第三節　常用的基因篩查技術

一、染色體核型分析

染色體核型分析是指將待測細胞的染色體依照該生物固有的染色體形態結構特征，按照一定的規定，人為地對其進行配對、編號和分組，并進行形態分析的過程。其基本原理是不同物種的染色體都有各自特定且相對穩定的形態結構（包括染色體的數目、長度、著絲點位置、臂比、隨體大小等）。染色體經染色或熒光標記后，通過一定的光學或電化學顯色設備就可以清晰而直觀地觀察其具體形態結構，與正常核型進行對比尋找差異，進而確定染色體的數目，以及判斷是否出現缺失、重復和倒置等現象。傳統的染色體核型分析技術主要為染色體顯帶技術，是利用Giemsa染料通過特殊的染色方法使染色體的不同區域著色，使染色體在光鏡下呈現出深淺交替的帶紋，即為染色體帶型。每條染色體都有特定的帶型。根據染色體的不同帶型，可以細致而可靠地識別每條染色體。如果染色體帶型發生變化，則表示該染色體的結構發生了改變。目前常用的染色體顯帶技術有G顯帶（最常用）、Q顯帶、R顯帶、T顯帶（末端顯帶）、C顯帶（著絲粒顯帶）等。

臨床應用與評價：染色體數目和結構上的異常被稱為染色體異常，由染色體異常引起的疾病稱為染色體病。目前發現的染色體病已有100多種，如21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、特納綜合征、精曲小管發育不全、貓叫綜合征、脆性X染色體綜合征等。染色體病在臨床上可導致唐氏綜合征、先天性多發性畸形及癌癥等；在早期自然流產時，50%～60%是由染色體異常所致。染色體核型分析的目的就是發現染色體異常，診斷染色體病，將其應用于產前診斷可降低染色體平衡易位、倒位等導致的畸形胎兒的出生率，同時可對不孕癥、多發性流產、畸胎等孕產史的夫婦和多發畸形等患者進行遺傳學診斷。

二、染色體基因組芯片技術

染色體基因組芯片，又稱DNA芯片、DNA微陣列、寡核苷酸陣列，是生物芯片技術中實用性最強、最先投入應用的技術之一。基因芯片技術是結合微電子學、物理學、化學及生物學等高新技術，以大量人工合成或應用常規分子生物學技術獲得核酸片段作為探針，采用原位合成或合成點樣方法將探針密集、規律地或按特定的排列方式固定在硅片、尼龍膜、塑料或玻璃等支撐載體上，形成致密、有序的DNA分子點陣。其主要原理是核酸分子雜交技術，即利用核酸分子堿基之間互補配對的原理，將處理好的樣品與固定到固體支持物上的核苷酸進行雜交，通過激光共聚焦掃描及分析軟件，以實現對待測樣品的大規模檢測。

臨床應用與評價：相比傳統核酸印跡雜交技術，染色體基因組芯片具有快速、準確、靈敏、信息量大，可同時檢測多種疾病、操作簡單、重復性強等明顯優勢，故在遺傳性疾病診斷和出生缺陷檢測領域具有非常重要的應用價值。目前，基因芯片技術在臨床上的應用主要有兩種技術形式，一種是比較基因組雜交芯片（array-based comparative genomic hybridization，aCGH），其基本原理是將受檢者樣本基因組DNA與正常對照樣本基因組DNA用限制性內切酶酶切片段化后，分別標記上不同顏色的熒光，同時與芯片上固定探針進行競爭性雜交，通過芯片掃描和數據分析，獲得受檢者樣本的基因組拷貝數變化情況和染色體異常情況。另一種是單核苷酸多態性微陣列芯片（single nucleotide polymorphism array，SNP array），其基本原理是將大量的SNP檢測探針用特殊方法固定在硅芯片上，獲得高密度的SNP微陣列，將受檢者樣本基因組DNA和芯片上的探針進行雜交，通過單堿基延伸在探針的3'末端摻入不同熒光標記的雙脫氧核苷酸，通過熒光信號掃描和相關軟件，分析受檢者樣本的拷貝數變化及基因型等。與aCGH技術相比，SNP芯片除了能檢測拷貝數變異外，還能夠檢出雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）和一定比例的嵌合體。需要指出的是，SNP芯片檢測拷貝數變異的準確性不如aCGH芯片。目前已有兼具aCGH芯片檢測探針（用于拷貝數變化檢測）和SNP芯片探針（用于檢測SNP）的芯片，可同時對受檢者樣本進行準確的拷貝數分析和雜合性缺失分析。

aCGH芯片和SNP芯片等染色體基因組芯片可在全基因組范圍內同時檢測多種染色體不平衡導致的疾病，其臨床應用指征包括不明原因的智力落后和/或發育遲緩、非已知綜合征的多發畸形及孤獨癥譜系障礙等。與常規染色體核型分析相比，染色體基因組芯片技術無需細胞培養，通量高，分辨率高出近千倍，可用于幾乎任何組織的DNA分析，可為臨床醫生提供更詳細和明確的染色體檢查結果。需要注意的是，染色體基因組芯片技術也具有一定的局限性，無法檢測平衡易位、倒位、復雜重排等染色體結構性變異，不能檢測低水平嵌合（＜ 10%）及點突變、小片段插入/缺失等。

三、Sanger測序（一代測序）

Sanger測序技術，也稱第一代測序技術，該技術始于1977年美國生物化學家Frederick Sanger發明的雙脫氧末端終止法以及Maxam和Gilbert發明的化學裂解法。其基本原理是一個DNA聚合反應，以待測單鏈DNA為模板，與模板的起始序列互補的引物與DNA模板特異性結合后，4種脫氧核苷酸dNTP在DNA聚合酶作用下延伸引物，從而合成與模板互補的新的DNA鏈。在這個反應體系中，除了4種dNTP，還引入了一定比例的帶不同熒光標記的雙脫氧核苷酸ddNTP。由于保留了5'-OH基團，ddNTP可以被聚合酶結合摻入到DNA鏈當中和上一個dNTP的磷酸基團形成磷酸二酯鍵，但因缺乏3'-OH，無法和下一個dNTP的磷酸基團形成磷酸二酯鍵，所以DNA鏈的延伸就此終止。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的核苷酸上。測序產物是長度相差一個堿基的一系列片段，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后通過高分辨率聚丙烯酰胺凝膠毛細管電泳分離大小不等的片段，并通過熒光標記識別片段末端堿基，從而獲得所測片段的堿基序列。

臨床應用與評價：Sanger測序技術測序讀長相對長、準確性高，測序結果直觀可視，不用建庫因而假陽性結果極低，是目前檢測DNA序列的金標準。但其也有明顯的臨床應用缺陷，如靈敏度較低、通量小、成本相對高。在目前高通量測序已經日趨成熟的時代，Sanger測序技術進行遺傳學診斷和產前診斷的應用價值主要在于那些臨床診斷比較明確（如對新生兒篩查PKU陽性的嬰兒做PAH基因的檢測），遺傳及位點異質性不強的疾病（如臨床診斷或家族史提示囊性纖維化的患者做CFTR基因的檢測），特別是有變異熱點的基因（如對軟骨發育不全的患者進行FGFR3基因1 138位點的測序進行目標性的檢測）。Sanger測序目前也已應用于腫瘤診斷、病情監測、預后和治療等臨床實踐中。如對BRCA基因或APC基因的檢測分析，可用于早期發現乳腺癌或結腸癌的易感人群，從而對這些人群采取必要的干預措施。Sanger測序還可以對腫瘤靶向治療藥物相關基因的突變位點進行檢測，如在非小細胞肺癌的治療中，使用靶向藥前必須要檢測EGFR基因的狀態，可以針對EGFR基因突變熱點所在幾個外顯子設計特異性擴增和測序引物進行直接測序。Sanger測序不僅適用于對家族其他成員進行已知家族性特異變異的檢測，還是高通量測序基因檢測篩選單基因遺傳病家系致病基因后進行家系內和正常對照組驗證的主要手段。

四、高通量測序技術

高通量測序技術即NGS，是對傳統一代測序技術的革命性改變，相比于第一代測序的通量提高了成千上萬倍，甚至上億倍。該技術主要基于邊合成邊測序或邊連接邊測序的基本原理，一次實現對數百萬個DNA分子同時測序；也可實現對一個物種的基因組和轉錄組進行深入細致的全貌分析，因而又被稱為深度測序。目前市場上的高通量測序儀主要包括具有不同通量、讀長及研究適配的測序儀器。測序時應根據檢測的樣本量和質量要求，確定適宜的測序平臺與方案，以保證測序數據能夠滿足質量及靶向區域覆蓋度等需求。相較于傳統的Sanger測序，高通量測序技術在原理、操作細節、技術擴展方面有著巨大優勢。

臨床應用與評價：與一代測序相比，高通量測序的獨特優勢在于：①大規模平行測序，通量高；②有定量功能，即樣品中某種DNA被測序的次數反映了樣品中這種DNA的豐度，可對基因組拷貝數進行分析；③成本低廉，單堿基測序費用較Sanger測序急劇下降。NGS技術對同時涉及多個基因、多種變異類型，以及罕見變異的出生缺陷和遺傳性疾病的分子診斷具有非常明顯的優勢，在鑒定疾病致病基因方面也非常有效。

NGS技術按其復雜程度由低到高、檢測對象由少到多可分為三個不同的分析水平，即疾病靶向基因包panel測序、WES及WGS。疾病靶向基因包測序主要用于以下幾個情況：①具有很大遺傳異質性的臨床表型，如耳聾基因包；②需要進行分辨診斷的臨床表現類似的疾病，如心肌病基因包；③不同疾病共享一種臨床表現的情況，如癲癇基因包；④同一個信號轉導系統里面的基因，如Rasopathy基因包檢測努南綜合征。由于其只檢測部分基因，測序深度高，因而分析的靈敏度和特異度較高，且因針對已知的致病基因進行測序，故結果解釋相對容易。WES是一種針對基因組中所有編碼區域的測序方法。外顯子組雖然只占基因組的1%～2%，但目前發現約85%的致病突變位于外顯子。WES除了能檢測已知疾病相關基因突變外，新近發現的致病基因也會得到檢測，同時還能發現新的候選致病基因，是臨床表型復雜/不特異、臨床診斷不明的病例，以及尚未出現臨床表型病例的理想檢測手段，也是發現新致病基因的有效策略。WGS測序同時覆蓋編碼和非編碼區域，其測序樣品制備簡單，不需要靶區域的PCR或雜交富集。由于目前對于非編碼區域的變異解釋尚不理想，所以通常先對編碼區進行分析，如果編碼區未發現致病突變，則可對數據進行重新分析，尋找非編碼區域的調控序列是否發生變異。此外，WGS數據也可用于拷貝數變異（copy number variation，CNV）、AOH 及平衡易位等結構變異的分析。目前因WGS測序成本比較高，且WGS測序產生的數據龐大，數據分析復雜，因此WGS應用于臨床檢測尚不成熟。

五、其他遺傳學技術

（一）多重連接探針擴增技術

多重連接探針擴增技術（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）于 2002 年由Schouten等首先報道，是近幾年發展的一種針對待檢DNA序列進行定性和半定量分析的新技術。MLPA是多重PCR的一種形式，該技術針對特定基因組靶區域設計多個長度不等的寡核苷酸探針對，利用探針對外側的通用引物對，同時擴增多個基因組靶區域，擴增信號的強度反應靶區域的量（即為拷貝數）。MLPA可分為5個主要步驟：DNA變性和MLPA探針雜交；連接反應；PCR反應；電泳分離擴增產物；數據分析。在第一步中，DNA變性后與MLPA探針混合液孵育過夜。MLPA探針由兩條單獨的寡核苷酸構成，每條均含有一段PCR引物序列。兩個探針寡核苷酸直接雜交到鄰近目標序列。只有當兩條探針寡核苷酸都雜交到鄰近目標區域的時候，它們才能在連接反應中被連接起來。只有連接起來的探針才能在接下來的PCR反應中以指數方式擴增，探針連接產物的數量是樣本中目標序列數量的量度標準。用毛細管電泳將擴增產物進行分離。只有當連接反應完成，才能進行隨后的PCR擴增并收集到相應探針的擴增峰，如果檢測的靶序列發生點突變或缺失、擴增突變，那么相應探針的擴增峰便會缺失、降低或增加，因此，根據擴增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數的異常或點突變存在。

臨床應用與評價：MLPA的主要用途是對目標區域的基因序列拷貝數進行檢測，可經濟、高效、快速地檢測一些已知基因組拷貝數變異的常見遺傳病，如1p36缺失綜合征、威廉姆斯綜合征、史密斯-馬蓋尼斯綜合征、米勒-迪克爾綜合征、迪格奧爾格綜合征等。另外，臨床疑似脊髓性肌萎縮的患者，實驗室檢測首先考慮用針對SMN1、SMN2基因的MLPA檢測，因95%以上的脊髓性肌萎縮是由SMN1基因7、8號外顯子缺失所導致。MLPA還可以對由表觀遺傳異常導致的疾病，如普拉德-威利綜合征或快樂木偶綜合征進行甲基化檢測（MS-MLPA）。

（二）熒光原位雜交

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術，以熒光素取代放射性核素標記探針而形成的一種新的原位雜交方法，以檢測分裂中期染色體或間期染色質數目和結構。其基本原理是利用特殊標記的DNA（或RNA）探針，與中期染色體直接雜交，再與熒光素分子偶聯的單克隆抗體特異性結合，對染色體DNA序列進行定性、定位和定量分析，以鑒定染色體的數目和基因組結構是否異常。

臨床應用與評價：FISH技術具有穩定、實驗周期短、特異度好、定位準確等特點。在遺傳病診斷和產前診斷領域，FISH仍是篩查染色體病的主要方法之一，主要用來篩查染色體非整倍體特別是13、18、21、X和Y染色體的數目異常，以及染色體結構異常包括微小缺失、微小重排等。FISH可利用未培養的羊水間期細胞進行染色體異常檢測，不僅能夠克服傳統的羊水細胞遺傳學診斷無法克服的局限性，如取材時間有限、耗時時間長、結果取決于中期分裂象多少等，還排除了因培養造成的假嵌合體現象。FISH可利用絨毛樣本對染色體病進行早期產前診斷，相比常規染色體分析，FISH所分析的細胞數目及細胞來源（來自絨毛不同組織）較多，增加了診斷的可靠性，同時能得到更多的數據來做出正確的統計分析。FISH技術也可以應用于胚胎植入前遺傳學診斷PGD中，以鑒定胎兒的性別，排除性染色體連鎖疾病的發生；檢測染色體的非整倍性和染色體結構畸變，大大降低了妊娠自然流產和患兒出生的概率。