第四節　基因（組）變異解讀

一、鑒別遺傳性疾病

雖然大部分出生缺陷、先天畸形、罕見病等具有相當高比例的遺傳因素，但致病原因還包括許多非遺傳因素，如感染、環境毒理、飲食及化學物暴露等可直接致病，也可通過和遺傳易感因子互作致病。在臨床上鑒別由單一基因及基因組變異引起的遺傳性疾病能提高基因檢測的臨床診斷率，從而間接地降低疾病診斷的成本及縮短醫療周期，因此應受到重視。但要做好這個鑒別不容易，要綜合考慮許多因素，臨床醫生需要對先癥者的家族史、孕史（特別需要了解孕期用藥、化學物暴露、感染及吸煙酗酒等情況）、家庭社會生活環境全面的了解。盡管許多遺傳病有先天性畸形，但并不是先天性畸形就是遺傳性疾病。識別非遺傳性先天畸形罕見病，如胎兒酒精綜合征、海豹肢畸形（由沙利度胺引起）、母源性苯丙酮尿癥、寨卡病毒引起的小頭畸形、物理性損傷導致的結構畸形等均是臨床醫生需要掌握的基本能力。

多于一個家庭成員（特別是一級親屬），發生多發性流產、死胎和兒童死亡中出現相同的病癥時強烈表明有遺傳性疾病。在相對年輕的兩個或更多個親屬中發生常見的成人病癥（心臟病、癌癥、癡呆）家族史也表明有遺傳傾向。一些相對常見的臨床癥狀，如發育遲緩/智力落后和先天性多發性畸形已知有較強的遺傳因素。通常涉及心臟、面部及生長問題的情況，特別是如果患者同時表達可能為綜合征的多個臨床特征，如智力遲鈍和心臟缺陷，同時有幾個臉面部異常表型，如眼距寬或眼瞼下垂等也提示有患遺傳病的可能。當不能確認時，請遺傳學醫生進行會診評估會有幫助。

完整準確地評估臨床表型并用統一的標準術語描述記錄對于罕見疑難疾病的診斷尤其重要，因對大量基因組變異的分析在很大程度上依靠對基因型-表型相關性的了解。為更好地做好臨床表型描述，臨床醫生可以從遺傳疾病知識庫（如OMIM、Orphanet、PubMed等）中獲得基因、疾病表型等相關知識。

二、選擇合適的基因檢測方法

遺傳病的種類繁多，其突變種類也很多，不同的突變需要用不同的檢測手段才能事半功倍。對基因組疾病，傳統的染色體芯片能夠快速、準確地檢測出全基因組范圍內的染色體失衡（增加或缺失），特別是自定義高密度芯片能檢測出比單外顯子還小的拷貝數變異，它在基因組疾病及單基因變異檢測中仍然有很大的價值，但隨著測序成本的持續下降，WGS能最終替代一般染色體芯片的檢測功能，并且擴展到檢測非失衡型結構變異如平衡易位、倒位等。對于許多罕見遺傳病，特別是與代謝障礙相關的疾病，生化檢測一直是特異有效的檢測手段，這一技術應用在新生兒的罕見病篩查上充分體現其經濟有效和準確快速等優勢，對人體代謝譜的分析也正迅速地成為一項常規的臨床檢測項目，其與分子檢測的互補性尤其突出。這一領域在高級質譜技術及大數據分析技術的帶引下將得到長足的發展。

目前，NGS主要對絕大多數罕見病做分子（主要是DNA及RNA水平的）檢測。基于NGS的分子檢測可以根據檢測對象的多少分成單基因（single gene）、基因包（gene panel）、臨床外顯子（clinical exome）、全外顯子組（whole exome）及全基因組（whole genome）的檢測。在NGS時代，單基因的檢測仍很有必要，甚至是必需的，主要應用于以下情況：①臨床能明確診斷，致病基因單一的疾病，如神經纖維瘤Ⅰ型（neurofibromatosis typeⅠ）；②致病基因的變異不能為NGS所檢測，最常見的包括脆性X染色體FMR1基因中CGG的擴增檢測，普瑞德威利-天使綜合征（PWS-AS）的甲基化分析等；③NGS結果的驗證及對其他家屬成員的檢測往往使用單基因/位點即可。基因包的檢測用于臨床有特異表型但遺傳異質性較強，需要做分辨診斷的病種較為合適，如肌肉萎縮癥（muscular dystrophy）、心肌病（cardiomyopathy），基因包的臨床功效在很大程度上取決于臨床醫生對病種的臨床診斷的把握，也取決于已知致病基因能解釋這類疾病的比例。因新基因不斷被發現，基因包也需不斷地更新。臨床外顯子理論上應當包含所有已知的致病基因，但實際上沒有做到，也做不到。一是因為發現新致病基因的速度很快，二是許多曾經認為的致病基因不是或還未得到確鑿的證據支持其為致病基因。而全外顯子組包含絕大部分編碼的區域，但實際內容因公司產品設計不同有很大差別，再加上在測序過程中總有一些區域的覆蓋度不夠，一部分基因及區域存在高度同源序列和重復序列，目前NGS技術暫未突破這一難關，所以全外顯子組總是不全的，這和WES已經取得的臨床功效相比，只是一個小小的不足，且將會不斷的改進完善。WES除了能檢測已知遺傳病的序列變異外，新近發現的致病基因也會得到檢測，同時還有機會發現新的候選致病基因。因此，有條件時對臨床表型復雜、臨床表型不特異、臨床診斷不明或因患者臨床表型還沒有展示（如剛出生重癥監護室的新生兒）的病例而言，WES是理想的檢測手段，也是發現新致病基因的有效策略。目前，WGS已經開始常規性地被用到拷貝數變異（CNV）的分析上，其覆蓋度很低（如0.1X）也能檢測出全基因組范圍內的CNV，且成本不超過目前一般的染色體芯片，但WGS并沒有常規用于序列變異的檢測，因要檢測序列變異，覆蓋度要達到30X，這就造成測序的高成本。我們寄希望于新的測序技術終將把我們帶入WGS的時代，有機結合全外顯子組合中低覆蓋度WGS能夠滿足檢測各種變異的需求。

三、基因（組）變異的解讀

目前高通量NGS技術正被越來越廣泛應用于遺傳性疾病的臨床分子診斷，但NGS會產生海量的數據，如何在龐大的數據中分析出可靠、有意義的結果，如何正確、合理解讀基因（組）變異，使之在臨床診療中能夠有效應用已成為目前最為棘手的問題。美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定了基因變異解讀指南，建議使用特定標準術語來描述孟德爾疾病（單基因）相關的基因變異，即將變異的臨床意義分為五級分類：致病性（pathogenic），可能致病性（likely pathogenic），臨床意義不明（variant of undetermined significance，VUS），可能良性（likely benign）和良性（benign）。

該指南提供了兩套標準：一是用于對致病或可能致病的證據進行分類（表2-1），二是用于對良性或可能良性的證據進行分類（表2-2）。這些變異的證據包括人群數據庫頻率、基因變異的類型、基因的功能學研究、以往病例報道、家系成員分離度及計算機功能預測等。致病變異證據可分為非常強（very strong，PVS1）；強（strong，PS1～4）；中 等（moderate，PM1～6）；或 支 持 證 據（supporting，PP1～4）。良性變異證據可分為獨立（stand-alone，BA1）、強（strong，BS1～4）或 支 持 證據（BP1～7）。其中，數字只是作為有助于參考的分類標注，不具有任何意義。每個類別中的數字不表示分類的任何差異，僅用來標記以幫助指代不同的規則。對于一個給定的變異，分析人員基于觀察的證據來選擇標準。根據表2-3的評分規則把標準組合起來進而從5級系統中選擇一個分類。

這些規則適用于目前所有的基因（組）變異，無論是基于調查現有案例獲得的數據，還是來源于先前公布的數據。分析基因（組）序列變異的臨床意義不是一個簡單或直接的過程，以前報告的致病變異可能不一定是真的致病性變異，因此變異的臨床意義應基于最新的證據進行分析。一些以前分析過的變異在一段時間后或有新的證據出現后需要重新分析，所以這是一項持續性的工作。

（王　劍）