第二節(jié)　真菌檢查

一、直接鏡檢

（一）適應(yīng)證

適用于各種淺部、深部真菌病的診斷與鑒別診斷。

（二）禁忌證

無特殊禁忌。

（三）步驟

1.直接涂片

（1）標(biāo)本準(zhǔn)備：

淺部真菌病（頭癬、體股癬、手足癬、甲真菌病、花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎、皮膚及黏膜念珠菌病等），用鈍刀刮取皮損邊緣部的皮屑，也可用透明膠帶粘貼鱗屑，或用小刀刮取變色松脆的甲屑，用拔毛鑷拔取病發(fā)，用鑷子夾擠毛囊角栓。

深部真菌病（孢子絲菌病、著色芽生菌病、暗色絲孢霉病、毛霉病等）：根據(jù)病變可取膿液、痂等。

（2）鏡檢操作：

標(biāo)本置于載玻片上，加一滴浮載液，蓋上蓋玻片，放置片刻或微加熱，即在火焰上快速通過2～3次，不應(yīng)使其沸騰，以免結(jié)晶。然后輕壓蓋玻片，驅(qū)逐氣泡并將標(biāo)本壓薄，用棉拭子或吸水紙吸去周圍溢液，置于顯微鏡下檢查。檢查時(shí)應(yīng)遮去強(qiáng)光，先在低倍鏡下檢查有無菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察孢子和菌絲的形態(tài)、特征、位置、大小和排列等。

（3）典型真菌鏡檢所見

1）花斑糠疹：

短粗、兩頭鈍圓、稍彎曲的菌絲，成堆球形或卵圓形厚壁出芽孢子。

2）馬拉色菌毛囊炎：

球形厚壁出芽孢子。

3）頭癬：

黃癬，順頭發(fā)長軸排列的發(fā)內(nèi)菌絲，關(guān)節(jié)孢子及氣溝、氣泡，黃癬痂內(nèi)鹿角狀菌絲、大小不等的孢子；白癬，發(fā)外鑲嵌性小孢子；黑點(diǎn)癬，發(fā)內(nèi)鏈狀大孢子。

4）體股癬、手足癬：

分枝分隔的長菌絲。

5）甲癬：

分枝分隔的菌絲或呈關(guān)節(jié)樣菌絲。

6）念珠菌病：

假菌絲、圓形或橢圓形孢子，有出芽。

7）著色芽生菌病：

棕色圓形厚壁分隔孢子（硬殼細(xì)胞）。

8）暗色絲孢霉病：

棕色分枝分隔菌絲或酵母樣細(xì)胞。

9）曲霉病：

45°分隔分枝菌絲。

10）毛霉病：

寬大菌絲，90°分枝，不分隔。

2.墨汁涂片

用于檢查隱球菌及其他有莢膜的孢子。

（1）在載玻片上滴一小滴墨汁（最好是印度墨汁）。

（2）取皮膚感染膿性分泌物或腦脊液一滴，經(jīng)接種環(huán)與墨汁充分混合，蓋上蓋玻片。

（3）直接在顯微鏡下觀察，隱球菌為圓形或橢圓形雙壁孢子，外圍有一層透光莢膜，在黑色背景下極為明亮。

（四）注意事項(xiàng)

1.拔毛鑷或鈍刀在使用前后，均應(yīng)用火焰消毒并冷卻后使用。

2.拔發(fā)時(shí)可用放大鏡、皮膚鏡或在濾過紫外線燈下選擇病發(fā)。

3.鏡檢時(shí)所見菌絲或孢子應(yīng)注意與纖維、表皮細(xì)胞間隙、氣泡、油珠等相鑒別。

4.標(biāo)本與墨汁混合后不必加熱直接鏡檢。

二、真菌培養(yǎng)

（一）適應(yīng)證

適用于各種淺部、深部真菌病診斷和鑒別診斷，以及致病真菌的分離、鑒定或藥敏試驗(yàn)。

（二）禁忌證

無特殊禁忌。

（三）步驟

1.標(biāo)本準(zhǔn)備

淺部真菌病同直接鏡檢。深部真菌病（孢子絲菌病、著色芽生菌病、暗色絲孢霉病、毛霉病等）的組織或膿液標(biāo)本需無菌采集；活檢組織標(biāo)本應(yīng)置無菌平皿中立即送檢，置無菌勻漿器加2ml蒸餾水，研磨成漿或1mm×1mm×（1～2）mm的小塊。

2.培養(yǎng)操作

分為試管培養(yǎng)、大培養(yǎng)和小培養(yǎng)三種方法。

（1）試管培養(yǎng)：

將培養(yǎng)物接種在試管斜面培養(yǎng)基，主要用于臨床標(biāo)本分離的初代培養(yǎng)和菌種保存。

（2）大培養(yǎng)：

將培養(yǎng)物接種在培養(yǎng)皿或特殊培養(yǎng)瓶內(nèi)，主要用于純菌種培養(yǎng)和研究。

（3）小培養(yǎng)：

主要用于菌種鑒定，分為玻片法、方塊法和鋼圈法三種方式。

1）玻片法：

在消毒的載玻片上，均勻地澆上熔化的培養(yǎng)基，不宜太厚。凝固后接種待鑒定菌株，置于平皿中，保濕。待生長后，蓋上消毒的蓋玻片，顯微鏡下直接觀察，常用米粉吐溫瓊脂培養(yǎng)基觀察白念珠菌的頂端厚壁孢子和假菌絲。

2）方塊法：

適用于真菌菌落的培養(yǎng)。取無菌平皿倒入約15ml熔化的培養(yǎng)基，待凝固后用無菌小鏟或接種刀劃成1cm×1cm大小的小塊。取一小塊移在無菌載玻片上，然后在小塊上方四邊的中點(diǎn)接種待鑒定菌株，蓋上消毒的蓋玻片，放入無菌平皿中的“V”形玻棒上，底部鋪上無菌濾紙，并加入少量無菌蒸餾水孵育，待菌落生長后直接將載玻片置顯微鏡下觀察。

3）鋼圈法：

先將固體石蠟加熱熔化，取直徑約2cm，厚度約0.5cm有孔口的不銹鋼小鋼圈，火焰消毒后趁熱浸入液態(tài)石蠟中，立即取出冷卻，液態(tài)石蠟即附著于小鋼圈中。再取一無菌載玻片，火焰上稍加熱，將小鋼圈平置其上，孔口向上。小鋼圈上液態(tài)石蠟遇載玻片的熱即熔化后凝固，鋼圈就會(huì)固定在載玻片上。用無菌注射器經(jīng)孔口注入熔化的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基量約占小鋼圈容量的1/2，注意避免產(chǎn)生氣泡。待培養(yǎng)基凝固后取一消毒蓋玻片，火焰上加熱后，趁熱蓋在小鋼圈表面，即固定其上，最后用接種針伸入孔口進(jìn)行接種。

3.培養(yǎng)檢查

標(biāo)本接種后，每周至少觀察2次。

（1）菌落外觀

1）生長速度：

緩慢生長菌7～14日，快速生長菌2～7日。一般淺部真菌超過2周或深部真菌超過4周仍無菌落生長，可報(bào)告陰性。

2）外觀：

①扁平；②疣狀；③折疊規(guī)則或不規(guī)則；④纏結(jié)或墊狀；⑤其他。

3）大小：

菌落大小測量以cm為單位，菌落大小與生長速度和培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。

4）質(zhì)地：

①平滑狀；②粉狀；③粒狀；④棉花狀；⑤粗毛狀；⑥皮革狀；⑦黏液狀；⑧膜狀。

5）顏色：

不同菌種表現(xiàn)出不同顏色，呈鮮艷或暗淡。致病性真菌的顏色多較淡，呈白色或淡黃色，而且其培養(yǎng)基也可變色，如馬爾尼菲青霉菌可產(chǎn)生葡萄酒樣紅色色素?cái)U(kuò)散于培養(yǎng)基中。菌落的顏色與培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、移種代數(shù)等因素有關(guān)。菌落顏色雖在菌種鑒定上有重要參考價(jià)值，但除少數(shù)菌種外，一般不作為鑒定的重要依據(jù)。

6）菌落邊緣：

可整齊或不整齊。

7）菌落高度和下沉現(xiàn)象：

有些菌落下沉現(xiàn)象明顯（如黃癬菌、絮狀表皮癬菌等），有時(shí)還可裂開。

8）滲出物：

一些真菌菌落表面可出現(xiàn)液滴（如青霉菌、曲霉菌）。

9）變異：

有些真菌菌落日久或多次傳代培養(yǎng)而發(fā)生變異，菌落顏色減退或消失，表面氣生菌絲增多，如絮狀表皮癬菌在2～3周后便發(fā)生變異。

（2）顯微鏡檢查：

小培養(yǎng)可置普通顯微鏡下直接觀察，而試管和平皿培養(yǎng)的菌落則需挑起后做涂片檢查。

常見真菌培養(yǎng)所見：①念珠菌病，奶油色酵母樣菌落；②隱球菌病，乳白色酵母樣菌落，而后為淺橘黃色，質(zhì)地呈黏液狀；③孢子絲菌病，棕色至棕黑色菌落；④曲霉病，黃綠色毛狀菌落；⑤芽生菌病，真菌相為白色棉花樣菌落，酵母相為奶油色或棕色菌落；⑥暗色絲孢霉病，棕黑色菌落。

（四）注意事項(xiàng)

1.應(yīng)結(jié)合直接鏡檢結(jié)果綜合進(jìn)行判斷。

2.嚴(yán)格無菌操作，避免污染。

3.提倡多管（點(diǎn)）、多次培養(yǎng)，確保結(jié)果可信性。

4.由于部分真菌沒有特殊結(jié)構(gòu)，或?yàn)槲粗婢瑧?yīng)保留菌種進(jìn)一步做DNA測序等分子生物學(xué)鑒定。

5.特殊病例取材時(shí)應(yīng)留備份冷凍保存，必要時(shí)重復(fù)培養(yǎng)或做分子生物學(xué)鑒定。