第五節　溶血性貧血

溶血性貧血（hemolytic anemia，HA）是指由于某種原因導致紅細胞病理性破壞增加，壽命縮短，骨髓代償能力不能補償所引起的一類貧血。溶血性貧血屬于增生性貧血，骨髓對貧血的刺激有強大的代償功能，可增加到正常的6~8倍，故本病是以紅細胞的破壞增加和紅細胞生成活躍同時并存為特征的一組疾病。

按溶血的場所分為血管內溶血（紅細胞主要在血液循環中破壞）和血管外溶血（紅細胞主要在組織巨噬細胞胞質中被破壞）；根據發病機制將溶血性貧血分為遺傳性和獲得性兩大類。血管內溶血多是由于紅細胞內在缺陷，紅細胞在血管內被直接破壞，血紅蛋白進入血漿，臨床以血紅蛋白血癥和血紅蛋白尿為主要特征，遺傳性多見。血管外溶血多由于外在溶血因素所致，紅細胞被單核吞噬細胞系統破壞，血紅蛋白不直接釋放進入血漿而是通過色素代謝變成膽紅素，臨床上以高膽紅素血癥和肝、脾腫大為主要特征。遺傳性溶血性貧血多由于紅細胞內在的缺陷（包括膜、酶、血紅蛋白合成異常）所致，而G6PD缺乏癥當外在因素不存在時多不發病；獲得性溶血性貧血多由紅細胞外在缺陷（包括免疫因素、藥物因素、生物因素、物理因素等）所致，但陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）例外，它是獲得性的以紅細胞內在缺陷為特征的溶血性疾病。

由于溶血性貧血是非常復雜的一類綜合征，其病種繁多，發病機制和病因各異，對其進行診斷和鑒別診斷都較困難。一定要明確溶血的病種，通過實驗室的檢查可對不同的溶血性貧血進行診斷和鑒別診斷。免疫相關溶血性貧血（immune hemolytic anemia）的內容見第二十一章。

一、實驗室分析路徑

溶血性貧血可為紅細胞內在缺陷和紅細胞外在因素所致，按病因學分類可分為紅細胞膜缺陷、紅細胞酶缺陷、血紅蛋白異常及紅細胞外在缺陷等，實驗室分析路徑見圖1-5、圖1-6。

二、相關實驗

溶血性貧血的血液學特征表現為骨髓造血活動的增強以及紅細胞破壞的增加，診斷溶血性貧血的病因時應將全血細胞計數和后續的病因診斷實驗結果進行分析，尤其是紅細胞形態學檢查，對溶血性貧血的鑒別診斷具有重要意義。溶血相關實驗主要分為顯示溶血的檢測及紅細胞膜、紅細胞酶、血紅蛋白異常的相關病因診斷實驗等。

1.顯示溶血的相關檢測

（1）血漿游離血紅蛋白檢測：

利用血紅蛋白具有類過氧化物酶活性的特點，采用過氧化物酶法檢測血漿游離血紅蛋白（plasma free hemoglobin）。正常參考范圍為0~40mg/L。正常情況下，血漿中游離血紅蛋白極微，且大部分與結合珠蛋白結合，僅有微量游離血紅蛋白。血管內溶血性貧血時，血漿游離血紅蛋白明顯增高。

（2）血清結合珠蛋白：

血清結合珠蛋白（haptoglobin，Hp）可與血漿中游離的Hb結合形成復合物，此復合物在單核-吞噬細胞系統和肝內被消除。溶血時血漿中增加的游離血紅蛋白與Hp結合，消耗血清中結合珠蛋白使其含量減少，測定血清中結合珠蛋白的含量可反映溶血的情況。臨床上常用的檢測Hp的方法有電泳法、比色法、速率散色比濁法等。電泳法正常參考范圍（164名健康成人的測定結果）為，血清Hp含量為（742±420）mg Hb/L。其中男54人，Hp含量（742±360）mg Hb/L，女110人，Hp含量（726±372）mg Hb/L。

（3）血漿高鐵血紅素白蛋白檢測：

血漿中游離的血紅蛋白可被氧化為高鐵血紅蛋白，再分解為珠蛋白和高鐵血紅素，后者先與血中的血紅蛋白結合，血紅蛋白消耗完后，高鐵血紅素與白蛋白結合形成高鐵血紅素白蛋白（methemalbumin）。正常人呈陰性，血管內溶血時，血漿中游離血紅蛋白大量增加，血漿中可檢測出高鐵血紅素白蛋白。

（4）尿含鐵血黃素試驗：

又稱Rous試驗，當血紅蛋白通過腎小球濾過時，部分鐵離子以含鐵血黃素的形式沉積于上皮細胞，并隨尿液排出。正常人為陰性。慢性血管內溶血時本試驗為陽性。

（5）紅細胞形態：

溶血性貧血患者外周血紅細胞形態主要以裂紅細胞增多為主，可見淚滴紅細胞，橢圓形紅細胞，球形紅細胞、嗜堿性點彩紅細胞等，異形紅細胞比例可高達50%。

2.診斷紅細胞膜缺陷的檢測

（1）紅細胞滲透脆性試驗及滲透脆性孵育試驗：

本試驗檢測紅細胞對不同濃度低滲鹽溶液的抵抗力。紅細胞抵抗力大小取決于紅細胞表面積與體積的比值，比值愈小，紅細胞抵抗低滲鹽溶液的能力愈差，滲透脆性增加；反之抵抗力增大，滲透脆性減低。而經24h 37℃孵育消耗紅細胞的ATP和能量，再觀察紅細胞在不同濃度的低滲鹽溶液中溶血情況為孵育后脆性。正常情況開始溶血：3.8~4.6g/L NaCl溶液，完全溶血：2.8~3.2g/L NaCl溶液。遺傳性球形紅細胞增多癥、橢圓形紅細胞增多癥和部分自身免疫性溶血性貧血時滲透脆性增加，珠蛋白生成障礙性貧血、血紅蛋白C、D、E病，低色素性貧血、阻塞性黃疸、脾切除術后等滲透脆性減低。

（2）紅細胞膜三磷腺苷活性測定：

Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶都是紅細胞膜上的 ATP酶。參考范圍為：紅細胞膜 Na+-K+-ATP 酶：19.68±3.62μmol Pi·gHb-1·2h-1；Ca2+-Mg2+-ATP酶：142.22±13.50μmol Pi·gHb-1·2h-1。遺傳性球形紅細胞增多癥時紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性增加，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性減低。蠶豆病時紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性減低。

（3）酸化甘油溶血試驗：

當紅細胞膜蛋白及膜脂質有缺陷時，在pH 6.85的甘油緩沖液中比正常紅細胞溶解速度快，導致紅細胞懸液的吸光度降至50%的時間（AGLT50）明顯縮短。正常人AGLT50 > 290s，遺傳性球形紅細胞增多癥AGLT50明顯縮短（25~15s）。自身免疫性溶血性貧血、腎衰竭、妊娠等AGLT50也可縮短。

（4）紅細胞膜蛋白電泳分析：

應用SDS-PAGE電泳對紅細胞膜進行分析，根據樣品中各蛋白相對分子質量的不同，分離得到紅細胞膜蛋白的電泳圖譜，從而可見各膜蛋白組分的百分率：區帶1、2（收縮蛋白）、區帶 2.1（錨蛋白）、區帶 3（陰離子通道）、區帶 4.1、區帶 4.2、區帶 4.5（葡萄糖運轉蛋白）、區帶 4.9、區帶 5（肌動蛋白）、區帶6（3-磷酸甘油醛脫氫酶）、區帶7等。各種膜缺陷疾病如遺傳球形紅細胞增多癥有收縮蛋白等含量減低或結構異常。某些血紅蛋白病骨架蛋白等可明顯異常。但紅細胞膜蛋白電泳結果不夠精確，僅局限于定性或半定量研究。

（5）高滲冷溶血試驗：

在高滲的條件下，溫度驟降影響紅細胞膜脂質的流動性，并累積膜磷脂和膜骨架蛋白的結合位點，從而導致紅細胞破裂溶血。參考值9mmol/L或12mmol/L蔗糖：66.5%~74.1%；7mmol/L蔗糖：0.1%~16.9%。增加見于遺傳性球形紅細胞增多癥，降低見于珠蛋白生成障礙性貧血和異常血紅蛋白病。自身免疫性貧血基本正常。

（6）紅細胞膜蛋白基因檢測：

利用分子生物學技術檢測遺傳性紅細胞膜缺陷與某個基因的相關性，或者檢測膜蛋白基因的突變位點。遺傳性球形紅細胞增多癥的突變位置多在CpG二核苷酸，缺失或插入。

3.診斷紅細胞酶缺陷的檢測

（1）葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose 6 phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏的篩檢試驗：

目前國內常用的有高鐵血紅蛋白還原試驗、熒光斑點試驗和變性珠蛋白生成試驗。高鐵血紅蛋白還原試驗敏感性高；熒光斑點試驗特異性高，同時是國際血液學標準化委員會（ICSH）推薦的G6PD缺乏篩查方法。Heinz包涵體試驗主要在溶血期間呈陽性。上述篩檢試驗均不能準確檢出女性紅細胞G6PD缺乏的雜合子。

高鐵血紅蛋白還原試驗：正常人外周血高鐵血紅蛋白還原率大于或等于75%；臍血大于或等于77%。G6PD缺乏時，高鐵血紅蛋白還原率下降。蠶豆病和服用伯氨喹型藥物導致的溶血性貧血等患者，還原率均可出現下降的結果。G6PD中間缺乏值（雜合子）還原率為31%~74%，臍血為41%~76%；G6PD嚴重缺乏值（純合子）還原率小于或等于30%，臍血小于40%。其簡便易行，但該試驗耗時長，特異性較差。

熒光斑點試驗：NADPH在紫外線260~340nm照射發出綠色熒光，而NADP+無熒光。利用此試驗可對高發區域人群或疑診的新生兒進行篩查。正常5~10min斑點出現熒光，而10min斑點熒光最強。

變性珠蛋白小體生成試驗：可作為G6PD缺乏的篩檢試驗之一，正常人 < 1%。而陽性細胞百分率大于30%有臨床意義，G6PD缺乏癥常高于45%，但含有不穩性血紅蛋白的患者陽性細胞也大于30%，還原型谷胱甘肽缺乏癥也增高。

（2）G6PD確診實驗：

G6PD活性定量檢測能準確反映酶的活性。檢測多應用WHO推薦的改良Zinkham法、國際血液學標準化委員會（ICSH）推薦的Glok與McLean法，Chapman-Dern法和硝基四氮唑藍定量法。由于G6PD雜合子患者酶活性的變化范圍較寬，活性定量測定的方法對其檢出率不高，可通過同時測定G6PD/6PGD比值的變化較敏感地反映G6PD的缺乏，提高雜合子的檢出率。成人紅細胞G6PD活性為8~18U/g Hb。

（3）G6PD基因檢測：

基因檢測對于疾病的分子診斷、探討G6PD結構與功能的關系以及完善人類遺傳學資料有重要意義。目前編碼G6PD的DNA一級分子結構已完全清楚，利用分子生物學技術可進行核苷酸序列分析。利用限制性內切酶研究G6PD基因片段長度多態性，對分析變異型很有幫助。目前中國人群發現G6PD基因28種變異型，G1388A、G1376T和A95G是中國人常見的突變型。

（4）丙酮酸激酶篩檢試驗：

紅細胞自溶血試驗陽性，加ATP可完全糾正，加葡萄糖不能糾正。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）熒光斑點試驗，正常者25min內熒光消失，中等缺乏者（雜合子型）25~60min熒光消失，嚴重缺乏者（純合子型）60min熒光仍不消失。

（5）丙酮酸激酶活性定量測定：

在二磷酸腺苷（ADP）存在的條件下，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉化成丙酮酸，后者在乳酸脫氫酶（LD）催化下轉化為乳酸，同時使反應體系中還原型輔酶Ⅰ（NADH）氧化成NAD+。計算單位時間NADH減少量來求得PK活性。ISCH推薦，正常參考區間為（15.0±1.99）U/g Hb（Blume法）；中等缺乏者（雜合子型）為正常活性的25%~35%，嚴重缺乏者（純合子型）為正常活性的25%以下。

（6）ATP測定：

參考范圍（4.32±0.29）μmol/g Hb，PK缺乏時低于正常2個標準差以上。

（7）PK缺乏癥患者的分子診斷：

突變或缺失位點可位于外顯子、內含子及啟動子區域，一般是將所有外顯子、內含子和PK-LR的紅細胞特異性啟動子區域進行PCR擴增后分別測序以發現突變位點所在。

4.診斷血紅蛋白異常的檢測

（1）血紅蛋白電泳：

血紅蛋白電泳（hemoglobin electrophoresis）包括醋酸纖維素薄膜電泳、等電聚焦法、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳以及高效液相色譜法。

pH 8.6 TEB緩沖液醋酸纖維膜電泳：正常血紅蛋白電泳區帶為：HbA > 95%、HbF < 2%、HbA2為1.0%~3.12%。pH 8.6 TEB緩沖液適合于檢出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易與HbA分開，HbH與Hb Barts不能分開和顯示。故pH 8.5醋酸纖維薄膜電泳未分離出異常血紅蛋白區帶不能完全排除異常血紅蛋白的存在，應用等電聚焦電泳、高效液相色譜等技術可提高檢出率。

毛細管電泳：是一種以高壓直流電場為驅動力，以樣品中各組分的淌度（單位電場強度下的遷移速度）和分配行為的差異為根據的液相微分離分析技術。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：血紅蛋白液中加入裂解劑，使Hb分子空間結構破壞，裂解成多條肽鏈亞單位，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離鑒別。參考值：正常血紅蛋白裂解后出現β、γ、δ、α四條肽鏈，如在正常區域以外的區帶出現條帶，提示異常血紅蛋白存在。

高效液相色譜法：以離子交換樹脂為固定相，根據血紅蛋白的理化性質不同，利用攜帶負電荷的層析柱和珠蛋白成分的電荷差異進行分離。

（2）抗堿血紅蛋白檢測：

胎兒血紅蛋白（HbF）具有比HbA更強的抗堿作用，將待檢的血紅蛋白液與一定量的NaOH溶液混合，以檢測抗堿血紅蛋白的濃度。此試驗也稱為堿變性試驗，除HbF外，Hb Barts和部分HbH也具有抗堿能力。參考值：成人1.0%~3.1%，新生兒55%~85%，2~4個月后逐漸下降，1歲左右接近成人水平。珠蛋白生成障礙性貧血時HbF增加，重型者達30%~90%，中間型常為5%~30%，輕型小于5%。遺傳性胎兒血紅蛋白持續綜合征患者，HbF可高達100%。HbF相對增多可見于骨髓纖維化、白血病、漿細胞瘤等惡性疾病及再生障礙性貧血、PNH、卟啉病等。HbF生理性增多，見于孕婦及新生兒。

（3）紅細胞包涵體試驗：

紅細胞包涵體試驗（Heinz-body forming test）是檢測不穩定血紅蛋白易變性沉淀形成的包涵體，正常人為陰性結果。不同型的不穩定血紅蛋白所需溫育時間和形成包涵體的大小、形態、數量、分布可有不同。HbH病時可見包涵體，也叫HbH包涵體。G6PD缺乏或紅細胞還原酶缺乏及化學物質中毒等紅細胞中也可出現包涵體。本試驗是不穩定血紅蛋白特別是HbH診斷的篩選試驗。正常0~5%。

（4）異丙醇沉淀試驗：

因不穩定血紅蛋白較正常血紅蛋白更容易解裂，在異丙醇這種能減低血紅蛋白分子內部的氫鍵的非極性溶劑中，不穩定血紅蛋白的穩定性下降，比正常血紅蛋白更快地沉淀。正常人臍血為陽性結果，新生兒出生1個月后逐漸開始轉為陰性，6個月后血紅蛋白液為陰性。在HbF、HbH、HbE含量大于4%、G6PD缺乏、α-珠蛋白生成障礙性貧血時均可出現陽性結果。試驗結果陽性只能說明存在不穩定血紅蛋白。本試驗易出現假陽性，特異性較差，是不穩定血紅蛋白的篩選試驗。

（5）熱變性試驗：

也稱為熱不穩定試驗（heat instability test），其根據不穩定血紅蛋白比正常血紅蛋白更容易遇熱變性的特點，觀察血紅蛋白液在50℃時是否出現沉淀，對不穩定血紅蛋白進行篩檢。熱沉淀血紅蛋白超過5%提示不穩定血紅蛋白存在。

（6）血紅蛋白分子生物學技術檢測：

應用基因探針、DNA微陣列、限制性內切酶圖譜分析、聚合酶鏈反應（PCR）、擴增不應突變系統技術、多重突變引物延伸擴增技術、反向斑點雜交、特異性寡核苷酸雜交等一系列分子生物學技術，可檢測出異常血紅蛋白基因的存在，明確基因型及基因的缺陷部位等。通過血紅蛋白異常基因的檢測，可在分子水平上進行血紅蛋白病的診斷和研究，具有重要的臨床診斷價值。

5.陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥的檢測

（1）酸化血清溶血試驗：

陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）患者體內紅細胞有缺陷，對補體敏感性增加。酸化血清溶血試驗（acidified-serum hemolysis test），也稱微量Ham’s test，正常人為陰性，本試驗陽性主要見于PNH，某些自身免疫性溶血性貧血發作嚴重時可呈陽性。該檢測特異性強，是PNH的確診試驗。

（2）蔗糖溶血試驗（sucrose hemolysis test）：

PNH患者的紅細胞膜有缺陷，在低離子強度的蔗糖溶液中對補體敏感性增強，經孵育，補體與紅細胞膜結合加強，使補體敏感紅細胞的膜造成缺損，結果導致蔗糖溶液通過缺損處進入紅細胞內，引起滲透性溶血。正常人定性試驗為陰性，定量試驗溶血率 < 5%。本試驗敏感性高，作為PNH的篩選試驗，陰性可排除。蔗糖試驗特異性較差，AA-PNH綜合征患者亦可陽性，白血病、骨髓硬化時可出現假陽性，部分自身免疫性溶血性貧血、巨幼細胞貧血、遺傳性球形紅細胞增多癥患者可呈弱陽性，陽性需加做Ham’s試驗。

（3）CD55、CD59檢測：

陣發性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）的發病機制是血液細胞膜表面糖化磷脂酰絲氨酸錨蛋白的缺失，可通過檢測CD55（退變加速因子）和CD59（反應性溶血膜抑制物）這兩種常見的血細胞表面錨蛋白相關抗原的表達情況，輔助診斷PNH。正常人紅細胞CD55、CD59及粒細胞CD55、CD59表現為單一陽性峰，低表達群應小于3%。若在檢測標本中發現有CD55或CD59低表達群的增多，支持PNH診斷。本試驗是診斷PNH特異性高、敏感性強且可定量的檢測方法。

（4）蛇毒因子溶血試驗（venom hemolysis test）：

多采用從眼鏡蛇毒中提取的一種蛇毒因子（C3b），可通過旁路途徑激活補體，PNH患者的紅細胞補體系統激活后，促使PNH補體敏感紅細胞破壞、溶血。正常人溶血率 < 5%，溶血率 > 10%為陽性。PNH Ⅲ型紅細胞對蛇毒溶血試驗敏感性最高，正常紅細胞、PNHⅠ型和PNHⅡ型等的紅細胞均不發生溶血。本試驗為PNH特異性試驗，特異性比Ham’s試驗高，溶血度越高，說明PNH Ⅲ型紅細胞所占比例越多。

（5）血細胞Flaer測定分析：

嗜水氣單胞菌的毒素能特異與細胞膜上GPI錨連蛋白結合，在膜上打孔致細胞破裂溶解。而PNH細胞缺乏GPI錨連蛋白抵抗毒素破壞，保持細胞完整。利用熒光素標記Flaer變異體，通過流式細胞術區分GPI陽性和陰性細胞。健康人Flaer呈100%陽性。目前采用Flaer聯合CD59來檢測PNH，對于臨床高度懷疑，CD55和CD59檢查不能確診的病例，結合Flaer檢查，可提高診斷。

三、結果判斷與分析

（一）首選試驗

確定溶血性貧血存在的檢驗：依據病史，有貧血、黃疸，網織紅細胞計數增加，考慮為溶血性貧血的可能。溶血性貧血的診斷主要應尋找的證據有：①紅細胞壽命縮短或破壞過多：紅細胞壽命測定明顯縮短，血紅蛋白濃度減低，異形紅細胞較多出現，血中游離血紅蛋白濃度增加，血清間接膽紅素增加，尿膽原陽性，尿含鐵血黃素試驗陽性，血清乳酸脫氫酶活性增加等；②骨髓紅細胞系統代償性增生：網織紅細胞明顯增多，骨髓紅系增生明顯活躍，粒紅比例縮小或倒置。

（二）次選試驗

確定溶血病因明確診斷的檢驗：依據病史找線索，并結合其臨床資料有的放矢地選擇篩選試驗和確診試驗，對不同類型的溶血性貧血進行確診。如遺傳性溶血性貧血選擇紅細胞滲透脆性試驗，自身溶血試驗，紅細胞酶缺陷的檢出，血紅蛋白電泳，異常血紅蛋白的檢測等；獲得性溶血性貧血選擇抗人球蛋白試驗、冷凝集素試驗、冷熱溶血素試驗、血清蛋白電泳等；藥物所致溶血性貧血選擇高鐵血紅蛋白檢測、G6PD篩選試驗、包涵體試驗和藥物依賴性抗體檢測等；機械性損傷所致溶血性貧血在血片可檢出異常形態紅細胞和各種紅細胞碎片。

1.紅細胞膜缺陷溶血性貧血的檢查

遺傳性球形紅細胞增多癥血紅蛋白和紅細胞量正常或輕度減低，白細胞和血小板正常。血片中紅細胞呈球形，大小比較均一，染色后細胞中央淡染區消失。網織紅細胞增加。血涂片和陽性家族史有決定性診斷價值。紅細胞滲透脆性增高，常于5.2~7.2g/L的低滲鹽水開始溶解，4.0g/L完全溶解，孵育后脆性更高，加葡萄糖或ATP能夠糾正。80%的患者紅細胞膜電泳分析（SDS-PAGE電泳）可發現異常。目前應用分子生物學技術如用單鏈構象多態性分析（SSCP）、聚合酶鏈反應（PCR）結合核苷酸測序等可檢出膜蛋白基因的突變位點。

遺傳性橢圓形紅細胞增多癥有輕重不等的貧血。血片中橢圓形紅細胞的比例大于25%。其形態呈橢圓形、卵圓形、棒狀或臘腸形，紅細胞橫徑與縱徑之比小于0.78，硬度增加。骨髓紅細胞系統增生活躍為增生性貧血骨髓象。紅細胞滲透脆性試驗和自身溶血試驗多增高。紅細胞膜蛋白電泳分析及低離子強度非變性凝膠電泳膜收縮蛋白分析出現異常結果有助于膜分子病變的確定。

2.紅細胞酶缺陷性溶血性貧血的檢查

紅細胞G6PD缺陷癥除遺傳性非球形細胞溶血性貧血外，患者平時無明顯異常改變，在誘因的作用下出現急性溶血時，有血管內溶血共同的實驗室檢測特征，而遺傳性非球形細胞溶血性貧血具有慢性血管外溶血的實驗室特征，紅細胞形態一般無明顯異常，可有少數異形或破碎的紅細胞。G6PD缺乏的篩檢試驗均為陽性結果，在篩檢試驗中以熒光斑點試驗的特異性最高，高鐵血紅蛋白還原試驗的敏感性最強，但均不能準確檢出紅細胞G6PD缺乏的雜合子。G6PD活性定量檢測能準確反映酶的活性，為G6PD缺陷癥的確診試驗。通過同時測定G6PD和6PGD活性并計算G6PD/6PGD比值，可提高雜合子的檢出率。

紅細胞丙酮酸激酶缺陷癥時紅細胞自溶血試驗陽性，加ATP可完全糾正，加葡萄糖不能糾正。PK熒光斑點試驗中等缺乏者（雜合子型）25~60min熒光消失，嚴重缺乏者（純合子型）60min熒光仍不消失。酶活性定量檢測，中等缺乏者（雜合子型）為正常活性的25%~35%，嚴重缺乏者（純合子型）為正常活性的25%以下。中間代謝產物測定可見2，3-二磷酸甘油酸（2，3-DPG）、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、2-磷酸甘油酸（2-PG）在PK缺乏時較正常增加2個標準差以上。

3.珠蛋白生成障礙性貧血的檢查

一般溶血的檢查：貧血輕重不等，紅細胞大小不均，靶形紅細胞和異形紅細胞增多，多大于10%。進行溶血相關檢測，紅細胞脆性減低。珠蛋白生成障礙性貧血多為小細胞低色素性貧血，需與缺鐵性貧血鑒別。

血紅蛋白電泳：電泳技術無論是對珠蛋白肽鏈的結構異常還是肽鏈合成量的異常的診斷均有重要意義，選擇適當的血紅蛋白電泳技術可檢測出各類異常血紅蛋白及各血紅蛋白成分的相對含量。各類珠蛋白生成障礙性貧血電泳結果見表1-9。

基因診斷：珠蛋白生成障礙性貧血均有基因突變，體外珠蛋白比率分析、基因探針及限制性內切酶圖譜法、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、特異性寡核苷酸雜交法等檢測進行基因分析可用于疾病的診斷和分型及骨髓移植和基因治療的研究。通過對外周血或臍血進行基因診斷，可確定是否患病及具體的分子缺陷類型。通過對絨毛細胞或羊水細胞進行DNA診斷，對胚胎臍血進行基因診斷可進行產前診斷以防止純合子患兒的出生。Α-珠蛋白生成障礙性貧血主要是α-珠蛋白基因缺失或突變所致。通過Southern印跡雜交分析和PCR方法檢測其基因缺失。Β-珠蛋白生成障礙性貧血主要為點突變型，是一組高度異質性的遺傳性疾病，應用寡核苷酸探針雜交技術和PCR-限制性內切酶酶解法可檢測出已知的β珠蛋白生成障礙性貧血基因的突變。

4.異常血紅蛋白病的檢查

鐮狀細胞貧血（HbS病）：血紅蛋白減低（一般為50~100g/L）。紅細胞大小不均，可有小細胞、大細胞、裂紅細胞、嗜多色紅細胞、有核紅細胞、靶形紅細胞等。網織紅細胞增加（常大于10%）。紅細胞鐮變試驗陽性，紅細胞滲透脆性明顯下降。血紅蛋白電泳可見HbS帶位于HbA和HbA2間，結果顯示HbS占80%以上，HbF增至2%~15%，HbA2正常，HbA缺乏。

血紅蛋白E病：多為小細胞低色素性輕度貧血。紅細胞滲透脆性減低。血紅蛋白電泳顯示HbE占75%~92%，HbE的電泳特征為在pH 8.6或8.8時，HbE移動速度較HbC稍快，與HbA2完全相同，不能分開；pH 6.8酸性凝膠電泳可與HbC和HbA2區分。因HbE不穩定，異丙醇沉淀試驗陽性和熱變性試驗弱陽性；變性珠蛋白小體檢測陽性。

不穩定血紅蛋白病：變性珠蛋白小體檢查出現陽性結果對疾病診斷有重要意義，熱變性試驗和異丙醇沉淀試驗為陽性，一般用異丙醇試驗篩選，再做熱變性試驗和變性珠蛋白小體檢查進行診斷。血紅蛋白電泳僅有部分病例可分離出異常血紅蛋白區帶。通過分辨率高的聚丙烯酰胺凝膠電泳，不穩定血紅蛋白和潛在異常血紅蛋白可清晰分離。

5.陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥的檢查

血細胞分析：貧血為幾乎所有患者的表現，呈正色素性或低色素性貧血（尿中鐵丟失過多時），網織紅細胞增高，可見有核紅細胞及紅細胞碎片。白細胞和血小板多減少，半數患者為全血細胞減少。

骨髓象：半數以上的患者三系增生活躍，尤以紅系造血旺盛。隨病情變化表現不一，不同穿刺部位增生程度可明顯差異，故增生低下者應注意穿刺部位，必要時做病理活檢。

特殊溶血試驗：尿含鐵血黃素試驗陽性為溶血存在的依據；熱溶血試驗、蔗糖溶血試驗、酸化血清溶血試驗陽性是補體敏感的紅細胞存在的依據，蔗糖溶血試驗是PNH的篩選試驗，敏感但特異性較差。酸化血清溶血試驗特異性高，多數患者為陽性，是診斷的重要依據。

流式細胞術檢測：發現GPI錨連接蛋白（CD55或CD59）低表達的異常細胞群，支持PNH診斷。本試驗是目前診斷PNH可定量的檢測方法。

（三）常見疾病的實驗室診斷

1.遺傳性球形紅細胞增多癥

主要實驗室診斷標準為：有家族史，典型臨床癥狀和實驗室檢查（外周血球形紅細胞大于10%、紅細胞滲透脆性增加、MCHC升高、Ret增高），目前遺傳性球形紅細胞增多癥無特異實驗室檢查，診斷時應結合病史、臨床表現和實驗室檢查綜合分析。應注意與自身免疫性溶血性貧血所致繼發性球形細胞增多相鑒別，可做紅細胞膜蛋白分析和組分定量，必要時采用基因序列分析的方法，尋找診斷依據和進行家系調查以鑒別診斷。

2.紅細胞G6PD缺乏癥

G6PD缺乏癥是一種X連鎖不完全顯性遺傳病，診斷依靠實驗室檢測紅細胞G6PD活性的證據，臨床表現及陽性家族史對診斷也非常重要。篩選試驗中兩項中度異常；或一項篩選試驗中度異常加上Heinz小體生成試驗陽性（有40%紅細胞含Heinz小體，每個紅細胞有5個以上Heinz小體）并排除其他溶血病因；或一項篩選試驗中度異常，伴有明確的家族史；或一項篩檢試驗嚴重異常；或定量測定G6PD活性較正常平均值減低40%以上，均可確診。并據不同發病情況對其進行臨床分型。

3.紅細胞PK缺乏

①PK熒光斑點試驗結果為PK活性缺乏；②PK活性定量測定為純合子范圍；③PK活性定量測定為雜合子范圍，伴有明顯家族史和2，3-DPG兩倍以上增高或中間代謝產物改變。符合以上三項中任何一項，支持PK缺乏的實驗室診斷。遺傳性紅細胞PK缺乏癥的診斷主要通過紅細胞PK活性的測定進行診斷。在診斷時應注意與繼發性PK缺乏進行鑒別并應考慮變異型的實驗室診斷。

4.珠蛋白生成障礙性貧血

珠蛋白生成障礙性貧血是由于基因缺陷導致血紅蛋白中至少一種珠蛋白合成缺乏或不足，引起的貧血或病理狀態，是一組常染色體不完全顯性遺傳性疾病。根據缺乏的珠蛋白鏈的種類及缺乏程度給以命名和分類，珠蛋白生成障礙性貧血可分為α-珠蛋白生成障礙性貧血、β-珠蛋白生成障礙性貧血、δ-珠蛋白生成障礙性貧血和γ-珠蛋白生成障礙性貧血等。目前珠蛋白生成障礙性貧血的實驗室檢查主要包括血常規檢測、血紅蛋白電泳和定量分析、基因分析，而血紅蛋白電泳的異常是確診指標。

5.不穩定血紅蛋白病

證明不穩定血紅蛋白的存在是診斷本病的主要依據。應用熱變性試驗、異丙醇試驗和變性珠蛋白小體試驗可進行不穩定血紅蛋白的常規檢查，再結合臨床表現可進行診斷。做有關珠蛋白鏈的氨基酸組成分析，可確定不穩定血紅蛋白異常的部位。

6.陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥

PNH是一種因體細胞PIG-A基因突變導致的獲得性造血干細胞克隆性疾病。PIG-A基因突變導致血細胞膜上糖化磷脂酰肌醇（GPI）合成障礙，血細胞表面GPI錨連蛋白缺失，血細胞容易破壞而發生溶血。PNH的診斷標準（結合2013年中華醫學會血液學分會紅細胞疾病（貧血）學組制定的《陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥診斷與治療中國專家共識》）：臨床表現符合PNH的特征，實驗室檢查結果如下具備①項或②項均可診斷，需與再生障礙性貧血、免疫性溶血性貧血和骨髓增生異常綜合征等相鑒別。

①酸化血清溶血試驗、糖溶血試驗、蛇毒因子溶血試驗、尿隱血（或尿含鐵血黃素）試驗等兩項試驗以上陽性，或一項試驗陽性，但結果可靠有肯定的血管內溶血的直接或間接證據，并能除外其他溶血。

②流式細胞儀檢查發現外周血中CD59或CD55陰性的中性粒細胞或紅細胞大于10%（5%~10%為可疑）或氣單胞菌溶素前體變異體檢測陰性。