第七章　腎臟纖維化的發生機制

腎臟纖維化（renal fibrosis）是含原發性、繼發性腎小球疾病，腎小管、間質及血管疾病和腎臟移植慢性排斥性病變在內的所有慢性腎臟疾病（CKD）發展至終末期腎臟病的最后共同通路。其主要病理改變為正常腎單位的丟失，取而代之以大量成纖維細胞及肌成纖維細胞的增生，細胞外基質如膠原纖維和纖粘連蛋白的產生和堆積，從而導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化，最終導致腎臟功能喪失。在高血壓和糖尿病腎病中，腎臟纖維化常伴隨有小血管的硬化。此外，腎臟纖維化過程中也常伴有慢性炎癥反應，如T細胞和單核巨噬細胞的浸潤。

目前認為腎臟纖維化是不可逆的進行性病變，由此導致的終末期腎臟病需依賴透析治療或腎臟移植生存，為此需要耗費大量的財力和物力，對患者、家庭以及社會來說都是沉重的負擔。世界各國的腎臟病學者做了大量的工作，試圖尋找抗腎臟纖維化的措施，但至今臨床上仍缺乏有效可靠的抗纖維化治療方法，其主要原因之一是腎臟纖維化的發生是一個非常復雜的慢性病理過程。很多細胞介質和生長因子都直接或間接地參與了這一過程，而目前對其發生機制尚缺乏全面的認識。本章的主要目的是闡述目前對腎臟纖維化發生機制的認識和研究上的進展。

一、細胞生長因子在腎臟纖維化發生和發展中的作用

（一）轉化生長因子與腎臟纖維化

轉化生長因子（TGF-β）是TGF-β超家族的主要成員之一，從De larco和Todaro等[1]在研究病毒時首次發現到現在的幾十年中，它與腎臟等多種器官纖維化的關系是一個常講常新的話題。TGF-β超家族廣泛存在于哺乳動物體內，包括TGF-β家族、活化素（activin）、骨形態發生蛋白（BMP）三大類。TGF-β超家族具有廣泛的生物學活性，在早期胚胎發生時機體的構建、內分泌功能、組織的纖維化、炎癥反應、免疫反應和腫瘤的形成等多種生理病理過程中都具有重要的作用。

TGF-β在機體幾乎所有組織中均表達，尤其在骨、肺、腎臟等組織中含量豐富。絕大多數的實質細胞都可以產生和分泌TGF-β，而一些浸潤細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、血小板等也可釋放TGF-β。TGF-β的釋放和激活導致細胞外基質（ECM）的生成增多和降解的減少，適量的激活導致正常結構的重塑和損傷的修復，而TGF-β過度的釋放則將導致器官和組織的纖維化。在本章節中，我們將重點討論TGF-β在腎臟纖維化中的作用。TGF-β是一種多功能、具有多向調節作用的細胞因子，它有著非常廣泛的生物學活性。它的活性因其劑量、作用細胞的類型、分化程度、外界環境及是否有其他生長因子作用而異。它以自分泌、旁分泌和內分泌的方式通過細胞表面的受體信號傳導途徑參與細胞分化、增生與凋亡，與機體抗炎癥反應、免疫調節、細胞黏附、ECM的合成以及多種腫瘤的發生有關。至今，已有大量的研究顯示，TGF-β與腎臟纖維化關系密切。

1.TGF-β的結構、受體信號傳導與生物學活性

在體內，TGF-β以無活性復合物的形式存在。機體在內源性蛋白酶的作用下形成12.5kD的TGF-β單體，其單體再以二硫鍵聯結形成有功能的同源二聚體即TGF-β。新合二聚體以非共價鍵與一種無活性相關肽（latent associate peptide，LAP）形成無活性的休眠復合物，LAP再以二硫鍵與休眠TGF-β結合蛋白（latent TGF-β binding protein，LTBP）形成大的休眠復合物，儲存在血小板α顆粒中或分泌到胞外。新合成的TGF-β是無活性的，它只有被活化，即從基質上釋放和從LAP裂解下來后才能發揮生物學效應。機體內大部分的細胞都能合成TGF-β，如內皮細胞等。但靜息時的內皮細胞合成TGF-β的量和活性均很低，而激活的內皮細胞即可合成大量且活性很高的TGF-β。血漿中已激活的TGF-β與α巨球蛋白等結合形成的復合物可被肝細胞攝取和代謝，也可由炎癥區的蛋白酶或彈性蛋白酶降解。

細胞膜上的TGF-β受體有3型：TGF-β-RⅠ，TGF-β-RⅡ，TGF-β-RⅢ。分子量分別為53kD、70～80kD、300kD。RⅠ和RⅡ與信號傳導有關，RⅢ與TCF-β貯存有關。其中Ⅰ型和Ⅲ型受體是絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，Ⅰ型受體又被稱為活化素Ⅰ型受體樣激酶（activin receptor-like kinases，ALKs），它又分為7種亞型，ALK-1是一種內皮細胞特異性Ⅰ型受體；ALK-2、ALK-3、ALK-6是BMPI型受體，ALK-4、ALK-5分別是活化素和TGF-β的Ⅰ型受體，而ALK-7的配體目前尚未知。Ⅰ型受體有一個楔形的GS區插入激酶區，使之處于失活狀態。Ⅱ型受體是結構性自動磷酸化，它在未與配體結合時，已經發生磷酸化。在信號轉導中，TGF-β首先與Ⅱ型受體結合，Ⅱ型受體自身發生二聚化，然后再與Ⅰ型受體結合形成四聚體，使Ⅰ型受體近膜GS區的絲氨酸/蘇氨酸殘基發生磷酸化并激活，進而磷酸化下游的信號傳遞介質，促進TGF-β的跨膜信號傳導。

Massague等[2]于1996年研究證實Smad蛋白是TGF-β信號傳導中的介質。Ⅰ型受體磷酸化激活以后，將信號傳至細胞內，使Smad蛋白磷酸化形成二聚體，并進入核內與DNA結合，調節靶基因的表達。TGF-β/Smad信號通路與其他信號通路是相互影響的。有絲分裂刺激可以負向或正向調節TGF-β/Smad信號通路；ERK MAPK在被肝細胞生長因子和內皮生長因子活化后，可以抑制配體所引起的R-Smad在核內的聚集；IFN-γ通過JAK1/STAT1所介導的通路上調Smad7的表達，從而抑制TGF-β信號傳導。TGF-β在腎臟纖維化中的生物學活性包括：①對ECM的影響：ECM對維持正常的腎臟結構、影響細胞間的黏附等起著非常重要的作用。正常組織ECM的合成與降解保持著動態的平衡。而TGF-β對細胞外基質蛋白的調節作用主要包括兩個方面，一是增加其合成，二是減少其正常的降解，從而促進ECM積聚，這其中含有基底膜成分，如Ⅳ型膠原、Laminin、硫酸肝素等；間質基質成分如Ⅰ型、Ⅲ型膠原、纖粘連蛋白（FN）等。TGF-β促進ECM積聚主要通過激活基質降解抑制酶如組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）和纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）的活性；抑制基質降解酶的活性，如基質金屬蛋白酶（MMPs）和纖溶酶原激活物（PA）。②對細胞增生的影響:TGF-β可抑制上皮細胞（腎小管及腎小球上皮細胞）、支氣管上皮細胞及內皮細胞生長。對于間充質來源的細胞，如腎小球系膜細胞、成纖維細胞，TGF-β具有雙重作用，高濃度時抑制細胞增生，低濃度時促進細胞增生。③對腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化的影響：體外實驗中TGF-β可以誘導腎小管上皮細胞轉分化為可以產生大量ECM的肌成纖維細胞。

2.TGF-β在腎臟纖維化發生及發展中的作用

在腎臟幾乎所有類型的腎臟細胞均可表達TGF-β及其受體。TGF-β的表達與腎臟纖維化的密切關系已經得到了多方面臨床與實驗研究的證實。如：在基質增多不明顯的薄基底膜腎病和微小病變中TGF-β1 mRNA水平與正常腎組織無明顯差異，而在以ECM積聚為主要特征的IgA腎病、局灶節段增生性腎小球硬化、新月體性腎小球腎炎、糖尿病腎病等中，其腎小球和小管間質區TGF-β1 mRNA明顯增高。這說明腎臟TGF-β的表達與基質的病理性增多有關，與其纖維化的程度成正比。2型糖尿病患者中發現循環TGF-β水平較正常對照組高2倍。另外，在免疫介導的抗胸腺素1（Thy-1）及抗腎小球基底膜（GBM）病實驗模型中發現，應用TGF-β中和抗體可有效防止腎小球ECM的沉積。因此認為，TGF-β1是介導ECM沉積的重要因子。在重復注射嘌呤霉素或多柔比星誘導的局灶節段性腎小球硬化及糖尿病腎病模型等非免疫炎癥介導腎小球損傷的模型中，TGF-β的表達均持續增高，并與ECM成分的增加成正相關。糖尿病鼠血漿TGF-β是正常組的4倍。支持TGF-β誘導腎小球硬化的最直接證據是利用脂質體將TGF-β cDNA經腎動脈導入正常鼠的腎臟，腎小球TGF-β蛋白表達增加，于1周內發生腎小球硬化[3]。這說明TGF-β是ECM沉積、腎小球硬化的強誘導劑。在Kopp等[4]的研究中發現，TGF-β轉基因小鼠血漿TGF-β增高至正常的8倍，并伴有明顯的腎小球纖維化，說明循環TGF-β和局部生成的TGF-β一樣可誘導腎小球基質的堆積增生。體外研究中，高糖培養近曲腎小管上皮細胞、腎小球內皮細胞和系膜細胞時，細胞TGF-β mRNA和TGF-β的水平明顯增高，同時伴有腎小球的肥大和膠原等ECM的增多，而抗TGF-β抗體和TGF-β反義寡核苷酸則能拮抗高糖的作用。糖基化終末期產物（AGEs）培養系膜細胞也可以增加其TGF-β的表達和膠原的生成。此外，TGF-β也可刺激培養的小鼠腎小球系膜細胞、上皮細胞、近曲小管細胞合成ECM。

腎小球的病變與腎間質病變往往是相互影響的，這可能與腎小球源性細胞因子釋放到腎小管和間質有關。間質纖維化在某種程度上較腎小球的病變更能預示腎臟的損害及臨床的預后。腎間質纖維化是以腎小管基底膜的增厚和間質成分如Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原和FN的增多、基質的堆積為特征。在單側輸尿管結扎梗阻性（UUO）腎間質纖維化動物模型中，患腎TGF-β mRNA水平明顯增高，而巨噬細胞數量也相應增多。在缺血性腎損害模型中，腎小管上皮細胞TGF-β1表達增高。可見，TGF-β在間質纖維化中也是非常重要的。

3.TGF-β的治療前景

大量的動物實驗和臨床研究均已證實了TGF-β與腎臟纖維化的關系，因此，抑制TGF-β的作用對延緩腎臟纖維化的進展將有重要意義。Border等[5]應用天然TGF-β抑制劑Decorin可阻斷腎硬化，Ziyadeh[6]等應用抗TGF-β中和抗體可減輕糖尿病腎纖維化的發生和發展，共同提示抗TGF-β可能是防治腎纖維化的新方法。但必須指出的是，應用抗TGF-β抗體雖然可減輕糖尿病腎纖維化，但卻加重了腎臟的炎癥反應，也可導致腎功能的損害。Ma等[7]發現，應用大劑量TGF-β中和抗體對嘌呤霉素引起的腎炎模型沒有保護作用。近期研究成果同樣表明[8]，條件性敲除腎小管上皮細胞TGF-β Ⅱ型受體或下游Smad4，在減輕UUO所致腎臟纖維化的同時，也不同程度地增加了損傷區域的炎癥反應，包括上調白介素-1、腫瘤壞死因子-α的合成和NF-κB的激活[9]。由此可見TGF-β是一把“三刃劍”，抗TGF-β抗體在抗纖維化的同時也抑制了TGF-β的抗炎癥作用和抗免疫作用，并可誘發腫瘤和自身免疫性疾病的發生。因此，還需要更多、更深入的研究來證實抗TGF-β的治療作用和臨床應用前景。

（二）堿性成纖維細胞生長因子與腎臟纖維化

成纖維細胞生長因子（ fibroblast growth factor，FGF）是從大腦和垂體的提取物中部分純化所得的成纖維細胞有絲分裂原，因其具有刺激成纖維細胞增生的活性而得以命名。它對酸和熱敏感，等電點呈堿性，故稱為堿性FGF（basic-FGF，b-FGF）。b-FGF是一種單鏈蛋白，有146～157個氨基酸殘基。人機體內幾乎各種細胞可產生b-FGF。b-FGF的分泌形式多為自分泌、旁分泌和內分泌，分泌后多與肝素高親和力結合。b-FGF受體為細胞膜上的膜蛋白，它也是單鏈多肽。b-FGF與其結合后的信號傳導通路有：①誘導腺苷酸或鳥苷酸循環酶；②激發磷脂酶降解磷脂酰肌醇產生第二信使二酰甘油和IP3，然后激活蛋白激酶C并引起鈣內流；③b-FGF受體與酪氨酸激酶有關。

在正常腎組織中，b-FGF表達限于腎小球、血管和部分腎小管上皮細胞以及間質成纖維細胞樣細胞。在腎臟腎小球內系膜細胞、足突細胞和上皮細胞均有分泌。而其自身也能作用于這些細胞，誘使上述細胞增生。近年來一系列動物和臨床研究已證明，b-FGF參與腎臟病的發病過程，與腎臟纖維化密切相關。正常腎臟b-FGF mRNA水平很低，而終末期腎臟病b-FGF mRNA明顯上升。b-FGF與腎間質和腎小管細胞的增生呈正相關。同時，b-FGF可以誘導細胞α-SMA的表達升高，而對Ⅰ型膠原和FN合成無明顯的影響。此外b-FGF可以降低細胞間黏附分子E-cadherin的表達，并通過誘導MMP-2影響腎小管基底膜的完整性，進而參與了腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉化的發生。體外培養的原代腎皮質成纖維細胞中表達b-FGF及其受體，抗b-FGF抗體可以阻抑b-FGF的促細胞生長作用。有實驗者給大鼠注射致腎臟病亞劑量的抗Thy1.1抗體，24小時后再注射b-FGF，結果發現系膜細胞增生增強至5倍以上，而未經處理的大鼠給予相同劑量b-FGF則未見系膜增殖，這表明b-FGF為一種選擇性的致細胞分裂劑，能增強亞臨床損傷時系膜細胞的增殖。有趣的是，與血小板衍生生長因子（PDGF）能促進系膜細胞合成基質的作用相反，b-FGF對基質合成無影響。b-FGF不僅能誘導系膜細胞增殖，近年研究提示它還可能是腎小球硬化的一個媒介物。Kriz等[10]給大鼠每天注射b-FGF，觀察13周。結果出現血肌酐升高和白蛋白尿，發生慢性腎功能不全；組織學上可見典型的局灶硬化。連續觀察到足突細胞分裂相和大量多核的足突細胞，但細胞數量并沒有增多，這可能因為b-FGF刺激足突細胞進入細胞增生周期引起核分裂。足突細胞為一高度分化細胞，不能完成細胞分裂全過程，所以出現雙核或多核細胞。必須指出的是，這些多核細胞可發生變性，表現為胞體萎縮、足突融合，并與腎小球基膜分離。為防止這種分離，壁層細胞就連接到裸露的基膜區，使腎小囊發生簇狀粘連樣病灶。隨著壁層上皮細胞的生長和侵襲，這些改變擴展到鄰近的腎小球毛細血管襻，引起粘連和腎小球毛細血管破壞，最后發展為腎小球局灶硬化。

（三）血管緊張素Ⅱ與腎臟纖維化

血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是腎素-血管緊張素系統（RAS）中最為重要的生物活性物質。目前的研究已認識到：它不僅是一種血管活性物質，可引起系統血流動力學改變，導致高血壓的發生；更為重要的是作為一種促生長因子，它調節著多種腎臟細胞因子和化學因子的表達以及腎臟細胞的生長、腎臟炎癥和纖維化的發生發展，在以進行性纖維化為特征的慢性腎臟疾病的進展中起著非常重要的作用。

1.AngⅡ的生成

AngⅡ的生成有多條通路[11]：①血管緊張素轉換酶系統。在這一系統中，腎素將肝臟合成的血管緊張素原轉化為血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉換酶（ACE）的作用下轉化AngⅡ。ACE產生于多臟器，包括肺、肝、腎臟、心臟以及大腦。研究發現，在缺乏循環AngⅡ時，組織局部腎素-血管緊張素系統促使腎臟成為局部AngⅡ產生的主要器官。在腎內近端小管液、間質間液以及腎髓質中，AngⅡ的水平較循環中高。②非ACE依賴通路。目前研究表明，體內多種物質具有ACE樣作用，可替代ACE將血管緊張素Ⅰ轉變為AngⅡ。如血管緊張素原在Tonin、Cathepsin G、組織凝血酶原激活物的作用下直接生成AngⅡ；而血管緊張素Ⅰ在Chymase、Cathepsin G的作用下可直接生成AngⅡ。在腎臟，約有40%的AngⅡ由非ACE依賴的通路來合成。其中，Chymase依賴性通路是AngⅡ產生的另一主要通路。Huang等[12]首先發現，在糖尿病腎臟，Chymase表達明顯升高，與腎小球硬化、血管硬化和高血壓有密切關系。

2.AngⅡ致纖維化機制

AngⅡ的生物學效應是由特異性的膜受體——血管緊張素Ⅱ受體（AⅡR）介導的。血管內皮上的受體由循環AngⅡ激活，而心臟、血管壁、腎臟等器官中的受體則由以自分泌或旁分泌生成的AngⅡ激活，機體內大量的AngⅡ都是在局部組織中產生的。近年來，在糖尿病腎病等多種腎臟疾病動物模型中均發現，腎臟局部組織AngⅡ濃度是明顯增高的。細胞膜上的AⅡR至少分成兩類，AT1受體（AT1R）和AT2受體（AT2R）。AT1R廣泛分布于幾乎所有的組織器官，如肝臟、肺、腎臟、心肌細胞、大腦、血管壁等處，其中腎臟、腎上腺、心臟和動脈中AT1R占優勢。TGF-β的產生也是AngⅡ誘導腎臟纖維化的重要機制之一，它通過誘導各種細胞因子特別是TGF-β表達而促使系膜細胞等腎細胞肥大增生、ECM進行性積聚，從而促進腎纖維化的發生發展。近期的研究發現，AngⅡ可以直接激活TGF-β/Smad信號通路介導血管平滑肌細胞、系膜細胞以及小管上皮細胞ECM的生成；同時，在缺乏TGF-β受體的細胞中，AngⅡ可以不依賴TGF-β激活Smad誘導ECM生成。因此，TGF-β非依賴性的AngⅡ/Smad信號通路在腎纖維化中也扮演著重要的角色。通過EGFR，AngⅡ還可以激活ERK MAPK，而EGFR抑制劑（PD153035）可阻斷AngⅡ誘導的ERK MAPK依賴的TGF-β和纖維聯結蛋白的產生。另外，在成纖維細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、系膜細胞中，AngⅡ可通過其受體激活細胞內的信號傳導鏈，包括MAPK、酪氨酸激酶、PKC、NF-κB、AP-1等參與腎臟纖維化。AngⅡ也可刺激許多非受體酪氨酸激酶，如PLCγ、Src激酶、JAK、FAK、PI-3K等。

AngⅡ的非血流動力學生物學效應主要表現為其促纖維化作用。①大量的體外研究發現，AngⅡ可促使細胞增生肥大以及ECM的生成。在腎系膜細胞、心肌細胞及成纖維細胞的研究中都發現AngⅡ有促細胞肥大的作用，AT1R拮抗劑則可抑制這種作用。在實驗性腎病模型中，AngⅡ有促腎纖維化的作用，ACEI和AT1R拮抗劑均可延緩纖維化進程。目前認為，AngⅡ引起纖維化的機制主要是通過激活許多血管活性物質和生長因子所致，如內皮素-1、TGF-β、血小板衍化生長因子等，其中以TGF-β最為重要。在體外培養的系膜細胞、血管平滑肌細胞以及成纖維細胞中，AngⅡ通過TGF-β依賴的信號通路誘導ECM的合成。②AngⅡ在調節ECM的合成和降解中有非常重要的作用。腎系膜細胞的體外實驗結果均顯示，AngⅡ的刺激可使其中多種成分，如Ⅰ型膠原、FN mRNA表達和合成增加，而抗TGF-β抗體可明顯降低由AngⅡ引起的ECM蛋白增加。有研究表明，抗TGF-β抗體可使FN的合成下降60%左右，提示AngⅡ的促ECM合成作用主要由TGF-β介導。此外其他一些因子，如血小板衍化生長因子、內皮素也參與了這種作用。AngⅡ不僅可使它們的表達增加，也可使其轉化為活性形式，產生生物學效應。除了影響ECM蛋白合成外，AngⅡ也影響ECM的降解。AngⅡ上調內皮細胞、平滑肌細胞PAI-1 mRNA的表達，PAI-1的增加可抑制兩種纖溶酶原激活劑-組織型纖溶酶原激活物和尿激酶樣纖溶酶原激活物，而這兩種纖溶酶原激活物可使纖溶酶原轉化為纖溶酶，從而使ECM成分降解。纖溶酶也可通過激活金屬蛋白酶（MMP）使ECM中各種膠原降解。所以，AngⅡ通過上調PAI-1使ECM降解減少。可見，與TGF-β相似，AngⅡ通過刺激ECM成分合成增加和降解減少而導致ECM聚集和腎臟的纖維化。Araim等在轉染了腎素和血管緊張素原基因的小鼠腎小球中發現ECM增加，Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達上調，進一步證明了AngⅡ的促ECM聚集作用。

3.抗AngⅡ治療與腎臟纖維化

AngⅡ在腎臟疾病纖維化進程中的作用越來越受到人們的重視，目前的研究已認識到：它不僅可以改變腎小球血流動力學，而且更為重要的是它具有促生長效應，通過促進腎小球系膜細胞等增生及ECM堆積而導致了腎纖維化的發生和發展。目前，血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）與AngⅡ受體拮抗劑（ARB）已廣泛應用于臨床治療糖尿病、高血壓及其相關的腎損害和延緩腎臟的纖維化。在糖尿病腎病中，血壓的降低已不能完全解釋血管緊張素轉換酶抑制劑與AngⅡ受體拮抗劑減輕尿蛋白的作用，這說明AngⅡ在介導糖尿病腎病腎纖維化中有非血流動力學的效應[13]。在血壓正常的非糖尿病腎病中，AngⅡ的阻斷仍有腎臟保護作用也是這一論點的有力證明[13]。在2004年公布的美國K/DOQI高血壓治療與降壓藥物應用指南中，已經明確了無論有無高血壓的慢性腎臟病患者均應首選ACEI或ARB治療以達到延緩腎功能惡化的目的。但是，AngⅡ在腎臟纖維化進程中復雜的生物學效應以及信號傳導通路仍有待進一步研究。

（四）肝細胞生長因子與腎臟纖維化

1.肝細胞生長因子的特性

肝細胞生長因子（HGF）是一種可以促進肝細胞再生的多肽生長因子。人類HGF基因位于7號染色體7q11.2-21位點。其基因的啟動子中包含正性和負性調節元素。HGF廣泛表達于中胚層來源的器官，無活性的HGF前體在細胞外多種激活物（如絲氨酸蛋白激酶）的蛋白水解作用下或組織損傷時轉變為活性形式，形成由69kD的α重鏈和34kD的β輕鏈構成的異二聚體。而其特異性的酪氨酸激酶受體c-met主要表達于肝臟、腎臟等組織的上皮細胞，其結構中包括胞膜外50kD的α鏈和跨膜的含有酪氨酸激酶結構域的β亞單位。當HGF與其受體結合后，即可激活酪氨酸激酶，誘導細胞內的多種信號傳導分子的激活，如Gab-1、PLC-γ、Ras-GAP、PI-3K、c-Src、Shp-2、Crk-2以及Grb-2等。在體外培養的細胞中，PKC、PKA激活物cAMP啟動因素、多種生長因子及炎癥細胞因子可誘導HGF的產生，而TGF-β、AngⅡ、糖皮質激素、1，25-(OH)₂D₃以及視黃酸等可抑制HGF的產生。

2.肝細胞因子在腎纖維化中的保護作用

目前，越來越多的基礎和臨床研究已證實HGF是一種多功能的細胞因子，具有多種生物學效應：①它具有有絲分裂原效應，可以刺激上皮細胞、內皮細胞以及多種間質細胞增生、分化；②它是一種成形素（morphogen），在器官的發育和維持正常成年器官結構與功能中均有非常重要的作用；③它具有運動（motogenic）效應，可以促進細胞的運動、遷移；④抗細胞凋亡的作用；⑤影響細胞與細胞以及細胞與細胞外基質之間的相互作用，激活蛋白溶解系統，促使細胞外基質降解；⑥誘導腫瘤發生。簡而言之，其主要的作用是組織結構發育與再生過程中的構建、重塑與保護功能。

在腎臟組織中，HGF表達于腎小管間質，如內皮細胞和巨噬細胞；在腎小球區域，HGF主要表達于系膜細胞和內皮細胞，以自分泌或旁分泌的形式作用于腎臟上皮、內皮細胞以及系膜細胞。近年來，研究者發現，在腎臟的多種急性或慢性的損傷過程中，HGF表達明顯增高。在腎臟毒性物質HgCl₂、glycerol、cisplatin、環孢素、Tacrolimus（FK506）等的作用下或腎缺血、尿路梗阻等病變及各種原因所致的急性腎衰竭、腎移植后急性排斥反應時，腎臟局部HGF mRNA和蛋白水平以及血漿HGF水平均明顯增高，而在其他未受損傷的器官組織中，HGF以無活性形式存在。這一現象使得研究者們進一步去研究HGF在腎臟損傷和纖維化過程中的作用。

至今，已有大量的研究結果證實HGF具有腎臟保護作用，可以延緩腎臟纖維化的發生發展。在HgCl₂、環孢素、FK506等腎毒性藥物誘導的急性腎衰竭小鼠模型中，HGF可以大大減輕腎臟組織病理改變和腎功能的損害。Okada等[14]用具有腎毒性的中藥成分馬兜鈴酸（aristolochicacid，AA）對HGF轉基因小鼠每日進行腹腔注射，結果發現與wild-type組相比，HGF轉基因小鼠腎間質纖維化明顯減輕；而在體外培養中，即使很低濃度的HGF也可以抑制AA誘導的腎小管上皮細胞的凋亡。在UUO腎纖維化動物模型中，腎小管TGF-βⅠ型受體表達增多，上皮細胞表型向肌成纖維細胞轉化，而外源性注射的HGF可抑制肌成纖維細胞的激活，阻斷腎小管上皮細胞的轉化，抑制FN的沉積，從而抑制腎間質的纖維化。另外，在應用基因轉染技術進行HGF基因轉染的5/6腎切除大鼠腎臟中，其腎小球硬化和間質纖維化程度較對照組均明顯減輕。Mizuno等[15]發現在STZ糖尿病鼠模型中，外源性HGF可以減輕腎小球肥大、抑制系膜Ⅰ型膠原和纖維聯結蛋白的生成以及α-SMA的表達，而抗HGF抗體可加重糖尿病的腎臟病理改變；高糖刺激的體外培養的系膜細胞在HGF的作用下，TGF-βmRNA表達減少，Ⅳ型膠原及α-SMA的表達亦降低。

3.肝細胞生長因子抗纖維化的機制

HGF抑制纖維化的現象促使人們進一步去探討HGF抑制腎臟纖維化的機制。TGF-β是目前公認的致纖維化因子，參與腎臟等多種組織器官纖維化的發生發展。TGF-β的過度表達可以抑制HGF，導致纖維化的發生；而給予外源性的HGF可以抑制TGF-β的表達，抑制纖維化。故目前認為，HGF與TGF-β之間是相互制約、相互拮抗的作用（TGF-βvs HGF counter balance），這正是HGF抑制腎臟纖維化的機制所在。HGF抗腎臟纖維化的作用主要體現在兩個方面：①促進ECM的降解[16]：ECM的降解主要通過MMPs/TIMPs和PAI兩條通路。而HGF可以增加小管MMP-9的表達，抑制TGF-β在小管間質對TIMP-2和PAI-1的誘導，從而減輕腎間質纖維化。②抑制細胞上皮-間充質表型轉化（EMT）：Yang等[17]研究發現，HGF可以維持腎小管上皮E-cadherin表型，抑制TGF-β誘導的α-SMA的表達，他們甚至發現HGF孵育腎間質成纖維細胞后可以重新誘導其間胚葉-上皮的表型轉化。他們認為HGF抑制TGF-β誘導的EMT是通過TGF-β非依賴途徑。HGF不影響TGF-β誘導的Smad2的磷酸化和與Smad4結合發生核轉位，也不影響抑制性Smad7在腎小管上皮細胞的表達，體外研究中發現，它特異性地誘導Smad轉錄共抑制子（co-repressor）SnoN的表達，與活化的Smad2結合形成無活性的轉錄復合物，阻斷Smad介導基因轉錄，從而阻斷EMT和腎臟纖維化。而Smad轉錄共抑制子SnoN、Ski在纖維化的腎臟中是明顯降低的。

HGF現已在臨床上用于肝纖維化的治療，其在腎臟纖維化中的保護作用也處于研究階段，但從基礎研究到臨床應用仍有較長的路要走。如何使HGF特異性地表達于病變的腎臟、如何避免HGF半衰期短、如何既要發揮其抗纖維化作用又不誘導腫瘤的發生等都是將來有待解決的問題。

二、肌成纖維細胞的主要來源及其在腎臟纖維化發生發展中的作用

腎小管間質纖維化是腎臟疾病發展到終末期腎臟病的共有病理改變。這一過程包括了腎小管的缺失和細胞外基質蛋白，如膠原（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型）、FN和laminin等的堆積。表達α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的肌成纖維細胞不僅是ECM的主要來源，也是腎臟疾病進展過程中的重要標志。它在形態上介于成纖維細胞和平滑肌細胞之間：它可以像成纖維細胞一樣合成膠原Ⅰ、Ⅲ；也像平滑肌細胞一樣具有收縮性，但與平滑肌細胞不同的是，它具有高度的分裂增生能力。盡管肌成纖維細胞在腎臟纖維化中扮演著重要的角色，但關于其來源目前還存在很多爭論（圖2-7-0-1）：目前觀點認為它可能由腎小管上皮細胞和內皮細胞分別經過EMT和EndoMT（endothelial-myo fibroblast transdifferentiation）轉分化而成，也可由周細胞（pericyte）和纖維細胞（local fibroblast）激活產生；此外，諸多證據表明骨髓來源的細胞亦可能是肌成纖維細胞的重要來源之一。

（一）EMT和EndoMT在腎臟纖維化發生和發展中的作用

大量的體外實驗結果表明，腎小管上皮細胞在受到刺激時可以逐漸丟失其標志物E-cadherin，并開始表達肌成纖維細胞的標志物α-SMA，這個過程被稱之為EMT。TGF-β被認為是啟動EMT發生發展的最主要生長因子，它可以通過激活下游Smad3或Smad非依賴的途徑（如P38MAPK，Akt/ PKB，RhoA，β-catnnin等[18]）誘導EMT的發生。此外，上皮生長因子（EGF）、b-FGF等生長因子也可誘導體外培養的TECs發生EMT。IL-1β可以通過調節TGF-β的表達與生物活性進而調控EMT[19]。近來研究發現，在糖尿病腎病中，糖基化終末期產物（AGEs）可以通過RAGE以及TGF-β通路的介導誘導EMT，這一現象在慢性糖尿病大鼠和人糖尿病腎病腎活檢標本中均有發生。AngⅡ是另一促纖維化因子，并可以加強TGF-β對EMT的誘導，因此它在EMT中亦扮演著重要的角色。在眾多的EMT調節因子中，HGF和骨形態發生蛋白-7（BMP-7）對EMT具有負性調節作用。體內外研究均已證實HGF可以阻斷EMT。而在5/6腎切除殘腎模型以及糖尿病腎病模型中均發現BMP-7可以阻斷EMT減輕腎臟纖維化。Strutz等[20]的研究表明，在小鼠抗腎小管基底膜疾病模型中，TECs可以表達成纖維細胞的標志蛋白，即成纖維細胞特異蛋白1（ fibroblast-specific protein 1，Fsp-1）。Ng等人[21]的研究從細胞表型和超微結構方面也證明，在大鼠5/6腎切除的殘余腎臟中，TECs可以轉分化為α-SMA陽性表達的肌成纖維細胞。與動物研究相似，在人的腎活檢組織中同樣可以觀察到EMT的現象[22,23]。然而，由于檢測技術的進步，有研究者提出EMT現象在動物及人類標本中極少發生，最新的研究亦表明，EMT在肌成纖維細胞來源中的貢獻可能并沒有之前想象中的重要[24]。

內皮細胞亦可能是肌成纖維細胞的來源之一[25]。以內皮細胞的特異性標志物Tie-2、CD31等進行的細胞譜系追蹤（cell lineage tracing）結果存在很大差異：內皮細胞來源的肌成纖維細胞從10%～50%不等[24]，這可能是由不同的譜系追蹤標志物、檢測技術及不同的動物模型造成，尚需進一步的驗證：此外，應用Smad3的抑制劑SIS3可以明顯抑制糖尿病腎病中EndoMT的發生并減輕纖維化水平，提示TGF-β可通過Smad3依賴性的機制誘導EndoMT的發生[26]。

（二）周細胞和成纖維細胞的轉化和激活在腎臟纖維化發生和發展中的作用

周細胞是一種存在于內皮細胞周邊的間充質來源的細胞，與1983年在電子顯微鏡下被首次發現，它位于內皮細胞的管腔面，與內皮細胞緊密相連，在血管的穩定性中發揮了關鍵的作用。目前尚無合適的標志物區分周細胞和成纖維細胞，其主要區別在于成纖維細胞并不能與內皮細胞發生接觸。周細胞有收縮功能，它參與了微血管形成的調控，此外周細胞還存在多向性的分化潛能。Lin等[27]應用在coll1a1啟動子和增強子作用下綠色熒光蛋白（GFP）標記的轉基因報告小鼠探索了腎臟疾病狀態下膠原產生的主要細胞類型，發現位于內皮細胞（CD31+）周圍的coll1a1+周細胞的PDGFR-β和TGF-β明顯上調，并脫離內皮細胞進入到間質，促進腎臟纖維化。此外，研究者還使用FoxD1-Cre標記了間充質細胞（包括周細胞、血管周成纖維細胞等），并在梗阻性腎病和缺血性急性腎損傷模型中進行了細胞譜系追蹤研究，提出了FoxD1+間質衍生的周細胞可能是肌成纖維細胞的重要前體細胞。然而，最新研究對周細胞進行了譜系追蹤并實施了特異性的敲除，結果顯示敲除NG2+和PDGFR-β+的周細胞并不能減少浸潤的肌成纖維細胞數量和纖維化程度，提示周細胞的作用或許并不關鍵。值得注意的是，后者實驗中使用的NG2和PDGFR-β相比與FoxD1，是更可信的周細胞標志物。同時研究者指出，約半數的肌成纖維細胞由腎臟的成纖維細胞增生而成，而EMT來源的肌成纖維細胞也僅占有約5%的比例[24]。

（三）骨髓來源細胞的分化在腎臟纖維化發生和發展中的作用

骨髓來源的細胞（如fibrocyte和巨噬細胞等）在肌成纖維細胞的來源中扮演了重要的角色，最新的細胞譜系追蹤實驗結果顯示，約40%的肌成纖維細胞可能從髓源細胞分化而來[24]。其中，fibrocyte是循環中一種骨髓來源的CD14+單核細胞，它同時表達和白細胞相同的標志物（如CD45）及間充質細胞的標志物（如膠原Ⅰ）。由于細胞表面存在大量的趨化因子受體（如CCR2，CCR7和CXCR4），腎臟疾病時大量的fibrocyte被招募至腎臟損傷部位，在Th2促纖維化類因子的作用下，逐漸轉化為肌成纖維細胞；Th1促炎類因子則抑制這個轉化過程。巨噬細胞在腎臟炎癥性疾病中起著非常關鍵的作用，其在纖維化疾病中的功能也得到了廣泛關注[28]。研究結果顯示巨噬細胞的浸潤和纖維化的程度高度相關，且與肌成纖維細胞存在共定位。體外實驗中，巨噬細胞可以轉分化為類似肌成纖維細胞樣細胞[29]，提示骨髓來源的巨噬細胞也可能是肌成纖維細胞的來源之一，此觀點尚需進一步的證實。

三、信號傳導通路在腎臟纖維化發生和發展中的作用

（一）TGF-β/Smad依賴性信號傳導通路和microRNA在腎臟纖維化發生和發展中的作用

1.Smads蛋白家族與TGF-β信號傳導

Smads蛋白一詞來源于Drosophila mothers against dpp（Mad）和C.elegans Sma的融合。Smads蛋白家族是一個在脊椎動物、昆蟲和線蟲體內發現的轉錄因子家族，它是迄今為止發現的唯一已被證明的TGF-β受體的作用底物。在哺乳類中共發現了8種不同的Smad蛋白，分成3個不同的亞族：第一類是受體調節型Smads（receptor-regulated Smad，R-Smad），它是Smads蛋白的原型，包括Smad1，Smad2，Smad3，Smad5和Smad8。R-Smads可進一步分為BMP受體激活的Smad1，Smad5，Smad8和由TGF-β激活的Smad2，Smad3兩類。第二類是共用Smad蛋白（common Smad，Co-Smad）。它不能被磷酸化，也不能結合TGF-β或BMP受體，但它可以穩定Smads多聚體復合物的結構，使其具有有效的轉錄活性。目前認為只有Smad4是共用調節分子，它幾乎可以與所有活化的R-Smads蛋白結合，形成低聚體復合物，促進R-Smads入核與其靶基因結合，參與調節TGF-β信號傳導。第三類Smads蛋白被稱為抑制型Smads（inhibitory Smads，I-Smads），其作用是通過阻斷R-Smads的激活而抑制TGF-β的信號轉導。TGF-β通過Smad2/3誘導Smad7的產生，然而Smad6主要為BMP所誘導，所以Smad7對TGF-β主要起負調節作用。

R-Smads與Co-Smad其N-末端和C-末端具有高度相似的氨基酸序列，分別稱為MH1（Mad homology）和MH2結構域。在MH1和MH2結構域之間具有不同序列長度的連接子（linker），但Co-Smad的C末端缺乏SSXS結構（Ser-Ser-X-Ser基序）。除Smad2外，R-Smads與Co-Smad的MH1結構域均可以與DNA的特異序列相結合。R-Smads與Co-Smad的MH2結構域與Smad同聚和異聚復合體的形成是密切相關的。R-Smads的MH2結構域中的L3環決定了其與Ⅰ型受體作用的特異性。Smad1與ALK-1或ALK-2相互作用時，不僅識別L3環，而且還識別MH2結構域中的H1（α-helix）。I-Smads具有一個保守的MH2結構域，可以與Ⅰ型受體相互作用。I-Smads的N-末端與R-Smads和Co-Smad的MH1結構域差異很大，這可能決定了其信號轉導的特異性。R-Smad在靜息狀態下主要以單體存在。在配體的刺激下，與活化的Ⅰ型受體短暫地相互作用后被磷酸化，磷酸化的R-Smads與Co-Smad形成異聚體，使其進入核內與靶基因結合而產生生物效應。

TGF-β超家族包括大量結構相關的多肽因子，如TGF-β、活化素（activin）、骨形態發生蛋白（BMP）三大類。以TGF-β為例，如圖2-7-0-2所示，TGF-β首先與細胞膜表面的Ⅱ型受體結合，形成異二聚體復合物，Ⅱ型受體磷酸化Ⅰ型受體近膜GS區的絲氨酸和蘇氨酸殘基。活化的Ⅰ型受體使R-Smad磷酸化，磷酸化的R-Smad與Co-Smad形成異聚復合體并進入細胞核。在核內Smads可以與DNA結合，然后與許多轉錄協同子和抑制子相互作用，共同發揮基因轉錄調節作用。I-Smad與活化的Ⅰ型受體相互作用，使Ⅰ型受體降解，從而抑制R-Smad與活化的Ⅰ型受體結合。Smad7對TGF-β超家族的成員都有抑制作用。STRAP（serine/threonine kinase receptor-associated protein）與Smad7相互作用，將其聚集在TGF-β受體上。目前尚沒有發現將Smad6聚集在TGF-β受體上的分子，它可能通過其他途徑發揮其抑制作用，如和Smad4競爭結合活化的Smad1；與TGF-β活化激酶（TAK）1協同，干預BMP誘導的P38的激活。因此，Smad6可以在TGF-β超家族信號轉導通路的不同水平起作用。TGF-β超家族成員可有效誘導Smad6和Smad7 mRNA的產生。因此，I-Smads可以通過自分泌負反饋方式來控制TGF-β信號的強度和持續時間。

2.Smad2和Smad3在腎臟纖維化中的作用

Smad2和Smad3是Smads家族的重要成員，是TGF-β信號傳導的重要介質，但是，它們有共性也有其特殊性，在腎臟纖維化中的作用不盡相同。

Smads家族在結構上有很高的同源性。Smad2和Smad3結構也很相似，其氨基酸序列具有91%的一致性，都包含有一與DNA結合的N-末端MH1結構及啟動核轉位和調節靶基因轉錄的C-末端MH2結構。在動物和人糖尿病和梗阻性腎病腎纖維化中，Smad2和Smad3均是明顯增加的。在一些體外研究中發現，TGF-β誘導系膜細胞腎小管上皮細胞膠原基質的生成是由Smad2和Smad3共同介導的；高糖刺激系膜細胞、小管上皮細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞生成膠原也依賴于Smad2和Smad3的激活[30]。而過度表達Smad7以抑制Smad2/3可以明顯減輕大鼠梗阻腎臟的纖維化[31]。

雖然Smad2和Smad3結構非常相似，但是它們各自起作用的方式和表現形式卻不同。Smad3可以直接與DNA結合調節靶基因的活性，而Smad2則需要通過Smad3與其他DNA聯結轉錄因子相結合并影響它們的活性來調節轉錄。很多致纖維化基因如COL1A1，COL1A2，COL3A1，COL5A1，COL6A1，COL6A3，COL7A1以及MMP-1是Smad3而非Smad2依賴性的[32,33]。據胚胎成纖維細胞9 000個基因分析顯示，95%的TGF-β相關基因是Smad3依賴性的[32]。

Smad2和Smad3功能不同的一個有力證據是，Smad2-/-小鼠在胚胎時即死亡，而Smad3-/-小鼠卻可以存活。又如，在小鼠胚胎成纖維細胞，TGF-β對MMP-2的誘導是選擇性依賴Smad2的，而對c-fos的誘導則依賴Smad3，但是對PAI-1的誘導則需Smad2和Smad3的共同參與。近期發現，TGF-β誘導腎小管上皮細胞VEGF表達依賴于Smad3而不是Smad2。而且，在TGF-β誘導的小管上皮-間質轉分化需要Smad2和Smad3，但它們在其中卻起著各不相同的作用: Smad2調節上皮基因E-cadherin的丟失，而Smad3調節間質基因α-SMA的表達。最新研究表明，敲除Smad3基因可防止血管緊張素Ⅱ、糖尿病腎病及UUO等致病因素引起的小鼠腎臟纖維化。然而腎臟條件性敲除Smad2則明顯加重UUO引起的腎臟膠原I的沉積并抑制膠原的降解，其機制可能與敲除Smad2加強Smad3磷酸化水平、核轉位水平及Smad3與下游膠原啟動子結合水平有關[34]。綜上所述，這些證據進一步證實了Smad3在腎臟纖維化中的重要致病作用。

3.Smad在腎臟纖維化中的治療作用

（1）Smad7：

Smad7是TGF-β/Smads信號傳導通路的主要負調節因子，近年來關于Smad7的研究表明，Smad7在抑制腎臟纖維化中起著非常重要的作用。過度表達Smad7可以抑制Smads信號通路的激活并抑制Smad介導的ECM的合成。在體外的研究中，過度表達Smad7可以抑制TGF-β對腎臟TECs和MCs的致纖維化效應[35,36]。體內研究發現，在梗阻腎病模型中，Smad7轉基因可以抑制TGF-β對Smad2和Smad3的激活。美國貝勒醫學院的學者用一種新穎、安全有效的誘導基因治療方法-超聲微泡介導系統向腎臟轉染doxycycline調控的Smad7基因，發現它可以特異性地阻抑TGF-β/Smad信號通路并減輕大鼠梗阻腎腎臟的纖維化，肌成纖維細胞的增生、膠原基質的生成也明顯被抑制[31]。在高血壓和糖尿病腎病大鼠中，過度表達Smad7可以完全抑制Smad2和Smad3的激活，減輕腎小球、腎小管間質的膠原基質的生成，并阻止腎功能進行性損害。研究還發現，在大鼠梗阻腎和5/6腎切除腎臟模型中，超聲微泡介導doxycycline調控的Smad7可以抑制炎癥細胞因子（如IL-1β、TNF-α）、黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1）、趨化分子（osteopontin）以及巨噬細胞、T細胞的聚集。這些數據顯示，誘導表達的Smad7不僅具有抗纖維化作用，還具有抗炎癥和免疫抑制作用。

（2）BMP-7：

BMP-7是TGF-β超家族的成員之一。BMP-7有其特異性的R-Smads:Smad1、Smad5和Smad8。而Smad4是TGF-β與BMP-7的共享成分，它也參與了BMP-7的信號傳導。BMP-7通過其Ⅰ型受體ALK-2，ALK-3，ALK-6磷酸化Smad1/5/8，然后與Smad4形成異聚復合體，入核調節基因轉錄。與TGF-β作用不同，BMP-7在腎小管上皮細胞和乳腺上皮細胞中可以通過Smad5拮抗TGF-β/Smad3誘導的EMT。Zeisberg等[37]發現，在成人腎小管上皮細胞中，TGF-β可以誘導EMT，而BMP-7卻可以拮抗其作用，通過增強E-cadherin的表達以維持上皮細胞的表型。在小鼠新月體腎炎模型中，BMP-7可以逆轉腎小管上皮細胞EMT，促進腎小管肥大的修復和腎臟排泄功能的恢復。而在慢性腎臟纖維化中，BMP-7表達水平是降低的。

4.TGF-β/Smad依賴的microRNA在腎臟纖維化中的功能與治療作用

MicroRNA（miRNA）是一類內生的、長約20～24個核苷酸的小RNA，在細胞內具有多種重要的調節功能。成熟的miRNA由miRNA前體（pre-miRNA）經Dicer酶切割而成，可以與靶基因的3’UTR結合從而引導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）降解mRNA或阻礙其翻譯。研究結果顯示，超過十種的miRNA參與了腎臟疾病的發生發展[38]。值得關注的是，作為最重要的促纖維化因子，TGF-β可誘導miR-21、miR-192、miR-377、miR-382、miR-491-5p的合成，同時降低miR-29和miR-200的水平，而這些miRNA被證明與腎臟纖維化的發生發展密切相關。基于Smad3基因敲除小鼠的miRNA芯片分析的結果進一步提示，TGF-β可能通過激活Smad3調控相關miRNA的表達（如miR-21、miR-29、miR-192）[39]，進而發揮其促腎臟纖維化作用（圖2-7-0-3）。

研究表明miR-21在多種腎臟疾病中起致病作用，其中在小鼠梗阻性腎病和糖尿病腎病模型中，間質及小球內miR-21水平均明顯上調，且與纖維化程度呈正相關。體外實驗結果顯示，在TGF-β或高糖環境刺激的小管上皮細胞和系膜細胞中，miR-21可正向調控ECM及α-SMA的合成。而在體沉默miR-21可以明顯減輕糖尿病及梗阻腎模型中炎癥及纖維化水平。此外，敲除miR-21可以減輕UUO及腎臟缺血再灌注模型中腎小管萎縮及纖維化程度，其機制可能與miR-21抑制過氧化物酶體增生物激活受體-α（PPAR-α）有關。這些研究成果共同提示miR-21可能是潛在的抗纖維化治療靶點之一。miR-192在正常腎臟組織中高度表達，在系膜細胞和上皮細胞中，其表達可以被TGF-β和高糖進一步激活，功能學結果提示miR-192可通過下調ZEB1/2水平，介導TGF-β的促膠原合成作用；此外，抑制miR-192可以減輕1型糖尿病模型中的纖維化反應和腎功能損傷，其在糖尿病腎病中的致病作用在miR-192敲除小鼠上被進一步驗證。miR-29家族包括三個亞型，即miR-29a，b，c。與miR-21和miR-192不同的是，miR-29在多種纖維化疾病中均明顯下調，而過表達miR-29則可顯著降低梗阻性腎病和糖尿病腎病模型中ECM的沉積和纖維化的程度；體外實驗亦提示，這可能是由于miR-29直接靶向結合于含膠原I在內的多種ECM相關基因，抑制其合成，進而減輕TGF-β、高糖及鹽引起的纖維化反應。miR-200家族被認為是維持上皮分化的重要調控因素，其成員包括miR-200a，b，c，miR-429和miR-141，研究表明TGF-β可以通過Smad依賴的機制下調miR-200的水平，更重要的是，單次注射miR-200b的前體即可明顯減輕梗阻性腎病模型中的腎纖維化程度，因為在上皮細胞中，miR-200家族可以下調E-cadherin的抑制因子ZEB1和ZEB2[40]，進而阻斷EMT的發生。然而，由于EMT在腎臟纖維化中的作用近來受到了質疑，我們需進一步探索miR-200抑制腎臟纖維化是否存在其他機制。

綜上所述，miRNA在腎臟治療中的應用潛力已經受到了廣泛關注，然而，給藥方法及脫靶效應（o ff-target effect）是影響其廣泛應用的兩大障礙：首先，目前較常使用的是化學合成的寡核苷酸系統性給藥，這對非病變組織難免會產生一定的毒副作用，盡管組織特異性的基因導入方法已經得到了證實，為最大程度減少副反應，miRNA劑量的優化也顯得格外重要；此外，脫靶效應同樣需要得到重視，例如沉默miR-21或過表達miR-29有效治療纖維化的同時可能會引起細胞的凋亡。這也就意味著miRNA應用于臨床纖維化的治療雖意義重大，但仍任重道遠。

（二）非TGF-β依賴的Smad信號傳導通路在腎臟纖維化發生和發展中的作用

有不少的證據已證明Smad除了依賴TGF-β被激活外，它也可以被其他非TGF-β依賴的信號通路激活。最近研究表明，多種因子，如EGF、HGF可通過激活ERK/P38 MAPK而促進Smad2/3活化。目前研究表明，ERK/P38MAPK依賴性的Smad2/3磷酸化可以在Smad2/3中間子（linker）或在MH2的N-末端。必須指出的是，不同位點的磷酸化可導致Smad2/3信號傳導功能與作用的不同。如EGF引起的Smad2/3中間子的磷酸化可阻斷其進入核與靶基因結合，而EGF引起的N末端Smad2的磷酸化可促進其進入核內引起生物學效應。最近的研究發現，在糖尿病的并發癥中，AGEs是一關鍵的介質，它可以不通過TGF-β激活Smad2和Smad3[41]。在腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞、血管內皮細胞中，AGEs5分鐘時即可激活Smad2和Smad3，30分鐘時達高峰。Smad這一快速的激活并不依賴于TGF-β，因為這時用ELISA并不能測到TGF-β，而且，用抗TGF-β抗體也不能阻抑AGEs對Smad的誘導。而且，研究發現在TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體突變的細胞中，AGEs依然可以激活Smad。其機制何在?用抗AGEs受體（RAGE）抗體和針對ERK1/2和P38特異性的MAPK抑制劑（PD98059和SB203580）可以抑制AGEs對Smad2/3的誘導，提示Smad的快速激活可能是通過ERK/P38MAPK-Smad的交互作用（crosstalk）通路。24小時后，AGEs可以通過TGF-β依賴通路激活Smad2/3。因此，如圖2-7-0-4所示，AGEs介導糖尿病并發癥的發生是直接由MAPK-Smad通路介導，間接通過經典的TGF-β-Smad信號通路。而有趣的是，ERK/P38 MAPK抑制劑可以明顯抑制AGEs誘導的Smad的激活和膠原的產生，而抗TGF-β抗體只在一定程度上起作用，這說明ERK/P38 MAPK-Smad信號通路是AGEs介導的糖尿病纖維化病理過程中的重要機制。同時，在AngⅡ誘導的高血壓動物模型中也發現ERK/P38 MAPK-Smad也參與了纖維化的過程。如圖2-7-0-4所示，在體內外的一系列實驗中，阻斷Smad通路可抑制TGF-β，AngⅡ，AGEs所致纖維化。這一發現提示，Smad可能是纖維化的最后共同通路，而Smad7是阻斷這一通路的有效治療方法。

除了ERK/P38 MAPK通路外，其他信號通路（如JAK/STAT通路、NF-κB等）也可以激活Smads。單一針對TGF-β-Smad信號通路的治療，如抗TGF-β抗體并不足以抗腎臟纖維化。因此，抗腎臟纖維化的治療還應從整個纖維化過程中細胞信號轉導通路間的網絡交互作用來進行全局的考慮。

（三）Wnt/β-catenin信號傳導通路在腎臟纖維化發生和發展中的作用

1.Wnt家族及經典Wnt信號傳導通路

Wnt基因是從小鼠乳腺癌中克隆出的一種原癌基因，最初被稱為Int基因，之后研究發現其與果蠅的wingless基因屬同源基因，因而將兩者合稱為Wnt。Wnt參與了胚胎形成時間充質組織的正常發育，提示其在成纖維細胞的生物學功能及纖維化中可能扮演重要角色。迄今為止，19種Wnt基因（Wnt1，Wnt2，Wnt2b，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt8a，Wnt8b，Wnt9a，Wnt9b，Wnt10a，Wnt10b，wnt11和Wnt16）在人、小鼠和大鼠等脊椎動物中被發現。其受體包括已發現的10種frizzled（FZD）受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白-5/6等。Wnt主要通過以下3個通路發揮作用：①經典Wnt信號途徑即Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路。②Wnt/Ca2+通路。③平面細胞極性途徑（the planar cell polarity，PCP），即Wnt/PCP通路。這其中，Wnt/β-catenin信號通路迄今為止被研究地最為透徹：當Wnt蛋白與細胞表面Frizzled（FZD）受體家族結合后，激活胞內的散亂蛋白（DSH），進而導致一種被稱為摧毀復合體（由結腸腺瘤樣息肉病蛋白APC、軸蛋白Axin、糖原合成酶激酶3β構成）中關鍵元件糖原合成酶激酶3β失活，從而抑制了β-catenin的降解使之在胞質中堆積，并進入胞核結合TCF和/或LEF調控靶基因的轉錄，調控細胞的增殖和分化。

2.Wnt/β-catenin信號傳導通路和腎臟纖維化

在多種纖維化模型中，Wnt/β-catenin受到了不同的激活。在梗阻性腎病模型中，He等[42]首次發現，除Wnt-5b，Wnt-8b，Wnt-9b外，其他Wnt亞型及FZD受體、Wnt拮抗劑的表達均明顯上調。而導入DKK-1（Wnt拮抗劑）可減少β-catenin在核內的堆積，并顯著抑制肌成纖維細胞的激活和膠原的沉積。同樣重組sFRP4蛋白（Wnt的另一個拮抗劑）也可通過下調β-catenin減輕腎臟纖維化。研究結果還顯示作為Wnt/β-catenin的靶基因，PAI-1參與了其對纖維化的調控。此外，Wnt/β-catenin在不同細胞種屬上的功能也被深入研究：條件性敲除腎小管上皮細胞上的β-catenin雖然減少了EMT的發生，卻阻斷了MMP-7對纖維細胞凋亡的誘導，因此并不能顯著減輕腎間質纖維化[43]。最新研究表明，周細胞和纖維細胞特異性過表達β-catenin可明顯增加肌成纖維細胞的數量，進而促進腎臟纖維化[44]。在多柔比星誘導足細胞損傷中，Wnt1及下游β-catenin被高度激活，促使腎小球足細胞損傷并加重蛋白尿，而使用帕立骨化醇阻斷經典Wnt/β-catenin信號通路則可起到減輕足細胞損傷、減少蛋白尿和抑制纖維化的作用。

在高糖環境下，Wnt4，Wnt5a和β-catenin明顯激活。但Wnt/β-catenin通路在糖尿病模型中的作用卻存在爭議：有研究顯示沉默DKK1或轉染Wnt4、Wnt5a和β-catenin，可以抑制系膜細胞TGF-β1、纖連蛋白的表達和糖尿病腎病中細胞外基質的沉積[44]，Wnt/β-catenin亦可以參與足細胞的黏附、分化并提高其存活率。然而，足細胞特異性的敲除β-catenin卻減輕了足細胞的功能失調和蛋白尿[45]。這些證據共同提示在糖尿病腎病中，適當的Wnt/β-catenin活性可能是維持足細胞功能的重要因素[46]。

（孟曉明　藍輝耀）

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