第五節(jié)　體內(nèi)毒理學(xué)試驗(yàn)方法

一、鹽蝦毒性分析實(shí)驗(yàn)

天然藥物可能存在的細(xì)胞毒性也能通過(guò)鹽蝦（Artemia Salina）毒性分析實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。因?yàn)辂}蝦對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的毒性具有高度敏感性，鹽蝦毒性分析實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成為一項(xiàng)方便的基礎(chǔ)毒性實(shí)驗(yàn)。在許多事例中鹽蝦的毒性反應(yīng)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性一致。實(shí)驗(yàn)方法^［20-21］如下：

（1）材料：

試驗(yàn)樣品、鹽蝦蛋、海鹽（38g/L，pH 7.4）、帶孔孵化板、吸引鹽蝦幼蟲(chóng)的照明燈等。

（2）鹽蝦的孵化：

鹽蝦蛋應(yīng)低溫（4℃）保存。在此溫度下，鹽蝦蛋能保持多年的活力。孵化板（22cm×32cm矩形盤(pán)）充滿一半經(jīng)過(guò)濾的鹽溶液。鹽蝦蛋（25mg）撒在此溶液中。孵化板在28℃孵育48小時(shí)。

（3）鹽蝦的細(xì)胞毒性試驗(yàn)：

①經(jīng)過(guò)2天孵化，鹽蝦蛋成熟為幼蟲(chóng)，用移液管吸取幼蟲(chóng)，每瓶10只幼蟲(chóng)，加入含有藥物的5ml海水。②培養(yǎng)箱下25～27℃孵育24小時(shí)。③孵育24小時(shí)后記錄存活鹽蝦的數(shù)目。④采用Finney計(jì)算機(jī)程序分析數(shù)據(jù)，計(jì)算LD₅₀和95%置信區(qū)間。⑤孵化開(kāi)始后鹽蝦可存活48～72小時(shí)，72小時(shí)后開(kāi)始死亡。

【評(píng)價(jià)】 鹽蝦隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱鹵蟲(chóng)屬，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的生物活性餌料。鹵蟲(chóng)休眠卵可低溫長(zhǎng)期保存，卵的孵化和幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育速度較快，是理想的生物實(shí)驗(yàn)材料，其無(wú)節(jié)幼體被作為無(wú)脊椎動(dòng)物代表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)生態(tài)毒性測(cè)試^［22］。鹽蝦毒性實(shí)驗(yàn)通常作為一種指導(dǎo)提取物分離篩選的工具之一，值得應(yīng)用推廣，是一種快速、便宜、綜合性的生物檢驗(yàn)方法，并逐步發(fā)展為具有生物活性天然藥物的顯示、分離和檢測(cè)方法^［20］。

二、斑馬魚(yú)毒性實(shí)驗(yàn)

傳統(tǒng)的新藥臨床前體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)一般采用嚙齒類動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，該方法雖然具有結(jié)果可靠、綜合全面等優(yōu)點(diǎn)，但是其成本較高，并且不適合于高通量的藥物篩選與毒性機(jī)制的研究。因此急需一種既具有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的高通量性和經(jīng)濟(jì)性，又具有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的可靠性和全面性等優(yōu)勢(shì)的模式動(dòng)物。由于目前斑馬魚(yú)已經(jīng)廣泛用于藥物毒性研究，本文在此將不再描述具體實(shí)驗(yàn)方法，而是僅就斑馬魚(yú)模型在一般毒性、發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、器官毒性和生殖毒性等評(píng)價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)行了歸納綜述，闡述該模型在毒性研究的優(yōu)勢(shì)，旨在將斑馬魚(yú)模型與藥物早期安全性評(píng)價(jià)相結(jié)合，以提高新藥研發(fā)的效率和安全性，降低新藥研發(fā)成本，從而更好地推動(dòng)該模型的應(yīng)用。

1.斑馬魚(yú)的生物學(xué)特點(diǎn)及其在藥物早期安全性評(píng)價(jià)中的優(yōu)勢(shì)

在生命科學(xué)領(lǐng)域，斑馬魚(yú)作為一種常用的模式動(dòng)物，可以彌補(bǔ)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各種不足。斑馬魚(yú)與人類基因具有高達(dá)87%的同源性^［23-24］，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、生理結(jié)構(gòu)與功能等均與哺乳動(dòng)物高度相似^［25］，這意味著用斑馬魚(yú)開(kāi)展藥物實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體。同時(shí)，斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，它能準(zhǔn)確反映待測(cè)藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄等動(dòng)態(tài)生理過(guò)程。所以，利用斑馬魚(yú)進(jìn)行藥物早期安全性評(píng)價(jià)時(shí)，其結(jié)果比體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)更可靠。

斑馬魚(yú)是一種小型的熱帶魚(yú)類，對(duì)生存的水環(huán)境要求不高，培養(yǎng)水的pH在6.8～7.8之間，水溫25～31℃。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)成本低，體外受精，體外發(fā)育，胚胎透明且發(fā)育快速，胚胎在24 小時(shí)內(nèi)即可發(fā)育成形。體外受精約 120hpf（受精后小時(shí) hours post fertilization，hpf）后，各個(gè)組織和器官，例如腦、心臟、肝臟、腎臟、胰臟、肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)等均可發(fā)育完全^［26］。斑馬魚(yú)的以上特點(diǎn)均顯示，與其他模式動(dòng)物相比，利用斑馬魚(yú)進(jìn)行體內(nèi)藥物安全性評(píng)價(jià)，具有以下優(yōu)勢(shì)：藥物用量少、給藥方便、便于觀察和操作、藥物篩選周期縮短、實(shí)驗(yàn)成本低以及可實(shí)現(xiàn)高通量篩選，同時(shí)還方便對(duì)藥物的毒性機(jī)制進(jìn)行研究。斑馬魚(yú)幼魚(yú)是目前為止唯一適合微孔板高內(nèi)涵、高通量和全自動(dòng)化分析的脊椎動(dòng)物模型。除此之外，在以動(dòng)物模型為研究對(duì)象進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)時(shí)，研究人員需要充分考慮動(dòng)物保護(hù)條例等問(wèn)題，但人們通常不將受精120hpf前的斑馬魚(yú)胚胎看成是動(dòng)物個(gè)體^［27］，因此從這一角度看，在藥物早期安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，斑馬魚(yú)與嚙齒類模式動(dòng)物相比，也具有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.斑馬魚(yú)模型在一般毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

一般毒性評(píng)價(jià)包括急性毒性評(píng)價(jià)和長(zhǎng)期毒性評(píng)價(jià)兩部分。早在1984年，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）的指導(dǎo)手冊(cè)就已經(jīng)將斑馬魚(yú)列為實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)類，并應(yīng)用于化合物的急性毒性檢測(cè)。藥物的一般毒性評(píng)價(jià)可以在斑馬魚(yú)的不同發(fā)育階段分別進(jìn)行。將待測(cè)藥物分別定量、定時(shí)作用于斑馬魚(yú)的胚胎、幼魚(yú)和成魚(yú)期，隨后可以在顯微鏡下直接觀察卵黃囊水腫情況、卵凝結(jié)情況、色素形成、尾巴部延展和體節(jié)形成等，且可統(tǒng)計(jì)孵化率、致畸率、死亡率和LD₅₀等數(shù)據(jù)，同時(shí)還可以記錄斑馬魚(yú)主要畸形特征^［28-29］。根據(jù)已有數(shù)據(jù)顯示，利用斑馬魚(yú)胚胎檢測(cè)非致畸化合物的成功率可達(dá)75%，檢測(cè)致畸化合物的成功率更是高達(dá)100%^［30］。

3.斑馬魚(yú)模型在發(fā)育毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

斑馬魚(yú)胚胎透明，體外發(fā)育，最早即是作為模式生物應(yīng)用于發(fā)育遺傳學(xué)領(lǐng)域。在毒理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)巴比妥酸和二乙巴比妥酸等均會(huì)影響斑馬魚(yú)的正常發(fā)育^［31］。在斑馬魚(yú)的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，其很多器官和系統(tǒng)，例如心血管、肝臟、腦、腎臟和軟骨等的形成過(guò)程均對(duì)藥物的介入非常敏感，并且極易產(chǎn)生畸形。斑馬魚(yú)在心血管有嚴(yán)重畸形的情況下還可以存活并繼續(xù)發(fā)育較長(zhǎng)時(shí)間，所以是評(píng)價(jià)藥物發(fā)育毒性的有效模型之一。利用斑馬魚(yú)對(duì)藥物發(fā)育毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，在加藥處理斑馬魚(yú)胚胎后，結(jié)合活體染料、抗體、熒光示蹤等方法，研究者可以直接觀察原腸期的血液循環(huán)、心跳、腦區(qū)形成、體軸形成和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等胚胎發(fā)育事件。

4.斑馬魚(yú)模型在神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

斑馬魚(yú)的神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)非常敏感^［32］，其大腦整體構(gòu)造和血腦屏障的結(jié)構(gòu)與功能均與哺乳動(dòng)物相似^［33］。在胚胎發(fā)育早期，斑馬魚(yú)的血腦屏障即開(kāi)始起作用^［34］。研究發(fā)現(xiàn)，許多在人體中具有神經(jīng)毒性的化合物在斑馬魚(yú)身上同樣起作用。例如維A酸可導(dǎo)致神經(jīng)元氧化和凋亡；乙醇可引起視神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)缺陷；新霉素可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡；戊四唑會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)痙攣，電圖變化、行為變化和分子水平改變均與嚙齒類動(dòng)物痙攣模型相似^［35］。

傳統(tǒng)的利用哺乳動(dòng)物來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)毒性的方法包括行為學(xué)分析、神經(jīng)組織病理學(xué)分析和生物化學(xué)分析等，這些方法均費(fèi)時(shí)費(fèi)力。斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)即可發(fā)育成熟，例如斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至24hpf時(shí)，原代的神經(jīng)元就開(kāi)始分化，48hpf時(shí)腦室形成，隨后到6dpf斑馬魚(yú)的整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)形成。所以利用斑馬魚(yú)可以對(duì)藥物的神經(jīng)毒性進(jìn)行快速、有效的評(píng)價(jià)。研究藥物神經(jīng)毒性時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎加藥處理后，利用微分干涉相差顯微鏡或特殊染色方法可以直接在體內(nèi)觀察特定神經(jīng)元和神經(jīng)突的改變^［36］。由于斑馬魚(yú)具有學(xué)習(xí)、睡眠和藥物成癮等神經(jīng)性行為^［37］，所以可以通過(guò)行為學(xué)分析對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)元的功能進(jìn)行研究。斑馬魚(yú)胚胎或是幼魚(yú)的行為學(xué)分析可以在多孔板中進(jìn)行^［38］，便于觀察和操作。

5.斑馬魚(yú)模型在器官毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

斑馬魚(yú)的各內(nèi)臟器官在基因水平上與人類具有87%的同源性，各個(gè)器官在解剖和分子水平上也已經(jīng)證實(shí)與哺乳動(dòng)物具有一定相似性^［39］。因此斑馬魚(yú)是一種非常理想的藥物器官毒性評(píng)價(jià)模型^［40］。

（1）心臟毒性評(píng)價(jià)：

心臟是斑馬魚(yú)第一個(gè)發(fā)育并發(fā)揮重要功能的器官。心肌收縮、心率和外觀形態(tài)等均是心臟功能的重要參數(shù)指標(biāo)。由于斑馬魚(yú)胚胎和幼魚(yú)透明，因此研究人員均可以在活體斑馬魚(yú)上對(duì)以上各指標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察研究。借助微電極，研究人員還可以同時(shí)記錄斑馬魚(yú)的復(fù)合動(dòng)作電位^［41］。統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)心跳頻率時(shí)，可以將活體胚胎或是幼魚(yú)麻醉，然后通過(guò)人工計(jì)數(shù)或是錄像記錄等方法來(lái)進(jìn)行^［42］。受精后5天的斑馬魚(yú)胚胎可以通過(guò)非侵入的方式進(jìn)行心電圖檢測(cè)，從而了解其心肌是否缺血，心室是否肥厚^［43］。

許多研究已表明，在人體中可影響心臟功能的藥物大多也可對(duì)斑馬魚(yú)心臟造成相似影響^［44-45］。例如特非那定和氯米帕明等藥物，可以引起斑馬魚(yú)心臟收縮性降低，心跳過(guò)緩，循環(huán)減緩等。研究表明，藥物導(dǎo)致的心臟QT間期延長(zhǎng)是由于hERG鉀離子通道阻斷所造成的，在斑馬魚(yú)中也存在著類似的zERG基因^［46］；而且?guī)缀跛幸阎目稍斐尚呐KQT間期延長(zhǎng)的藥物均能造成斑馬魚(yú)心律失常和心動(dòng)過(guò)緩^［47］。

（2）腎臟毒性評(píng)價(jià)：

盡管斑馬魚(yú)的前腎結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，但是加藥處理后，其在腎臟損傷的表型方面與哺乳動(dòng)物非常類似。例如斑馬魚(yú)心臟靜脈竇注射慶大霉素后，會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的形態(tài)異常和腎臟系統(tǒng)功能異常，具體表現(xiàn)為心包和顱內(nèi)水腫、腎小球?yàn)V過(guò)率降低等^［48］；當(dāng)利用順鉑或是嘌呤霉素等腎毒性藥物處理斑馬魚(yú)幼魚(yú)時(shí)，同樣也會(huì)造成腎臟損傷^［49］。

（3）肝臟毒性評(píng)價(jià)：

肝臟是斑馬魚(yú)最大的腺體，48hpf肝臟形態(tài)基本形成，72hpf肝臟的形態(tài)和功能全部發(fā)育完全^［50］。而且在斑馬魚(yú)肝臟中，存在多種與哺乳動(dòng)物同源的脂質(zhì)代謝酶，包括HMG-CoA合成酶、HMG-CoA裂解酶等^［51］；加之斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)的防御機(jī)制類似，均為酶的誘導(dǎo)和氧化應(yīng)激，作用機(jī)制也類似^［52］。同時(shí)斑馬魚(yú)中含有94種細(xì)胞色素P基因，其中18種基因與哺乳動(dòng)物同源^［53］，所以利用斑馬魚(yú)評(píng)價(jià)待測(cè)藥品肝臟毒性時(shí)，同樣可以使用上述傳統(tǒng)的肝臟毒性檢測(cè)指標(biāo)。研究表明，甲丙氨酯具有哺乳動(dòng)物肝臟毒性，將該化合物作用于斑馬魚(yú)，其產(chǎn)生的毒性效應(yīng)與哺乳動(dòng)物類似^［54］。在6種已知的具有哺乳動(dòng)物肝臟毒性和2種不具有肝臟毒性的藥物研究中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)對(duì)藥物肝臟毒性檢測(cè)的準(zhǔn)確率高達(dá)100%^［54］。

除了上述臟器組織的毒性研究外，斑馬魚(yú)還常常用于胃腸組織^［22］、聽(tīng)覺(jué)^［55-56］、視覺(jué)^［57］等組織器官功能的毒性評(píng)價(jià)。

6.斑馬魚(yú)模型在生殖毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

與嚙齒類動(dòng)物不同，斑馬魚(yú)發(fā)育較快，受精72小時(shí)完成孵化，孵化3個(gè)月內(nèi)可達(dá)到性成熟，成年斑馬魚(yú)的繁殖周期一般只有7天左右，并且雌性斑馬魚(yú)一次產(chǎn)卵可多達(dá)200個(gè)^［26］。因此，利用斑馬魚(yú)對(duì)藥物的生殖毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)既經(jīng)濟(jì)又快速。同時(shí)，性腺指數(shù)是一個(gè)常用的評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)性腺功能的生物指標(biāo)，性腺指數(shù)下降表示斑馬魚(yú)的垂體、下丘腦或是性腺活性降低。對(duì)于性成熟的雌性和雄性斑馬魚(yú)而言，產(chǎn)卵量和精子活力及密度分別是評(píng)價(jià)其生殖能力的常用指標(biāo)。研究表明，17β-雌二醇和鉛等均能抑制成年雌性斑馬魚(yú)的產(chǎn)卵量，且具有明顯劑量依賴效應(yīng)；鄰苯二甲酸二丁酯和壬基酚等會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)精子數(shù)量減少、激活率降低、精子壽命及劇烈活動(dòng)時(shí)間縮短^［58］。卵黃生成期的雌性斑馬魚(yú)可分泌雌激素，進(jìn)而誘導(dǎo)卵黃蛋白原的產(chǎn)生^［59］，而雄性斑馬魚(yú)在雌激素或是類雌激素的誘導(dǎo)下，也可以合成卵黃蛋白原^［58］。將待測(cè)藥品作用于斑馬魚(yú)，然后檢測(cè)雄魚(yú)、幼魚(yú)及非卵黃生成期雌性斑馬魚(yú)體內(nèi)卵黃蛋白原水平的改變，可以作為評(píng)價(jià)藥物生殖毒性的一個(gè)靈敏而可靠的方法。許多藥物除了直接對(duì)親代斑馬魚(yú)的生殖系統(tǒng)造成損傷外，還有可能影響其子代的正常生長(zhǎng)發(fā)育。因此利用斑馬魚(yú)對(duì)藥物的生殖毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，通常還需對(duì)子代胚胎的孵化率、畸形率等進(jìn)行分析。

綜上所述，利用斑馬魚(yú)模型對(duì)新藥進(jìn)行早期安全性評(píng)價(jià)，其明顯優(yōu)勢(shì)是可以提高藥物早期毒性預(yù)測(cè)的可靠性和靈敏度、縮短新藥研發(fā)周期、降低新藥研發(fā)成本、提高新藥研發(fā)的成功率。但該模型也存在著一些不足，由于給藥方式主要是將藥物溶解于培養(yǎng)水中，藥物通過(guò)滲透的方式進(jìn)入斑馬魚(yú)體內(nèi)，因此藥物的理化性質(zhì)尤其是在水中的溶解性與分子量對(duì)結(jié)果影響較大，存在著假陽(yáng)性和假陰性的現(xiàn)象，一些脂溶性強(qiáng)和分子量大的藥物目前尚不適合采用該模型進(jìn)行快速評(píng)價(jià)。