第四章　中藥毒理學研究

第一節　急性毒性試驗

中藥毒理研究內容包括急性毒性、長期毒性、特殊毒性、局部毒性和一般藥理學研究，見表4-1。

1.急性毒性試驗的目的和意義

急性毒性試驗是指動物一日內單次或多次（中藥或毒性極低的西藥等在24小時內分2～3次給藥）給藥后在7天或14天（如抗炎藥、抗瘧藥或其他死亡時間拖得較長的藥物）中，連續觀察動物所產生的毒性反應及死亡情況。毒性試驗的觀察應從定性和定量兩方面進行。所謂定性觀察就是觀察服藥后動物有哪些中毒表現、毒性反應出現和消失的速度如何、涉及哪些組織和器官、最主要的可能毒性靶器官是哪個、損傷的性質及可逆程度如何、中毒死亡過程有哪些特征、可能的死亡原因是什么等。所謂定量觀察就是觀察藥物毒性反應與劑量的關系，主要指標有近似致死劑量（approximate lethal dose，ALD）、LD₅₀和致死劑量（lethal dose，LD），以 LD₅₀為主要定量指標（小動物），大動物可用ALD。了解藥物單次或短時間內多次給藥后，動物所產生的毒性反應及其嚴重程度，急性毒性試驗的目的是為臨床安全用藥及監測提供一定的參考。

（1）了解新藥急性毒性的強度：

任何物質達到一定劑量都可能致死。在前面章節里已經談及無毒不成藥。雖然沒有人認為僅根據LD₅₀就可決定毒性大小、分級標準，指標不應是單純一個LD₅₀或LC₅₀，還應考慮不同有毒中藥中毒死亡的起始時間、最長致死時間和平均致死時間，但這些往往被人們所忽略。一般來說，毒性大而快的死亡快，毒性小而慢的則死亡慢，對臨床用藥也有一定的參考價值。急性毒性還應由中毒或發病及可治愈情況等綜合指標作評價。根據中藥特點，我國中藥的毒性分級標準部分參照夏麗英的《現代中藥毒理學》和楊倉良編著的《毒藥本草》，依照中藥臨床中毒癥狀的程度、LD₅₀的大小、有效量與中毒量的距離、劑量的大小、中毒潛伏期的長短等多項指標，對中藥毒性進行分級，見第一章的表1-1，被許多中醫藥專家采用。

（2）計算新藥相對毒性參數：

對有毒中藥來講，LD₅₀越小，毒性越大，對人產生危害的可能性就越大。對藥物來說，用相對毒性參數來衡量更有實際意義。相對毒性參數有治療指數和安全范圍等。相對毒性參數越大，則產生毒性所需的劑量與產生療效所需劑量的比值越大，當然安全范圍就越大。盡管稱為安全系數或可靠安全系數，但仍被稱為不滿意的安全界量系數，這是因為具有同一LD₅₀或ED₅₀的量效曲線，其斜率可能相差很大，有時一個藥的基本有效量（median effective dose 50，ED₅₀）或肯定有效量（median effective dose 99，ED₉₉）也可能在致死劑量的范圍內，這樣便不能滿意地保證安全。究竟安全系數多大才認為安全性較大，這要對具體藥物進行具體分析，而且要根據動物、病情、藥物等情況來綜合考慮，所以急性毒性試驗不只是求出LD₅₀，還應觀察動物的整體反應情況。

（3）為臨床毒副反應的監測提供參考依據：

通過動物急性毒性反應可以了解中毒癥狀、起始時間、持續時間和消失時間等，對死亡的對抗試驗也可為臨床急救措施提供依據，上述對臨床觀察患者用藥后毒副反應的產生有很大幫助。如烏頭類對動物的急性毒性產生的心律紊亂反應，臨床應用時患者產生心律失常就是提示要減量或慎用，同樣臨床需采取相應的搶救措施，保證患者安全治療?？梢姡敿氂^察記錄動物的急性中毒癥狀，不僅有助于對臨床可能產生的毒副反應監測提供參考，也為尋找毒性靶器官提供參考方向。盡管詳細觀察記錄了動物的毒性反應，但也只是供作參考，因為對藥物反應的種屬差異決定了預測價值的局限性。毒理學家對動物毒性反應的種屬差異印象深刻，不僅在質反應方面，在量反應方面也很明顯。經驗認為，一個有毒中藥的毒性在實驗動物中表現出明顯的種屬特異性時，對人的毒性如何也很難作出判斷；反之，如果藥物的毒性反應在實驗動物中種屬差異很小，特別是以體表面積為單位來計算時，種屬之間的差別就更小，如一些抗癌中藥成分，臨床也證明人的中毒劑量與實驗動物很接近。又如青蒿素類在各種已觀察的動物中均可引起明顯的骨髓造血抑制，特別是紅系造血抑制，臨床也證明人也會產生同樣的毒性反應。

有人認為，當不同種屬動物對同一種有毒中藥的毒性反應接近時，可以設想人的反應可能也在近似的范圍之內。當表現出明顯的種屬差異時，選擇首次臨床人用量應特別小心。上述看法有一定道理，但萬萬不能當成規律，藥物千變萬化，作用環節各不相同，對具體藥物只能具體分析，遵循安全第一、循序漸進的原則，從最小劑量進行人體試驗，逐漸增量才是可取的。

（4）為長期毒性、蓄積毒性、特殊毒性及藥效等試驗選擇劑量提供依據：

按藥政管理法規規定，長期毒性試驗的最高劑量必須既能使毒性充分表現出來，又能使大多數動物存活，中劑量應當出現毒性反應，低劑量則要求不出現毒性反應。要選擇好劑量是很不容易的，即使通過預試，也不是輕而易舉的事。在中藥長期毒性試驗中，最高劑量做出毒性反應的例子并不多，原因是很多中藥確實毒副作用小，另外，長期以來在人們認識上有“誤區”，認為中藥長期毒性試驗能做出毒性來不利于報批，所以很多有關的毒性信息反映不出來，值得警惕。長期毒性劑量設計有多種方法，其中有2種是根據急性毒性試驗的結果來設計的，一種是LD₅₀法，另一種是最大耐受量（maximum tolerated dose，MTD）法，劑量設計詳見長期毒性的劑量設計部分（見第四章第二節）。蓄積性毒性劑量設計是用1/10 LD₅₀，然后按等比級數1.5倍逐漸遞增進行的。生殖毒性試驗高劑量的選擇原則，即母鼠的MTD（可以產生輕度毒性反應），可從急性毒性中找出。致突變試驗中的嚙齒類動物微核試驗高劑量是1/2 LD₅₀；果蠅伴性隱性致死試驗的高、低劑量分別為1/2 LD₅₀和1/4 LD₅₀；嚙齒類動物的顯性致死試驗中，高劑量應導致毒性癥狀；精原細胞染色體畸變試驗中，高劑量應為1/2 LD₅₀。動物短期致癌試驗中，高劑量應是MTD。此外，主要藥效學劑量限度、一般藥理學和藥代動力學劑量設計也要參考急性毒性的LD₅₀。

2.急性毒性試驗的技術要求

中藥急性毒性試驗的內容和方法已有很多書介紹過，現就有毒中藥急性毒性試驗的技術要求提出幾點意見，供參考。有毒中藥急性毒性試驗除了遵循實驗設計的三大原則外，還必須注意以下幾方面的問題：

（1）藥物濃度、給藥容量、給藥途徑：

有毒中藥急性毒性試驗一般以不等濃度等容量給藥，特殊情況下可以等濃度不同容量，劑量應以折合生藥量（g/kg）表示，這里應注意單位浸膏（或干粉）所含的生藥量，然后用千克體重所給的浸膏或干粉量×單位浸膏（或干粉）所含的生藥量來折合生藥量（g/kg）。原則上必須和臨床給藥途徑相同。特殊情況下做不到，則應作說明。如肛門栓劑小鼠急性毒性試驗，因藥學原因及生理條件無法進行時，則要交代清楚，以最大濃度、最大允許量單次給予或用別的途徑給予。灌胃一般宜空腹12～16小時，日本為4～6小時，也有學者認為禁食1小時以上，按慣例以空腹12～16小時居多。禁食時間對測定LD₅₀影響很大，有研究表明，給大鼠灌胃NaCl的LD₅₀，禁食時為3.8g/kg，不禁食為6.4g/kg，相差近1倍。中藥或復方制劑所采用的助溶劑為水溶性或采用0.2%～0.5%羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）混懸液進行灌胃給藥，很難制成真溶液，因此限制了給藥量，特別是腹腔注射問題較多，很多人將中藥或復方的水提物不作任何處理直接腹腔注射測定LD₅₀，這種做法很不科學，腹腔注射的制劑應與靜脈注射制劑要求相似，急性毒性試驗不同動物給藥途徑及常用容量和最大容量，詳見表4-2。

（2）中毒癥狀要詳細記錄：

對中毒癥狀要作詳細記錄，這在許多有關急性毒性試驗內容的書及試驗者中往往被忽略。試驗中尤其是對中毒和死亡發生時間、中毒癥狀、持續時間和恢復時間應作詳細記錄，如果注射以后不及時進行觀察，到第2天，甚至更長時間才觀察，此時也許動物已全死亡。試驗者要有一定的倫理意識，重視每一個生命個體在試驗中提供的毒性信息及對人類科學試驗所作的貢獻。試驗資料僅提供一個LD₅₀是不夠的，它只是一個定量的指標，還應有定性指標及可逆性與否等，一個完整的急性毒性試驗報告應既有LD₅₀，還應有定性指標的報告。

（3）嚴格控制實驗室環境條件：

試驗最好在GLP條件下進行。若不具備GLP條件，應在實驗觀察室適應2～3天，室溫（20±3）℃，相對濕度30%～70%，人工照明12小時，通風應良好，籠具應清潔，飼料及用水應新鮮，否則均會對實驗結果有影響。如苯丙胺在15.5℃時測定的LD₅₀為197mg/kg，在27℃時為90mg/kg，相差約1倍；去氧麻黃堿在15.5℃時測定的LD₅₀為111mg/kg，在27℃時為33mg/kg，相差3倍以上。中藥及中藥復方急性毒性試驗條件控制的研究報告不多，今后應加強。群居小鼠和獨居小鼠對LD₅₀測定也有影響，尤其是興奮藥，在狹小空間群居造成溫度升高引起的相互刺激使毒性增加明顯。動物房氨濃度應控制在20ppm以下，或藥理毒理人員進去不感到刺鼻，無異常感。若氨濃度 ＞ 200ppm，藥理毒理人員無法進去，則肯定易誘發動物生病，長期毒性試驗時則更明顯。所以鼠籠若以木屑墊底，木屑應消毒，最好每天更換，最長不超過3天，飲水每天更換。每天上下午通風（抽氣）至少半小時。

（4）劑量選擇：

劑量設計是否合理是實驗成功與否的關鍵，一般先“撒大網”，即用少量的動物（雌雄各2只）求出不死和全死的劑量或10%死亡及90%死亡的劑量（雌雄各5只），然后根據有毒中藥的毒性大小決定組距，一般分4～6組。大動物則用6條犬左右，用50%劑量遞增，且間隔一個劑量用藥，尤其是對毒性大而猛烈的有毒中藥則更容易處理。

（5）試驗周期：

給藥后至少觀察2周或更長。時間太短結果往往不可靠。進行急性毒性試驗時僅觀察24小時，這樣短的時間內往往看不到神經系統的毒性，有些有毒中藥從得出的LD₅₀看也認為毒性不太大，但在做臨床試驗時，往往容易出危險。

（6）最大給藥量（MTD）：

有些有毒中藥毒性較低，測不出LD₅₀，則可測其最大給藥量。采用擬推薦臨床試驗的給藥途徑，以動物能耐受的最大濃度、最大容量，1次或1日內連續給藥2～3次（間隔6～8小時）。如用小鼠測試，動物數不得少于20只，雌雄各半，連續觀察14天，對神經系統有毒性的中藥可連續觀察14天，詳細記錄動物的反應。動物體重變化是主要客觀指標，給藥前、后應定期測量并記錄，所得結果應列表進行統計分析。為此，試驗時應設空白對照組，與給藥組進行對比分析。還應計算總給藥量（g/kg，按生藥量折算），并推算出相當于臨床日用量的倍數，綜合評價受試藥物毒性大小。

3.急性毒性試驗中的LD₅₀計算方法及意義

急性毒性試驗中的LD₅₀計算方法有白侖法（又稱累計法）、米勒和滕特爾二氏法［又稱目測法、概率法（對數概率單位繪圖法，1944年）］、寇氏法（又稱克貝爾法）、點斜法（孫瑞元改良寇氏法，又稱綜合計算法）、改良寇氏法（顧漢頤改進寇氏法）、韋爾法（又稱概率單位法）、Bliss法、Bliss-Finney法（改進Bliss法，又稱概率單位加權回歸法）、序貫法（又稱上、下法或階梯法）、李其飛爾德和維爾可松法（即圖解法，1947年）、何爾恩法（改良維爾法即簡化概率單位法）、簡單回歸法、加權近似法、移動平均法［Thompson（1947）及 Weil（1952）法］。

其中比較常用的有Bliss-Finney法、點斜法、改良寇氏法、何爾恩法，前兩種方法較準確。現在因計算機已經普及，Bliss-Finney法是目前首推使用的LD₅₀計算方法。其實，測定LD₅₀準確與否關鍵在于動物選擇、藥物稱量配制、給藥的熟練程度及預試驗，至于用何種方法計算，不是根本問題。每一種計算方法在各種藥理學試驗方法中都有介紹，這里不再一一贅述。

隨著對動物毒性試驗認識的不斷深化，經驗日益豐富，以及西方國家動物保護主義者要求減少實驗動物的痛苦及消耗的壓力不斷加強，再加上中藥新藥開發研究消耗資金的不斷上升，制藥工業界和毒理學界對藥政管理法關于LD₅₀的測定問題提出不同看法。如1981年，國際毒理學界以LD₅₀和急性毒性試驗為專題而召開的學術討論至少有兩次，主要傾向是反對把經典的LD₅₀測定列為一切新藥安全評價的常規，反對把LD₅₀視為藥物的生物學常數。1995年在東京召開的國際GLP協調會議就提出不測LD₅₀也可以，主張以盡可能少的動物獲得盡可能多的急性毒性信息。理由如下：

（1）消耗大量的動物：

測定一個藥物一種給藥途徑，一次實驗需消耗100只左右（含預試）。Rowan 1983年報告，英國在1977年中，僅測定LD₅₀所用的動物數為23萬只，占毒性試驗動物總消耗量的23%，占全部實驗動物總消耗量的4.26%。他估計全世界每年單用于測定LD₅₀的動物達500萬～1 000萬只。我國若按100個研究單位計算，每年將消耗40萬～50萬只小鼠。

（2）僅能獲得有限信息：

由于經典LD₅₀測定耗用動物多，無法對每只動物做詳細觀察。實際上藥物單次劑量急性中毒，動物多死于中樞神經系統及心血管系統功能障礙，并不能很好地顯示出各自的毒性作用特征。再者，急速死亡，各種器質性變化尚未來得及發展，不能顯示出靶器官的病變。如鹵代甲烷對小鼠的急性毒性試驗，碘代甲烷（CH₃I）對肝臟毒性很大，比CCl₄和CBr₄均大，但動物死于麻醉和急性循環衰竭，而肝損害卻表現不出來。相反，毒性較小，致死較慢的CCl₄和CBr₄對肝臟毒性表現明顯。

（3）測得的LD₅₀并不精確：

由于許多因素影響測定LD₅₀，所以實際上LD₅₀并不很精確，甚至有的藥物因不同國家、不同實驗室測定的結果波動很大，后雖經統一實驗條件，波動有所縮小，但仍有較大差別。可見，用經典法測LD₅₀不夠精確，僅供參考。中藥的LD₅₀測定問題也不少，如制劑本身及種類對測定LD₅₀影響很大，由于很多中藥或方劑中含有大量的蒽醌類等物質，對腸胃道刺激性很大，動物往往因給藥量大死于腸脹氣，而其他毒性靶器官損傷很難觀察到。