脈和腹腔動脈。⑤做膽管插管，收集膽汁。⑥游離肝臟系膜緣，切勿損傷肝，在肝腎之間水平的下腔靜脈上系一松結。⑦作門靜脈插管，立即接通蠕動泵，開始灌流。使肝缺血的時間盡量縮短，一般要求在5秒內完成。插管時勿損傷門靜脈；排完氣泡。如灌流成功，整個肝臟應呈均勻的棕黃色。灌流速度為10ml/min。⑧一旦開始灌流，即刻在上述松結下切開下腔靜脈，讓灌流液流出。⑨打開胸腔，切開右心耳，插入導管至下腔靜脈內，達肝靜脈水平，結扎固定。該導管用于收集流出液，作結果分析用。⑩將下腔靜脈上的松結系緊結扎。

（3）灌流方式：

按灌流液循環方式可分為單次灌流和循環灌流兩種。按灌流方向可分為正常灌流和逆向灌流兩種。正常灌流由門靜脈流入肝臟，從肝靜脈出肝，在下腔靜脈處收集流出液。逆向灌流則從肝靜脈入肝，由門靜脈或肝動脈出肝。兩種方法中以前者常用。

2.肝臟灌流在藥物研究中的應用

（1）在藥物代謝和毒性研究中的應用：

可以幫助揭示藥物在肝臟代謝的Ⅰ相和Ⅰ相代謝物以及相互關系，也用于研究藥物的相互作用。如dl-普萘洛爾作用后會使利多卡因的肝臟清除減少。用逆向灌流方法可研究肝臟藥物代謝酶的分布狀況。如使非那西丁轉變為醋氨酚和醋氨酚硫化物的氧位脫乙基酶和硫化酶在肝臟中分布不同，氧位脫乙基酶位于肝小葉中央區，而硫化酶主要在門脈周圍區。

（2）用于肝臟中間代謝及藥物影響的研究：

如氨基比林、水楊酸鹽、苯乙雙胍及乙醇可抑制糖異生；四氯化碳降低尿素的生成；戊巴比妥可增加灌流液中谷胱甘肽的生成量。

（3）動力學研究：

肝臟灌流條件及分析均易控制，適用于肝臟代謝和血流動力學的研究。肝臟灌流流量和代謝物生成有一定的關系：肝臟對底物的攝取高時，肝臟清除作用與流量成正比，但流量不影響攝取的大小。肝臟攝取小時，肝臟清除不受流量的影響。另外，藥物清除或代謝物清除與血漿蛋白結合作用有關，一般游離部分愈多則清除愈多。但灌流研究表明，高清除物的清除則不受血漿蛋白結合的影響，只有低清除物的清除易受影響。

（4）膽汁排泄及轉運研究：

通過肝灌流對膽汁排泄及轉運研究表明，肝臟膽汁分泌壓力不依賴于分泌入膽汁中的膽鹽，是膽汁的非依賴部分。牛磺膽酸鹽在肝臟中與白蛋白有相似的分布區。而且，膽酸鹽和牛磺膽酸鹽相互競爭抑制依賴Na⁺攝入肝臟的機制。此外，膽紅素入肝量的增加可使膽汁排泄率、肝臟濃縮作用和膽汁流量成比例地增加。

除了肝臟灌流外，心、肺、腸和腎臟灌流也可借助于同樣的方式進行。